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. 2022 Feb 20;42(2):256–262. [Article in Chinese] doi: 10.12122/j.issn.1673-4254.2022.02.13

抑制铁死亡可减轻脓毒症小鼠的心肌损伤：脂钙蛋白-2的作用

Inhibiting ferroptosis attenuates myocardial injury in septic mice: the role of lipocalin-2

黄 毓慧 1, 张 共鹏 2, 梁 欢 1, 曹 珍珍 3, 叶 红伟 1, 高 琴 1,*
PMCID: PMC8983367  PMID: 35365451

Abstract

目的

观察铁死亡在盲肠结扎与穿孔（CLP）法诱导的脓毒症小鼠心肌损伤中的作用，并探讨脂钙蛋白-2（Lcn2）在铁死亡中的可能作用。

方法

选取8周龄雄性C57BL/6小鼠，采用CLP法诱导脓毒症心肌损伤模型。小鼠随机分为3组（10只/组）：假手术组、脓毒症组（CLP，小鼠接受CLP手术）、脓毒症+铁死亡抑制剂Ferrostain-1组（CLP+Fer-1，小鼠腹腔注射浓度为5 mg/mL的Fer-1 5 mg/kg，1 h后接受CLP手术）。各组小鼠术后24 h通过超声心动图检测小鼠心功能。H & E染色观察心肌损伤，透射电镜观察心肌纤维细微结构和线粒体的变化；ELISA法测定血清中炎症因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平；组织铁试剂盒测定心肌组织铁含量的变化；Western blot法检测心肌组织中Lcn2蛋白和铁死亡相关蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和铁死亡抑制蛋白1（FSP1）的表达变化。

结果

与假手术组相比，CLP术后24 h，脓毒症小鼠心脏收缩与舒张功能减弱，左心室射血分数（LVEF%）、左心室缩短分数（LVFS%）和左心室舒张末期内径（LVIDd）降低（P < 0.05）；左心室收缩期末期内径（LVIDs）升高（P < 0.05）。与CLP组相比，CLP+铁死亡抑制剂Fer-1组LVEF%、LVFS%和LVIDd升高（P < 0.05）；LVIDs降低（P < 0.05）。光镜下观察到CLP小鼠心肌纤维排列不整齐，部分变性，有炎症细胞浸润，间质水肿，横纹模糊，红细胞渗出。透射电镜观察到部分线粒体嵴减少，外膜破裂，部分线粒体变小，膜密度增高。CLP+Fer-1组小鼠心肌形态学有改善，线粒体损伤减轻。与假手术组相比，CLP组血清TNF-α水平、心肌组织铁含量、Lcn2蛋白表达升高（P < 0.01），GPX4、FSP1蛋白表达降低（P < 0.01）。与CLP组相比，CLP+Fer-1组血清TNF-α水平、心肌组织铁含量、和Lcn2蛋白表达降低（P < 0.05）；GPX4、FSP1蛋白表达升高（P < 0.05）。

结论

来源于GPX4、FSP1不同途径的铁死亡参与CLP引起的脓毒症性心肌损伤的发生，抑制铁死亡可减轻脓毒症心肌损伤，Lcn2可能参与其中。

Keywords: 脓毒症, 心肌损伤, 铁死亡, ferrostatin-1, 脂钙蛋白-2

脓毒症全球死亡率为10%，中国每年约有500万脓毒症患者，死亡率超过30%[1, 2]。心肌功能损伤是脓毒症住院患者中常见并发症[3]，脓毒症引起的心功能不全是脓毒症死亡率高的主要原因[4]，但其确切机制尚不完全清楚。铁死亡最早被观察到铁离子螯合剂能抑制Erastin诱导的癌细胞死亡不同于已知的细胞死亡途径，如凋亡、焦亡和坏死[5]。铁死亡的机制主要涉及脂质过氧化物增加和脂质活性氧的进一步释放。当谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）或谷胱甘肽活性降低时，可诱导铁死亡的发生[6]。研究表明，机体内氧化还原状态的平衡受FSP1- NAD(P)H- CoQ10轴的调节，与经典的GPX4通路协同抑制脂质过氧化和铁死亡[7, 8]。已有研究表明，铁死亡抑制蛋白1（FSP1）在多个癌细胞系中具有铁死亡抗性，阐明了一个新的抗癌靶点[7-9]。

铁死亡已被证实参与到各种病理过程，包括神经毒性、急性肾功能衰竭、肝损伤、心脏病、以及脓毒症等[10, 11]。然而，其在脓毒症心脏损伤中的作用机制尚未研究清楚，FSP1介导的铁死亡是否参与其中亦尚未被阐述。

脂钙蛋白-2（Lcn2）与明胶酶基质金属蛋白酶9活动有关[12]。Lcn2参与先天免疫，可诱导多种趋化因子参与炎症反应，在多种生物过程发挥作用，包括隔离含铁细菌的铁载体，参与哺乳动物铁代谢、氧化应激等[13, 14]。有研究报道在脓毒症动物模型中，Lcn2在肝脏和肺脏中被强烈诱导，并持续存在[15]。临床和动物实验中已证实Lcn2可作为早期肾损伤的生物标志物[16]，心力衰竭时观察到Lcn2在血清和心肌中表达升高[17]。Lcn2作为参与细胞铁代谢机制的关键因素之一亦参与心肌组织铁的代谢[18]。铁代谢异常导致细胞内铁超载时，过量的铁通过Fenton和Haber-Weiss等联级反应产生脂质过氧化物，诱导铁死亡的发生[19]。LPS诱导新生小鼠急性呼吸窘迫症和人支气管上皮细胞损伤中，Lcn2表达增高，铁含量增高，GPX4表达降低；沉默Lcn2降低了铁含量，抑制了铁死亡引起的的炎症发应和氧化应激损伤[20]，但Lcn2在脓毒症诱导的心肌损伤中如何表达，是否参与介导铁死亡的发生目前尚未见报道。

因此，本研究旨在研究盲肠结扎与穿孔（CLP）诱导的小鼠脓毒症心肌损伤变化，并采用铁死亡特异性抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）分析脓毒症心肌损伤中是否发生铁死亡，进一步探讨Lcn2在铁死亡中的可能作用。

1. 材料和方法

1.1. 仪器与试剂

异氟烷（EZVET）；水合三氯乙醛（上海麦克林生物医药有限公司）；小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试剂盒（CUSABIO）；组织铁测定试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；Ferrostatin-1（sigma）；BCA试剂盒（碧云天）；兔抗小鼠GPX4抗体（Abcam）；山羊抗小鼠Lcn2抗体（R & D systems）；兔抗小鼠FSP1抗体（Proteintech）；兔抗小鼠GAPDH抗体（Absin）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（Biosharp）和兔抗山羊二抗（博士德）。

1.2. 实验动物

8周龄SPF级雄性C57BL/6J雄性小鼠30只（体质量18~22 g）（河南斯克贝斯生物科技股份有限公司）。本研究经动物伦理委员会许可，动物的护理和处理严格遵守《实验动物管理条例》进行。

1.3. 小鼠CLP术脓毒症模型建立及分组

小鼠随机分为3个实验组，10只/组。CLP组小鼠手术前12 h禁食不禁水。腹腔注射8%水合氯醛（0.1 mL/20 g）麻醉小鼠，腹部做纵向切口，依次剪开小鼠皮肤、腹肌进入腹腔。剪开2 cm的切口，以定位和外化盲肠。小心分离盲肠以避免血管损伤，采用非吸收缝线结扎盲肠后1/3处，然后用18-G针从结扎到盲肠末端从肠系膜向反肠系膜方向穿孔2次，并挤出少量肠内容物。术后盲肠被放回腹腔，消毒后将腹肌和皮肤依次闭合。皮下注射生理盐水（1 mL/20 g）进行复苏。CLP模型在15 min内完成。假手术（Sham）组小鼠除盲肠不结扎穿孔外，其余操作相同[21]。CLP+Fer-1组在进行CLP手术前1 h腹腔注射浓度为5 mg/mL的Fer-1（5 mg/kg）[22]，其余操作与CLP组相同。

1.4. 超声心动图评估小鼠左心室结构和功能

术后24 h吸入1%的异氟烷麻醉小鼠，剃除小鼠胸前区毛发，然后使用配备30 MHz的MS-400超声探头的Vevo2100超高分辨率小动物超声系统（VisualSonics）进行评估。在M型超声模块下检测心率、左室舒张末期内径（LVIDd）、左室收缩末期内径（LVIDs）等，计算左心室射血分数（LVEF%）和缩短分数（LVFS%），每只小鼠至少取3个心动周期，反映小鼠心脏的舒张和收缩功能。

1.5. 心肌组织H & E染色观察心肌形态变化

术后24 h，收集新鲜的心肌组织样本，在PBS中泵出血液，4%多聚甲醛固定24 h，乙醇梯度脱水，石蜡包埋，将固定的心肌组织切片（0.5 mm），苏木精-伊红染色，光镜下（Nikon Eclipse E100）分析心肌组织结构变化。

1.6. 透射电子显微镜观察心肌超微结构变化

术后24 h，取出小鼠心脏，在PBS中泵出血液，3 min内取小鼠心尖组织约1 mm3，立即放入提前装好2.5%戊二醛电镜固定液的离心管内，4 ℃保存，组织在1%锇酸避光室温固定2 h，室温脱水、渗透包埋、聚合后超薄切片（70 nm）、染色，在透射电子显微镜（HITACHI，HT7800）下观察，采集不同倍数下观察心肌细胞超微结构图像。

1.7. ELISA法检测各组小鼠血清中炎症因子TNF-α的表达

术后24 h收集小鼠全血放置2 h后，4 ℃低温离心机中1000×g离心15 min，取上清液，每个样本吸取50 μL血清再加入50 μL的样品稀释液。按照试剂盒说明，按步骤测量各孔的吸光度（A），计算出各组血清TNF-α的浓度。

1.8. 比色法测定组织铁（Fe）的含量

取收集的心肌组织按重量体积比1 g∶9 mL的比例加入9倍体积的生理盐水，用匀浆机将标本匀浆充分，2500 r/min，离心10 min，取上清液，按照试剂盒说明，测定各管吸光度（A），计算组织铁含量。

1.9. Western blot检测各组小鼠心脏组织中Lcn2和GPX4、FSP1的表达

取每只小鼠约20 mg心肌组织，加入15 μL/mg RIPA裂解液和0.15 μL/mg PMSF蛋白酶抑制剂提取组织总蛋白，BCA法测定各组蛋白浓度，加入5×蛋白上样缓冲液后，定量30 μg上样，电泳后将蛋白转至PVDF膜，用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜2 h，山羊抗小鼠Lcn2抗体（1∶1000）、兔抗小鼠GPX4抗体（1∶3000）、兔抗小鼠FSP1抗体（1∶2000）和GADPH抗体（1∶6000）4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，然后将膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（1: 8000）和兔抗山羊二抗（1∶8000）孵育1 h，TBST洗膜4次，发光化学发光成像系统（FluorChem M）曝光、显影。Image J软件分析各组蛋白表达水平。

1.10. 统计学处理

采用GraphPad Prism 9进行统计处理，定量数据采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，并用Tukey检验进行组间比较。P < 0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 脓毒症心肌损伤小鼠模型心脏超声的变化

与Sham组相比，CLP组小鼠LVEF%降低（P=0.0187，图 1C）、LVFS%降低（P=0.0072，图 1D）、LVIDs升高（P=0.0146，图 1E）、LVIDd降低（P=0.0030，图 1F）。与CLP组相比，CLP+Fer-1组LVEF%升高（P=0.0382，图 1C）、LVFS%升高（P=0.0246，图 1D）、LVIDs降低（P=0.0120，图 1E）、LVIDd升高（P=0.0135，图 1F）。

图 1.

图 1

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各组小鼠心脏超声图像和心功能各指标变化

Changes in cardiac ultrasound images and cardiac function indexes in different groups (Mean±SD, n=7). A: Evaluation of cardiac function by echocardiography. Representative M-mode images are shown. B-F: Echocardiographic parameters. *P < 0.05, **P < 0.01 vs Sham group; #P < 0.05 vs CLP group.CLP: Cecal ligation and puncture; Fer-1: Ferrostatin-1; LVFS: Left ventricle fractional shortening; LVEF: Left ventricle ejection fraction; LVIDs: Left ventricle internal dimension systole; LVIDd: Left ventricle internal dimension diastole.

2.2. 光镜和电镜下观察各组小鼠心肌形态学和超微结构的变化

小鼠心脏HE染色显示，Sham组心肌纤维细胞完整，排列整齐，无坏死和炎症细胞浸润，心肌横纹清晰可见，排列较整齐，细胞核为深蓝色（图 2）。CLP组心肌纤维断裂、心肌横纹模糊，部分消失，间质水肿，有红细胞渗出，炎症浸润，细胞核为淡蓝色。CLP+Fer-1组肌丝排列较整齐，无炎性浸润和红细胞渗出。电镜下观察显示，Sham组线粒体排列整齐，膜完整，心肌纤维完整，排列整齐，闰盘、Z线清晰可见（图 3）。CLP组可见线粒体排列紊乱，部分线粒体肿胀变性，嵴减少、断裂，外膜部分溶解消失，部分线粒体变小，密度增高，心肌纤维断裂，肌丝束分离，Z线模糊。CLP+Fer-1组相较于CLP组线粒体损伤减轻，膜较完整，但线粒体仍有嵴断裂和肿胀，心肌纤维排列较整齐。

图 2.

图 2

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各组小鼠心肌组织HE染色

Representative images of myocardial tissues of the mice in different groups (HE staining, ×400). The black arrows indicate inflammatory cells and red arrows the erythrocytes.

图 3.

图 3

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各组小鼠心肌组织透射电镜代表性图片

Transmission electron microscopy of the myocardial tissues of the mice in different groups.

2.3. 各组小鼠血清中炎症因子TNF-α和组织铁的变化

与Sham组相比，CLP组血清中TNF-α含量升高（P=0.0016，图 4A）、心肌组织铁含量升高（P=0.0086，图 4B）。与CLP组相比，CLP+Fer-1组TNF-α含量降低（P=0.0118，图 4A）、组织铁含量降低（P=0.0212，图 4B）。

图 4.

图 4

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各组小鼠血清TNF-α和组织铁含量的变化

Changes of serum TNF-α content and total iron in the myocardial tissue in different groups (Mean±SD, n=7). **P < 0.01 vs Sham group; #P < 0.05 vs CLP group.

2.4. Western blot检测各组小鼠心脏组织中GPX4、FSP1和Lcn2的表达

与Sham组相比，CLP组Lcn2蛋白表达升高（P < 0.001，图 5A）、铁死亡相关蛋白GPX4表达降低（P < 0.001，图 5A）、FSP1表达降低（P < 0.01，图 5B）。与CLP组相比，CLP+Fer-1组Lcn2蛋白表达降低（P < 0.01，图 5A）、GPX4蛋白表达升高（P=0.0076，图 5A），FSP1蛋白表达升高（P=0.035，图 5B）。

图 5.

图 5

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各组小鼠心肌组织中Lcn2、GPX4和FSP1蛋白表达的变化

Changes of Lcn2, GPX4 and FSP1 protein expressions in myocardial tissues in different groups (Mean ± SD, n=4). A, B: Western blotting results. C-E: Changes in the protein expressions of Lcn2, GPX4 and FSP1. **P < 0.01; ****P < 0.001 vs Sham group; #P < 0.05; ##P < 0.01 vs CLP group.

3. 讨论

在脓毒症发生发展中，氧自由基（ROS）的过度积累和炎性细胞因子如TNF-α的爆发在心肌损伤发病机制中占有重要地位，TNF-α可进一步诱导炎症级联反应，导致ROS过度增加，加剧心肌损伤的严重程度[23]。长期以来细胞凋亡和焦亡被认为是脓毒症诱导心肌损伤的主要形式[24]。本研究关注于与铁离子代谢密切相关的一种细胞死亡方式—铁死亡。铁死亡是一种铁依赖性的程序性细胞死亡方式，主要由细胞内铁过载和脂质过氧化所引发[5, 19]。铁死亡时大量积累的脂质ROS攻击磷脂双分子层，破坏细胞膜正常结构和完整性[25]。而GPX4是机体内清除脂质ROS所需的关键酶。当相关损伤因素诱发细胞膜上谷氨酸-胱氨酸的转运受阻，引发GPX4活性缺失，使其清除ROS的能力下降，脂质ROS堆积，加剧铁死亡的发生[6]。因此，GPX4蛋白表达水平可反应铁死亡的发生。FSP1是一种新发现的内源性强效铁死亡抑制因子，其不同于经典的谷胱甘肽依赖性保护途径，是通过抗氧化剂辅酶Q10（CoQ10）的还原形式（CoQ10-H2）保护细胞免于铁死亡。FSP1的肉豆蔻酰化使CoQ10定位于质膜，介导NADH依赖性辅酶Q的减少，产生亲脂性自由基捕获抗氧化剂，进一步阻止脂质过氧化物的产生[7, 8]。

本研究应用多菌脓毒症动物模型金标准——CLP诱导小鼠脓毒症心肌损伤的发生。结果显示，在CLP诱导的脓毒症小鼠模型中，心肌纤维损伤严重，部分线粒体肿胀；部分线粒体皱缩，嵴断裂，呈现铁死亡的表现；心动超声显示心脏收缩和舒张功能减弱，血清炎症因子TNF-α和组织铁含量升高明显，同时依赖于谷胱甘肽的铁死亡关键蛋白GPX4蛋白和不依赖于谷胱甘肽的FSP1蛋白表达水平均明显降低，提示小鼠脓毒症诱导心肌损伤显著，发生炎症反应，并伴有铁超载和不同途径铁死亡的发生。

铁死亡抑制剂Fer-1通过抗氧化作用清除机体内ROS，抑制脂质过氧化，抵抗铁死亡，减少细胞中不稳定铁的产生[5, 26]。为进一步分析铁死亡在脓毒症心肌损伤中的作用，本研究使用Fer-1进行干预，结果显示：与CLP组相比，CLP+Fer-1组铁含量降低、GPX4和FSP1蛋白表达升高的同时，心肌纤维与线粒体的损伤明显减轻，TNF-α水平降低，心肌收缩和舒张功能有所恢复，表明抑制铁死亡可减轻心肌组织学损伤和炎症反应。Fer-1常被认为防止由GPX4抑制、gpx4缺失或谷胱甘肽消耗引起的铁死亡的机制[27]。本研究提示其也可能通过上调FSP1来有效抑制铁死亡，从而抑制脂质过氧化的产生，发挥其对脓毒症心肌损伤的保护作用。

铁超载是铁死亡发生的重要原因之一，已有研究表明Lcn2在生理和炎症条件下可以作为一种关键铁调节蛋白发挥作用[14]。当细菌侵入体内时分泌多种毒性因子，使其能够在哺乳动物体内维持生长和繁殖，机制之一是合成和分泌铁载体如肠杆菌素，并从含铁化合物如转铁蛋白和乳铁蛋白中获取铁。Lcn2由宿主分泌，与含铁肠杆菌素以极高的亲和力结合，竞争性获得铁并阻止细菌通过这种方式摄取铁。Lcn2蛋白的无铁形式通过捕获的铁与这些铁载体结合，形成与细菌死亡相关的holo-Lcn2复合体（铁-铁载体-Lcn2复合体，全铁形式），从而保护机体免受细菌侵害[13, 28]。尽管Lcn2能够通过该途径剥夺细菌生长所必需的铁，但holo-Lcn2通过与其受体24p3R/megalin结合内化，转运和释放铁到细胞质中，增加细胞内铁的水平[29]。在多菌脓毒症发生的情况下，这种运载机制可能失调，大量铁通过此通路进入细胞内，引起细胞内的铁超载[14]。本研究同时观察到脓毒症发生时，心肌细胞GPX4表达下降，清除脂质ROS能力下降，加剧了细胞内铁对机体的损害。为进一步明确Lcn2是否参与脓毒症心肌损伤铁死亡的发生，我们同时测定了Lcn2蛋白表达的变化，观察到CLP组铁增高和铁死亡发生时，Lcn2蛋白表达升高，提示Lcn2可能通过诱导铁的释放促进铁死亡的发生；而与CLP组相比，CLP+Fer-1组中，Lcn2蛋白表达也降低，提示抑制铁死亡也降低了Lcn2蛋白的表达，但铁含量的下降是否来自于Fer-1对Lcn2的调控还有待进一步深入探讨。

关于Lcn2对铁死亡的影响多见于肿瘤相关报道，Lcn2过表达通过抑制铁死亡促进大肠癌的进展[30]；NUPR1介导的Lcn2表达通过减少铁积累和氧化损伤阻止胰腺癌细胞铁死亡的发生[31]，这与我们的研究结果似乎相悖。但在多柔比星诱导的心肌病中，敲除Lcn2基因能够降低多柔比星诱导的氧化应激损伤[32]；Lcn2敲除减少了红藻氨酸诱导的小鼠海马铁过载和氧化应激，降低了铁死亡标志蛋白环氧合酶的表达，Lcn2增多可能促进了铁的增加及铁死亡，加重神经炎症[33]，与本研究结果一致。以上报道提示在肿瘤发生和脏器炎症损伤中，Lcn2与铁死亡之间的关系可能不一致，还有待进一步深入探究。

综上所述，来源于GPX4、FSP1不同途径的铁死亡参与CLP诱导的脓毒症心肌损伤，抑制铁死亡可通过减轻炎症反应、降低Lcn2蛋白表达和组织铁含量减轻CLP诱导的心肌损伤。铁死亡有可能成为脓毒症心肌损伤新的治疗靶点。本研究还关注到Lcn2在心肌损伤铁死亡中高表达，未来其是否能作为心肌损伤新的生物标志物和其发生机制还待进一步探讨。

Biography

黄毓慧，在读硕士研究生，E-mail: 13328003506@163.com

Funding Statement

国家自然科学基金（81770297）；蚌埠医学院512人才培育计划（by51201102）；国家级大学生创新创业项目（202010367061）；蚌埠医学院研究生科研创新计划项目（Byycx21015）

Supported by National Natural Science Foundation of China (81770297)

Contributor Information

黄 毓慧 (Yuhui HUANG), Email: 13328003506@163.com.

高 琴 (Qin GAO), Email: bbmcgq@126.com.

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