宏基因组二代测序在儿童重症感染中的应用价值

Abstract

目的

分析宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）在儿童重症感染性疾病中的应用价值。

方法

对2018年6月至2020年12月温州医科大学附属第二医院收治的29例重症感染患儿的临床资料及实验室检查结果进行分析。29例患儿的29份标本（外周血标本27份，胸水标本2份）进行传统病原体培养，同时送29份同类型标本进行mNGS病原体检测。

结果

29例患儿传统病原体培养阳性2例，检出病原体2株，检出率为7%（2/29）；而mNGS阳性20例，检出病原体38株，检出率为69%（20/29）。mNGS病原体检出率高于传统病原体培养（Ｐ<0.05），并且能检出传统培养法难以检出的病毒、真菌及其他特殊病原体，如羌虫病东方体。单因素分析显示，性别、血常规、C-反应蛋白、降钙素原、D-二聚体、影像学检查结果，以及入院前是否使用抗生素不会影响mNGS的检测结果（Ｐ>0.05）。

结论

mNGS比传统病原体培养更灵敏且干扰因素少，能够有效检出传统病原体培养阴性病例的病原体，可为儿童重症感染性疾病的病原学诊断提供有力帮助。

感染性疾病常见的病原体为细菌、病毒、真菌、支原体、衣原体等，它们通过多种途径进入机体引发炎症反应。儿童作为特殊群体，免疫系统发育不成熟，容易感染各种病原体，感染性疾病为儿童死亡的主要原因^［1-2］。临床上对重症感染性疾病的病原学诊断通常依赖传统病原体培养，但该法培养阳性率低，受限于入院前是否使用过抗生素且对病毒和结核分枝杆菌等特殊病原体培养困难。因此，急需一种高灵敏度、高特异度、快速的儿童感染性疾病病原体的检测方法。

宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）是利用高通量测序技术及生物信息分析技术对样品中的核酸进行测序分析，利用微生物专用数据库进行比对分析，检出致病微生物，辅助临床诊疗决策^［3］。mNGS已逐步应用于感染性疾病的诊断。目前mNGS报道多以成人为主，涉及儿童的不多^［4-7］。已有的研究表明，伴发热的血流感染患儿中mNGS的检测阳性率显著高于传统血培养，可以作为儿童伴发热的血流感染临床诊治的辅助手段^［4］。在儿童重症肺炎的诊治中，因为mNGS极高的灵敏度，可提高临床上病原学诊断率^［5］。mNGS能克服传统微生物标本检出率低的困难，对尤其是结核、真菌、病毒及特殊病原体等的检出具有诊断优势^［6-7］。所以临床诊疗过程中使用mNGS可以提高诊疗水平，促进抗生素的规范化使用，提高重症感染患儿的治愈率。本研究对我院儿童重症监护室收治的29例重症感染性疾病患儿的临床资料进行回顾性分析，探讨mNGS在病原体检测及指导诊疗方面的临床应用价值，并分析影响其检出率的因素，现将结果报道如下。

1. 资料与方法

1.1. 研究对象

选取我院2018年6月至2020年12月儿童重症监护室收治的重症感染性疾病患儿29例。患儿均符合重症感染诊断标准：（1）脓毒症相关器官衰竭评分（Sepsis-Related Organ Failure Assessment）较基线上升≥２分；或（2）符合快速脓毒症相关器官衰竭评分（Quick Sepsis-Related Organ Failure Assessment）中呼吸频率≥22次/min、意识改变、收缩压≤100 mm Hg（100 mm Hg=0.133 kPa）至少2项者^［8］。29例患儿的29份标本（外周血标本27份，胸水标本2份）进行传统病原体培养；同时送另外29份标本（外周血标本27份，胸水标本2份）进行mNGS病原体检测。该研究通过医院伦理委员会批准（2021-K-326-01），并获得家长知情同意。

1.2. 样本处理和DNA提取

全血样本以4 178 r/min离心10 min后取300 μL血浆。使用TIANamp Micro DNA试剂盒（DP316，北京天根生化科技有限公司），根据试剂盒说明书提取DNA；胸水样本取600 μL经玻璃珠混合震荡后，使用TIANamp Micro DNA试剂盒（DP316，北京天根生化科技有限公司），根据试剂盒说明书提取DNA。提取的DNA用作DNA文库构建^［9］。

1.3. 文库构建和测序

使用Agilent 2100 Bioanalyzer质控文库插入片段大小，使用Qubit dsDNA HS试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国）质控DNA文库浓度，经环化形成单链环形结构。环化后的文库经滚环复制生成DNB纳米球。制备好的DNB纳米球加载到测序芯片，使用BGISEQ-50/MGISEQ-200/MGISEQ-2000进行测序^［10］。

1.4. 数据分析

测序数据下机后去除低质量的和长度小于35 bp的数据以获得高质量数据。通过BWA（http://bio-bwa.sourceforge.net/）比对将高质量数据中人参考基因组序列的数据去除^［11］。剩下的数据再去除低复杂度读长（reads，最低检测限是100 copies/mL）后与专用细菌（6 350种）、真菌（1 064种）、病毒（4 945种）、寄生虫（234种）4个微生物大数据库（深圳华大基因自建数据库）比对，获得能够匹配到某种病原体的序列数，根据序列数的高低及临床其他检测来判断可能的病原体。本研究设定样本中微生物核酸的最低检测限是100 copies/mL，低拷贝数微生物一律不纳入致病微生物范围，对于拷贝数大于最低检测限的微生物检测特异性大于99%，重复性大于99%。

1.5. 收集资料

收集患儿的mNGS结果和临床资料，包括性别、年龄、白细胞计数［正常值（4~10）×10⁹/L］、血小板计数［正常值（100~300）×10⁹/L）］、C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）（正常值≤8 mg/L）、降钙素原（procalcitonin，PCT）（正常值≤0.5 ng/mL）、D-二聚体（正常值≤0.5 μg/mL）、病原体培养结果、肺部影像学检查结果、入院前使用抗生素及临床转归等情况^［12-16］。

1.6. 统计学分析

应用统计软件SPSS 20.0处理数据。偏态分布计量资料以中位数（四分位数间距）［M（P ₂₅，P ₇₅）］表示；计数资料以例数、百分率（%）或构成比（%）表示，率的比较采用卡方检验或Fisher确切概率法。Ｐ<0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 临床特征

29例重症感染性疾病患儿中，男性15例（52%），中位年龄为3.0（2.0，7.0）岁；女性14例（48%），中位年龄为3.5（2.0，6.0）岁。6例（21%）患儿有基础疾病（结缔组织病2例，21三体综合征合并先天性心脏病术后1例，心血管疾病2例，肝脏疾病1例），23例（76%）无基础疾病，其中1例（3%）患儿有流行病学因素（浙江丽水龙泉人，就诊于冬季，当地野鼠繁殖季节）。

2.2. 血液和胸部影像学检查结果

29例患儿中，白细胞计数低于正常值6例（21%），高于正常值13例（45%）；血小板计数低于正常值6例（21%），高于正常值14例（48%）；CRP高于正常值20例（69%）。26例完成PCT检测，高于正常值16例（62%）。24例完成D-二聚体检测，高于正常值23例（96%）。27例完成胸部X线片或CT检查，提示肺部单侧或双侧出现炎症改变26例（96%）。

2.3. 传统病原体培养和mNGS结果情况

29例患儿的29份标本进行传统病原体培养，2例（7%）患儿检出2株病原体，其中表皮葡萄球菌1株，热带假丝酵母菌1株。29例患儿mNGS送检29份标本，20例（69%）患儿有阳性结果，共检出病原体38株，其中病毒占45%（17/38），细菌占42%（16/38），真菌占8%（3/38），其他占5%（2/38），见表1。

表1.

29例患儿mNGS检出38株病原体的情况

病原体	检出株数	构成比 (%)
总计 (株数)	38	100
病毒	17	45
细环病毒	2	5
人类疱疹病毒4型	6	16
人类腺病毒7型	3	8
人类哺乳动物腺病毒E型	1	3
人腺病毒21型	1	3
人类α疱疹病毒1型	1	3
人类疱疹病毒5型	3	8
细菌	16	42
表皮葡萄球菌	1	3
结核分枝杆菌	1	3
奥斯陆莫拉菌	1	3
肺炎链球菌	2	5
副流感嗜血菌	1	3
假肺炎链球菌	1	3
普氏厌氧球菌	1	3
解乳糖厌氧球菌	1	3
考克斯嗜胨菌	1	3
黑尔嗜胨菌	1	3
咽峡炎链球菌	1	3
大芬戈尔德菌	1	3
泌尿生殖道放线菌	1	3
格雷文尼放线菌	1	3
阴道加德纳菌	1	3
真菌	3	8
曲霉菌	2	5
耶氏肺孢子菌	1	3
其他	2	5
羌虫病东方体	2	5

29例患儿经传统病原体培养和mNGS明确诊断，25例最终治愈出院，救治成功率达86%；4例（14%）因起病急，病情重，最终救治无效死亡。

2.4. 传统病原体培养和mNGS检出率比较

mNGS病原体检出率高于传统病原体培养［69%（20/29）vs 7%（2/29）， ${\chi }^{\mathrm{2}}$ =23.727，P<0.001］。送检的54份外周血标本中，mNGS病原体检出率高于传统病原体培养（P<0.05），见表2。

表2.

外周血标本传统病原体培养与mNGS病原体检出率比较 ［例（%）］

组别	标本数	阳性标本数	阴性标本数
传统病原体培养	27	2(7)	25(93)
mNGS	27	18(67)	9(33)
${\chi }^2$ 值		20.329
P值		<0.001

注：［mNGS］宏基因组二代测序。

2.5. 影响mNGS 检出率的单因素分析

mNGS阳性组和mNGS阴性组性别、白细胞计数、血小板计数、CRP、PCT、D-二聚体、肺部影像学，以及入院前使用抗生素情况差异均无统计学意义（Ｐ>0.05），见表3。

表3.

影响mNGS检出率的单因素分析 ［例（%）］

影响因素	mNGS阴性组 (n=9)	mNGS阳性组 (n=20)	P值
性别
男	5(56)	10(50)	0.782
女	4(44)	10(50)
白细胞计数
>10×109/L	5(56)	8(40)	1.000
≤10×109/L	4(44)	12(60)
血小板计数
<100×109/L或 >300×109/L	5(56)	15(75)	0.396
(100~300)×109/L	4(44)	5(25)
CRP
>8 mg/L	6(67)	14(70)	1.000
≤8 mg/L	3(33)	6(30)
PCT*
>0.5 ng/mL	4(50)	12(67)	0.664
≤0.5 ng/mL	4(50)	6(33)
D-二聚体&
>0.5 μg/mL	3(75)	20(100)	0.167
≤0.5 μg/mL	1(25)	0(0)
肺部影像学是否提示单肺炎性病灶#
是	1(12)	0(0)	0.296
否	7(88)	19(100)
肺部影像学是否提示两肺炎性病灶#
是	8(100)	17(89)	1.000
否	0(0)	2(11)
入院前使用抗生素情况
是	6(67)	17(85)	0.339
否	3(33)	3(15)

注：［mNGS］宏基因组二代测序；［CRP］C-反应蛋白；［PCT］降钙素原。*示3例患儿没有检查PCT；&示5例患儿没有检查D-二聚体；#示2例患儿没有进行肺部影像学检查。

3. 讨论

由于病原体的多样性、复杂性和抗生素的不规范使用，导致临床尤其是儿童危重症感染性疾病的诊断和药物选择难度大大增加。目前临床上有很大一部分重症感染患儿临床症状重，而多次传统病原体检测结果为阴性，所以急需要1种检测手段辅助传统病原体检测方法，辅助临床诊治。在感染性疾病的相关临床研究中，mNGS检出率和灵敏度高于传统病原体培养^［17-19］。如在关节假体周围感染的病原体检出中，对比传统病原体培养，mNGS可以提高病原体检出率^［20］。在诊断周围型肺部感染性病变方面，mNGS灵敏度更高，能够有效检出传统病原体培养阴性病例的病原体^［21］。因此，mNGS可以克服临床抗生素不规范使用的局限性，并且该技术灵敏度高，信息量大，我国已发布其在临床急危重症感染性疾病诊疗方面的专家共识^［3］。

本研究29例患儿中，6例有基础疾病。通常有基础疾病的患儿在出现感染时易发生特殊病原体感染，该类患儿往往发病急，感染症状重，常规广谱抗生素起效难，给临床诊断和治疗带来极大的困难和挑战。因此，对临床重症感染性疾病合并基础疾病的患儿尽早找到病原体并予针对性治疗意义重大。本研究发现mNGS对儿童重症感染的病原体，尤其是细菌以外的病原体，如病毒、真菌，以及其他特殊病原体的检出率明显高于传统病原体培养，与Greninger^［22］研究结果类似。本研究中，mNGS检出特殊病原体——恙虫病东方体（立克次体科恙虫病东方体属）2株，该病原体引起的恙虫病是一种自然疫源性急性传染病，临床表现通常无特异性，易漏诊及误诊，会导致各脏器不同程度的损害^［23-24］。大芬戈尔德菌、嗜胨菌、普氏厌氧球菌、解乳糖厌氧球菌均属于革兰阳性厌氧球菌，对营养要求高，传统病原体培养中很难发现^［25-26］，早期进行针对性药物治疗可改善预后。本研究通过mNGS检出放线菌2株。放线菌需要在厌氧或微需氧环境培养，对临床培养标本的接种时间要求严格，需要床边接种^［27-28］。mNGS直接从体液标本中提取DNA/RNA，取得送检样本中的生物基因信息，再与生物信息数据库比对，获得感染性疾病的病原体信息，对传统检测要求严格的病原体检出率更高^［29-30］。研究表明从基因组层面，mNGS为结核分枝杆菌检测的重要方法，为其诊断提供依据^［31］。同样，本研究1例结核分枝杆菌感染患儿是通过mNGS明确诊断。因此，mNGS为感染病原体的明确带来极大的帮助，特别是大大提高传统病原体培养难以培养出致病微生物尤其是病毒及特殊病原体的检出率。

单因素分析显示，性别、白细胞计数、血小板计数、CRP、PCT、D-二聚体、影像学结果、入院前是否使用抗生素不会影响mNGS对病原体的检出率。本研究中血培养阴性而mNGS阳性的12例细菌感染患儿，均在抽血前使用过抗生素，所以在入院前或者不明原因感染检查前已经使用抗生素的患儿，mNGS对病原体的检测更有优势。这与成人感染性疾病的临床相关研究^［32］结果一致。有研究^［33］发现，mNGS在中枢神经系统感染性疾病病原体诊断方面优于传统病原体检测，提示该技术对重症感染具有优势。

本研究29例重症感染患儿25例最终治愈出院，救治成功率达86%。这与及时的mNGS应用有密切关系。在临床上，对于感染患儿我们通常是先经验治疗，但是我们现在可以通过mNGS检测后根据反馈的报告，及时改变诊治方法，进行针对性抗感染治疗。与此同时，mNGS能够改善临床抗生素滥用、误用的情况。

综上所述，儿童重症感染性疾病疑难杂症较多，诊断难度大，广谱抗生素的长期使用效果差且易导致耐药菌的产生。虽然mNGS费用较高，但在临床危重症诊疗中尤其对于传统病原体培养阴性而临床感染诊断不明的患儿，该检测方法可扩大检出范围尤其是病毒及其他特殊病原体，提高检出率，为早期临床诊疗、有效避免病情进展提供有力的帮助。此外，很多重症感染患儿存在混合感染，临床医生能够根据mNGS检出病原体序列明确病原体，采取更为完善的联合治疗。

利益冲突声明

所有作者均声明不存在利益冲突。