Abstract
目的
探讨RAS基因在儿童急性淋巴细胞白血病中的突变率及其临床意义。
方法
回顾性收集2015年1月至2020年1月于郑州大学第三附属医院收治的新确诊且完成二代测序的急性淋巴细胞白血病120例患儿病例资料，分析其临床及分子学特征，以及RAS基因突变对急性淋巴细胞白血病患儿总生存率的影响。
结果
120例患儿中，共有35例（29.2%）患儿伴有RAS基因突变，其中仅KRAS基因突变30例（25.0%），NRAS基因突变伴KRAS基因突变5例（4.2%）。全部NRAS基因突变及71%（25/35）KRAS基因突变位于第12、13号密码子。RAS基因突变在急性B淋巴细胞白血病中检出率为33.3%（35/105），未在急性T淋巴细胞白血病中检出。失访11例（9.2%），随访109例患儿中死亡16例（14.7%）。RAS基因突变患儿的2年总生存率低于RAS基因阴性患儿（P<0.05）。伴RAS基因突变急性淋巴细胞白血病患儿合并WT1基因过表达、初诊白细胞数计数>50×109/L时，预后更差（P<0.05）。
结论
RAS基因突变多发生于急性B淋巴细胞白血病，对预后有不良影响。
Keywords: 急性淋巴细胞白血病, RAS基因, 突变, 预后, 儿童
Abstract
Objective
To investigate the mutation rate of the RAS gene and its clinical significance in children with acute lymphoblastic leukemia.
Methods
A retrospective analysis was performed on the medical data of 120 children with newly diagnosed acute lymphoblastic leukemia, who were admitted to the Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University from January 2015 to January 2020 and underwent next-generation sequencing. The clinical and molecular features were analyzed. The impact of RAS gene mutation on the overall survival rate was evaluated in these children.
Results
Among the 120 children, 35 (29.2%) had RAS gene mutation, 30 (25.0%) had KRAS gene mutation, and 5 (4.2%) had both NRAS and KRAS gene mutations. All NRAS mutations and 71% (25/35) of KRAS mutations were located at the 12th and 13th codons. RAS gene mutation was detected in 35 (33.3%) out of 105 children with B-lineage acute lymphoblastic leukemia, but it was not detected in those with acute T lymphocyte leukemia. Of all the children, 11 (9.2%) were lost to follow-up, and among the 109 children followed up, 16 (14.7%) died. The children with RAS gene mutation had a significantly lower 2-year overall survival rate than those without RAS gene mutation (P<0.05). The prognosis of children with RAS gene mutation combined with WT1 overexpression and WBC>50×109/L at diagnosis was worse (P<0.05).
Conclusions
RAS gene mutation is commonly observed in children with B-lineage acute lymphoblastic leukemia and may have an adverse effect on prognosis.
Keywords: Acute lymphoblastic leukemia, RAS gene, Mutation, Prognosis, Child
RAS信号通路控制着细胞增殖、分化与凋亡，当RAS基因突变时，细胞非依赖性增殖，转变为癌细胞［1-2］。RAS基因编码RAS蛋白，RAS蛋白分别与二磷酸鸟苷（guanosine diphosphate，GDP）、三磷酸鸟苷（guanosine triohosphate，GTP）结合，将促进生长的信号从细胞膜传递到细胞核，起到细胞“开关”的作用。生理情况下，鸟嘌呤核苷酸交换因子促进GDP向GTP转换，激活下游通路，使细胞增殖。GTP酶激活蛋白（GTPase-activating protein，GAP）可提高RAS蛋白的内在GTP酶活性，促进GTP水解为GDP。通过GAP引起的RAS活性失活是RAS等位基因致癌突变中最常见的体细胞突变靶点。RAS基因位点G61的致癌突变降低了RAS蛋白的内在GTP酶活性，而位点G12、G13通过空间位阻阻碍RAS与GAP之间形成范德华键，从而降低GTP水解水平［3-5］。近年来，随着基因测序技术日益精进，RAS基因得到越来越多的关注，如RAS基因突变常作为亚克隆发生在骨髓增生异常综合征疾病晚期；骨髓纤维化疾病中，RAS基因突变常与外周血单核细胞水平升高、血小板计数减低、骨髓原始细胞比例升高等有关，影响该病的总生存（overall survival，OS）率［6-7］。既往研究表明，在急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）患儿中，RAS基因突变与药物反应差、低无病生存率、高复发风险有关［8-9］。本研究使用二代测序方法，分析了ALL中RAS基因突变患儿的临床特征和实验室检查，及其对OS率的影响。
1. 资料与方法
1.1. 研究对象
回顾性收集2015年1月至2020年1月就诊于郑州大学第三附属医院并完成二代测序的初治ALL患儿120例的临床资料，其中男性65例（54.2%），女性55例（45.8%）。急性B淋巴细胞白血病（acute B lymphoblastic leukemia，B-ALL）105例，急性T淋巴细胞白血病（acute T lymphoblastic leukemia，T-ALL）15例。根据是否存在RAS基因突变分为RAS基因突变组和RAS基因阴性组。
1.2. RAS基因突变的检测
采集初治ALL患儿2 mL骨髓标本，用二代测序法检测RAS基因全外显子序列的单核苷酸变异、小片段插入/缺失，平均测序深度为2 000×，测序后原始数据进行生物信息学分析，筛选致病性基因突变位点。
1.3. 免疫学分型
将患儿2 mL骨髓样本放入流式细胞仪中，设门分析异常细胞，应用单克隆抗体对白血病细胞表面抗原进行标记，根据免疫学标志进行分型。
1.4. 染色体核型分析
取患儿2 mL骨髓标本放入肝素抗凝管中，进行植物血凝素短期培养后立即制片，收集有丝分裂的骨髓中期细胞，行吉姆萨染色并显带分析，放入染色体分析仪中，分析并描述染色体核型。
1.5. 融合基因检测
取患儿2 mL骨髓标本，放入EDTA-K2抗凝管中，TRIzol法提取有核细胞RNA，使用基因扩增仪（杭州博日Life Pro扩增仪）、科研用ALL融合基因检测试剂盒（美国OMEGA公司生产），在多重巢式RT-PCR技术下，检测常见的15种融合基因，包括：MLL/AF4、SIL/TAL1、ETV6/RUNX1、dupMLL、MLL/ENT、E2A/PBX1、SET/CAN、BCR/ABL、TLS/ERG、E2A/HLF、CALM/AF10、HOX11L2、HOX11、MLL/AF10、NPM/ALK。
1.6. 随访
随访截止时间为2021年4月30日，通过住院病历、门诊病历和电话获得患儿情况。OS期指自诊断日期至死亡或随访截止日期。
1.7. 统计学分析
采用SPSS 26.0软件完成统计学分析。非正态分布计量资料采用中位数（四分位数间距）［M（P 25，P 75）］表示，组间比较采用Wilcoxon秩和检验；计数资料采用例数和百分率（%）表示，率的比较采用卡方检验或Fisher确切概率法。生存分析用Kaplan-Meier法，采用log-rank法进行单因素分析，将单因素分析中P<0.1的影响因素纳入Cox风险比例回归模型进行多因素分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. RAS基因突变情况
120例ALL患儿中，RAS基因突变35例（29.2%），其中仅KRAS基因突变30例（25.0%），NRAS基因突变伴KRAS基因突变5例（4.2%）。RAS基因突变在B-ALL患儿中检出率为33.3%（35/105），未在T-ALL患儿中检出。全部（5/5）NRAS基因突变和57%（20/35）KRAS基因突变均发生于第12号密码子上，14%（5/35）KRAS基因突变发生于第13号密码子上，29%（10/35）KRAS基因突变发生于其他密码子上，未发现第61号密码子突变。
2.2. RAS基因突变组和RAS基因阴性组临床特征比较
RAS基因突变组与RAS基因阴性组在性别、诊断年龄、危险度分型、髓外浸润等方面差异均无统计学意义（P>0.05）。RAS基因突变组B-ALL比例、染色体核型异常比例高于RAS基因阴性组，初诊白细胞数计数低于RAS基因阴性组（P<0.05）。见表1。
表1.
RAS基因突变组和RAS基因阴性组临床特征比较
| 项目 | RAS基因阴性组(n=85) | RAS基因突变组(n=35) | /Z值 | P值 |
|---|---|---|---|---|
| 性别 [例(%)] | ||||
| 男 | 45(53) | 20(57) | 0.176 | 0.675 |
| 女 | 40(47) | 15(43) | ||
| 诊断年龄 [M(P 25, P 75), 岁] | 6.8(3.0, 8.0) | 5.5(2.5, 6.1) | 1.296 | 0.195 |
| 免疫分型 [例(%)] | ||||
| B-ALL | 70(82) | 35(100) | 5.538 | 0.019 |
| T-ALL | 15(18) | 0(0) | ||
| 危险度分型 [例(%)] | ||||
| 低危 | 33(39) | 18(51) | 2.717 | 0.257 |
| 中危 | 38(45) | 10(29) | ||
| 高危 | 14(16) | 7(20) | ||
| 染色体核型 [例(%)]* | ||||
| 正常 | 70(82) | 19(56) | 9.025 | 0.003 |
| 异常 | 15(18) | 15(44) | ||
| t(9,22) | 5(33) | 5(33) | 7.614 | 0.052 |
| 近二倍体 | 0(0) | 8(53) | ||
| 高超二倍体 | 5(33) | 4(27) | ||
| 其他位移突变 | 5(33) | 5(33) | ||
| 髓外浸润 [例(%)] | ||||
| 无 | 40(47) | 14(40) | 0.499 | 0.480 |
| 有 | 45(53) | 21(60) | ||
|
初诊白细胞计数 [M(P 25, P 75), ×109/L] |
60.0(6.1, 125.4) | 14.5(5.7, 30.0) | 2.321 | 0.020 |
注：［B-ALL］急性B淋巴细胞白血病；［T-ALL］急性T淋巴细胞白血病。*示RAS基因突变组1例未做染色体核型检测，染色体核型异常患儿可同时存在多种类型。
2.3. 伴RAS基因突变ALL患儿预后的影响因素分析
中位随访时间为18（9，35）个月，失访11例（9.2%）。随访109例ALL患儿中，死亡16例（14.7%）；5例（4.6%）患儿有中枢神经系统复发，其中伴RAS基因突变1例。RAS基因突变患儿2年OS率为54%±13%，低于RAS基因阴性患儿（89%±4%， =5.422，P=0.020）（图1）。35例RAS基因突变患儿中位随访时间17.5（7.5，24.8）个月，失访9例。随访26例患儿中，死亡7例（27%），1例（4%）出现中枢神经系统复发。单因素分析显示，WT1基因过表达、初诊白细胞计数可影响伴RAS基因突变ALL患儿的预后（P<0.05），见表2。
图1. 伴RAS基因突变ALL患儿的生存曲线.
表2.
影响伴RAS基因突变ALL患儿预后的单因素分析
| 影响因素 | 例数 | 2年OS率 (95%CI) | 值 | P值 |
|---|---|---|---|---|
| WT1基因 | ||||
| 过表达 | 3 | 0% | 14.536 | <0.001 |
| 正常表达 | 23 | 61%±14% | ||
| 性别 | ||||
| 男 | 18 | 64%±15% | 0.382 | 0.536 |
| 女 | 8 | 40%±22% | ||
| 诊断年龄 | ||||
| <1岁或>10岁 | 3 | 0% | 0.806 | 0.369 |
| 1~10岁 | 23 | 62%±14% | ||
| 危险度分型 | ||||
| 低危 | 12 | 57%±19% | 2.282 | 0.319 |
| 中危 | 9 | 43%±22% | ||
| 高危 | 5 | 67%±27% | ||
| 染色体核型* | ||||
| 正常 | 13 | 47%±17% | 0.671 | 0.413 |
| 异常 | 12 | 80%±18% | ||
| 髓外浸润 | ||||
| 无 | 9 | 86%±12% | 2.680 | 0.102 |
| 有 | 17 | 24%±19% | ||
| 初诊白细胞计数 | ||||
| ≤50×109/L | 22 | 74%±13% | 9.579 | 0.002 |
| >50×109/L | 4 | 0% |
注：*示RAS基因突变组1例未做染色体核型检测。
将单因素分析中P<0.1的影响因素纳入Cox风险比例回归模型进行多因素分析显示，WT1基因过表达、初诊白细胞计数>50×109/L为伴RAS基因突变ALL患儿预后不良的影响因素（P<0.05），见表3。
表3.
影响伴RAS基因突变ALL患儿预后因素的Cox风险比例回归模型分析
| 影响因素 | 赋值 | B | SE | Wald | HR(95%CI) | P |
|---|---|---|---|---|---|---|
| WT1基因 | 正常表达=0，过表达=1 | 3.772 | 1.412 | 7.139 | 43.466(2.732~691.604) | 0.008 |
| 初诊白细胞计数 | ≤50×109/L=0，>50×109/L=1 | 2.335 | 0.884 | 6.985 | 10.333(1.828~58.402) | 0.008 |
3. 讨论
RAS基因可分为3种：NRAS、KRAS、HRAS基因。Wiemels等［10］的研究中，RAS基因在191例ALL患儿中的检出率为20%。有报道称NRAS基因突变较常见，发生率为6%［8］。RAS基因点突变多见于第12、13、61号密码子［8，11］。本研究中仅KRAS基因突变检出率25.0%（30/120），NRAS基因突变检出率4.2%（5/120），多于第12、13号密码子发生点突变，与上述研究基本相符。
本研究中B-ALL患儿RAS基因突变率高于T-ALL患儿，和Wiemels等［12］研究基本一致，但另一项研究表明RAS基因突变率在B-ALL和T-ALL中无差异［10］。也有研究证实RAS基因突变在早期前体T-ALL中达到三分之二以上，而在非早期前体T-ALL中只有19%［13］。本研究并未在T-ALL中检出RAS基因突变。结果不一致的原因可能有：（1）患儿构成有差异；（2）样本量限制；（3）检测方法不同。既往研究表明，RAS基因突变患儿高危分型比例高于RAS基因未突变患儿［14］，本研究中未得出有差异的结果。英国一项小规模研究纳入86例ALL患儿，结果显示，RAS基因突变与初诊白细胞计数较高等相关［15］。本研究中RAS基因突变患儿初诊白细胞数未明显升高，可能与患儿构成差异造成数据结果偏倚有关。我们分析初诊白细胞计数升高原因可能为：与其他正常儿童细胞相比，RAS基因在外周血白细胞、淋巴细胞和骨髓细胞中相对活化［16］。在超二倍体亚组中，RAS基因突变组的初诊白细胞计数高于RAS基因阴性组；在非超二倍体亚组中，RAS基因突变与初诊白细胞计数无关，这表明RAS基因和高超二倍体之间有极其强烈的关联［12］。Holmfeldt等［17］研究表明，ALL患者中，三分之二以上的单倍体患儿存在RAS基因突变，低亚二倍体和近二倍体患儿则较少发生RAS基因突变。本研究中，RAS基因突变患儿染色体核型多正常。造成结果不同的原因可能是不同队列的患儿构成比不同。
迄今所报道的RAS基因对预后的影响，尚存争议。美国一项纳入870例ALL患者的研究显示，RAS基因突变对无事件生存率、无病生存率或OS率无影响 ［11］。Zhang等［18］和Irving等［19］研究指出RAS基因突变常与ALL复发有关。但Case等［15］研究表明，儿童ALL诊断和复发时RAS基因突变率相似，意味着RAS基因突变不是ALL复发的危险因素。本研究得出，RAS基因突变可影响ALL患儿的OS率。伴RAS基因突变ALL患儿合并WT1基因过表达、初诊白细胞数计数>50×109/L时，预后更差。我们分析RAS基因突变影响预后的原因可能有：（1）RAS基因突变多与预后不良基因变异（IKZF1基因缺失、TP53基因突变、FLT3基因突变等）同时发生；（2）RAS基因突变在复发时常见；（3）RAS基因突变患儿对化疗药物耐药。既往研究已证实，伴RAS基因突变的患儿在体外对糖皮质激素的抵抗力更强［20］。在存活率更低的KRAS基因突变细胞中，对长春新碱治疗的敏感性可重复增加，相反，KRAS基因突变细胞对甲氨蝶呤有抗药性，且双KRAS基因密码子点突变的表达比单一KRAS基因密码子点突变的表达诱导了更高水平的MAPK磷酸化和更强的甲氨蝶呤抗药性，所以，MEK抑制剂等相关药物得到了越来越多的关注［21］。
综上所述，本研究表明RAS基因突变患儿多是B-ALL，初诊白细胞计数无明显升高，对化疗药物可能出现耐药性，预后不良。在患儿初治时即完善相关基因突变检查，明确有无RAS基因突变，对是否服用相关激酶抑制剂药物有一定指导意义。但本研究结果仍需要大样本多中心研究进一步证实。
参 考 文 献
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