褪黑素通过激活自噬抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的生长和转移

Abstract

目的

探讨褪黑素对乳腺癌细胞MDA-MB-231生长和转移的作用及其机制。

方法

将MDA-MB-231细胞设置对照组以及1、3、5 mmol/L褪黑素处理组，Western blot检测自噬对细胞生长、转移的影响时，添加3-甲基腺嘌呤（3-MA）组、3-MA联合褪黑素组。使用不同浓度褪黑素处理MDA-MB-231乳腺癌细胞24、48 h，并加入0.1%无水乙醇的细胞作为对照，CCK-8法检测细胞增殖活性确定最佳处理浓度和时间，筛选出3 mmol/L褪黑素用于后续实验。集落形成实验及划痕实验检测不同浓度褪黑素对乳腺癌细胞集落形成能力和迁移能力的影响；流式细胞术、免疫荧光检测3 mmol/L褪黑素对MDA-MB-231细胞凋亡率和自噬蛋白阳性着色情况；Western blot检测自噬相关蛋白LC3、P62、Beclin1，凋亡相关蛋白Bcl2、Bax，上皮-间质转化（EMT）相关蛋白E-cadherin、Snai1的水平。

结果

CCK-8结果显示，与对照组相比，褪黑素呈浓度及时间依赖性抑制乳腺癌细胞的增殖（P < 0.05）；集落形成实验显示，3个浓度褪黑素处理组的集落数低于对照组；褪黑素作用24 h后明显抑制乳腺癌细胞划痕愈合速度（P < 0.01），并诱导细胞凋亡率增加（P < 0.01）；且与对照组相比，褪黑素组的促凋亡蛋白Bax表达增加（P < 0.05），抗凋亡蛋白Bcl2表达下调（P < 0.05），Bcl2/Bax的比值逐渐减低（P < 0.01）；转录因子Snail减少，上皮细胞标志蛋白E-cadherin增加；单独使用褪黑素能够诱导细胞内自噬标记蛋白LC3-ΙΙ/LC3-Ι、Beclin1表达增加，P62表达减少（P < 0.05）以及Beclin1蛋白阳性着色增强，P62蛋白阳性着色减弱；3-MA+褪黑素组中自噬相关蛋白Beclin1（P < 0.001）、LC3-ΙΙ/LC3-（ΙP < 0.05）以及凋亡蛋白Bax（P < 0.01）、上皮细胞标志蛋白E-cadherin（P < 0.001）明显低于褪黑素组，抗凋亡蛋白Bcl2（P < 0.05）、转录因子Snail以及Bcl2/Bax的比值（P < 0.01）高于褪黑素组。

结论

褪黑素可通过诱导MDA-MB-231乳腺癌细胞发生自噬，抑制乳腺癌细胞增殖、转移并促进其凋亡，而减少自噬，可减弱褪黑素对乳腺癌细胞生长和转移的抑制作用。

褪黑素是松果体分泌的一种胺类激素，在生物体中发挥着重要作用，其中包括调节昼夜节律、睡眠、情绪、生殖和衰老等等^[1]。现如今发现，褪黑素在体内及体外能够抑制多种肿瘤的生长、迁移及侵袭，并促进其凋亡^[2-4]，使得褪黑素在肿瘤治疗中的应用倍受关注，其潜在作用机制包括调节褪黑素受体MT1和MT2、促进凋亡、调节肿瘤代谢、抑制血管生成、转移和诱导表观遗传改变等等^[5]。1978年，文献首次介绍了松果体在乳腺癌病因学中可能的理论机制，认为松果体功能的降低，以及随之导致的褪黑素分泌减少，可使乳腺组织处于相对高雌激素状态，最终诱导乳腺癌的发生^[6]。据研究报道，乳腺癌患者中，褪黑素水平明显下降^[7]，在临床状态不佳的晚期乳腺癌患者中，与单独接受化疗的患者相比，同时接受褪黑素治疗的患者的生存率显著更高^[8-9]，且褪黑素在较高浓度下也无明显的副作用^[10]。因此，褪黑素对乳腺癌的治疗可能是一种较好的干预方法。然而，褪黑素抑制乳腺癌的具体作用和机制尚不明确。

自噬是一个复杂的生理过程，通过螯合蛋白质和受损老化的细胞器，最终融合到溶酶体中，导致螯合成分的降解，其对多种肿瘤的发生起着重要的影响^[11]。自噬既可以抵御环境变化对细胞造成的损伤，起到保护肿瘤细胞的作用^[12]，又可以降解功能失调的蛋白，具有抑制肿瘤发展的作用^[13]。关于褪黑素在自噬方面的作用，有文章称褪黑素可改善PBDE-47所致大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC12细胞的异常自噬与凋亡增加^[14]，此外，褪黑素可协同顺铂增加自噬，增强对头颈鳞状细胞癌的细胞毒性^[15]，但自噬在褪黑素对乳腺癌的作用中未见报道。本研究通过检测褪黑素对乳腺癌细胞增殖、凋亡、转移的影响，初步探讨褪黑素是否通过自噬影响乳腺癌细胞的生长、转移，为深入研究褪黑素抗肿瘤提供一定的参考理论依据以及进一步应用于乳腺癌治疗提供实验依据。

1. 材料和方法

1.1. 材料

1.1.1. 细胞

MDA-MB-231乳腺癌细胞，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.1.2. 主要药品与试剂

褪黑素、3-MA（MCE），褪黑素溶于无水乙醇中，无水乙醇在培养基中的终浓度不超过0.1%，3-MA溶于DMSO（二甲基亚砜），在培养基中浓度不超过0.1%；胎牛血清（BI）；DMEM培养基、0.25% 胰蛋白酶（Gibco）；Cell Counting Kit-8细胞增殖毒性检测试剂盒（东仁化学科技有限公司）；Bax、Bcl2、LC3、GAPDH等兔抗单克隆抗体（Cell Signaling Technology）；P62和Beclin1单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、FITC标记的羊抗兔IgG（武汉三鹰生物技术有限公司）；E-cadherin和Snail兔抗单克隆抗体（Affinity）；细胞凋亡检测试剂盒（七海生物）；二辛可宁酸（BCA)蛋白定量试剂盒、Tritionx- 100、抗荧光衰减封片剂含DAPI（北京索莱宝科技有限公司）。

1.1.3. 仪器

多功能酶标仪（Bio Rad）；荧光倒置显微镜（尼康）；流式细胞仪（Beckman）。

1.2. 实验方法

1.2.1. CCK-8法检测细胞增殖能力

将对数生长期的MDA-MB-231细胞，用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞，重悬于新鲜培养基中，细胞以1×10⁴/孔接种于96孔板中，培养24 h使其完全贴壁后，通过参考文献中褪黑素处理肿瘤细胞的浓度^[16-18]，分别用含1、3、5 mmol/L褪黑素的培养基处理乳腺癌细胞MDA-MB-231 24 h和48 h，并用加入0.1%无水乙醇的细胞作为实验对照，设置只含培养基的孔作为空白组。待培养结束后，更换成新鲜培养基，并加入CCK-8试剂，在37 ℃培养箱中孵育2 h后，用酶标仪（检测波长450 nm）检测各孔的A值并与对照组比较，计算细胞的存活率，细胞存活率=（A_加药-A_空白）/（A_对照-A_空白）×100%。绘制MDA-MB-231细胞增殖抑制率曲线，即可计算出褪黑素对细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）。

1.2.2. 集落形成实验检测细胞的集落形成能力

0.25%胰蛋白酶消化MDA-MB-231细胞，按照5×10³/孔接种于6孔板中，待细胞生长4 d后，换为含1、3、5 mmol/L褪黑素的培养基继续培养，加入0.1%无水乙醇的培养细胞作为对照组，作用6 d后弃去含药物的培养基，PBS洗涤3次，用甲醇固定，1%结晶紫进行染色，最后用PBS洗去多余的染液，晾干后拍照保存，大于50个细胞的集团作为一个集落，统计形成的集落数量。

1.2.3. 划痕实验检测细胞迁移能力

将MDA-MB-231细胞接种在6孔板中，待细胞长满后，用无菌的200 μL枪头在每孔相同位置划出划痕，用PBS清洗掉划落的细胞后，加入含有1、3、5 mmol/L褪黑素的无血清培养基，以加入0.1%乙醇的细胞作为对照组。分别在划痕后的0、24 h，对细胞伤口处进行拍照，记录划痕宽度。

1.2.4. 流式细胞术检测细胞凋亡情况

将MDA-MB-231细胞适量接种于6孔板中，放置在培养箱中培养24 h后，用3 mmol/L的褪黑素处理24 h，以加入0.1%乙醇溶剂的细胞作为对照组，使用无EDTA的胰蛋白酶消化成单细胞悬液后，预冷的PBS洗涤2次，将沉淀按照Annexin V-FITC/PI检测试剂盒说明书进行处理，使用流式细胞仪进行分析，计算细胞的凋亡率。

1.2.5. 免疫荧光

将MDA-MB-231细胞适量接种于6孔板中，培养箱培养24 h后，加入3 mmol/L的褪黑素处理24 h，弃去培养基用PBS洗涤2次后，使用4%的多聚甲醛固定20 min，用PBS洗涤3次，每次5 min，利用0.5%Tritonx-100室温通透10 min，再用PBS洗涤3次，加入5%BSA室温封闭2 h，弃去封闭液后，加入自噬相关抗体（P62、Beclin1）4 ℃过夜，次日使用PBS洗涤残留一抗3次后，加入荧光二抗室温避光孵育1 h，清洗未结合的二抗后，加入含DAPI的抗荧光衰减封片剂5 min，使用荧光倒置显微镜在相应波长下进行观察、拍照。

1.2.6. Western blot检测细胞蛋白的表达

1、3、5 mmol/L褪黑素和含0.1%的乙醇溶剂的MDA-MB-231细胞处理24 h，以及使用3 mmol/L的褪黑素联合及不联合1 mmol/L的3-MA处理细胞24 h，收集并裂解细胞，离心后取上清，对提取的蛋白进行蛋白定量；将提取的蛋白采用12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，将其转移到PVDF膜上后，采用5%的脱脂牛奶进行封闭，加入各自的一抗在4 ℃条件下孵育过夜。用TBST将膜清洗3次，每次5 min。然后与辣根过氧化物酶标记的二抗在室温下孵育1 h，再用TBST清洗3次。加入ECL化学发光液，以GAPHD作为参照，成像仪显影，Quantity One软件分析各蛋白表达情况。

1.2.7. 统计学分析

利用SPSS 18.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 褪黑素抑制乳腺癌细胞增殖

与对照组相比，褪黑素可抑制MDA-MB-231细胞的增殖，具有浓度依赖性，且随着时间的延长，活力也逐渐降低，（P < 0.05，图 1A），其24、48 h的半数抑制率（IC₅₀）浓度分别是3.34 mmol/L、2.81 mmol/L。同时，集落形成实验也进一步表明，与对照组相比，随着褪黑素浓度的增加，细胞所形成的集落数逐渐减少（P < 0.05，图 1B）。

图 1.

褪黑素对MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖的影响

Effect of melatonin on proliferation and colony-forming ability of MDA-MB-231 assessed with CCK-8 assay (A) and colony formation assay (B). *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control group.

2.2. 褪黑素抑制乳腺癌细胞迁移和EMT进程

划痕实验表明，褪黑素能够抑制乳腺癌细胞的迁移，随着褪黑素浓度的增加，其抑制迁移的能力加强，表现出剂量依赖性（P < 0.01，图 2A）。与对照组相比，褪黑素能够下调MDA-MB-231内Snail的表达，P值分别为0.0700、0.0065、0.0057，上调E-cadherin的表达，P值分别为0.0903、0.0108、0.0015（图 2B）。

图 2.

褪黑素对MDA-MB-231乳腺癌细胞转移的影响

Effect of melatonin treatment for 24 h on metastasis of MDA-MB-231 breast cancer cells. A: Wound healing assay (Original magnification: ×40). B: Expression of E-cadherin and Snail proteins in MDA-MB-231 cells detected by Western blotting. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control group.

2.3. 褪黑素诱导乳腺癌细胞凋亡

褪黑素诱导乳腺癌细胞的凋亡率增加，（P < 0.01，图 3A）。通过Western blot检测不同浓度褪黑素处理后的凋亡相关蛋白指标，发现抗凋亡蛋白Bcl2的表达水平随褪黑素浓度增加而减少，凋亡蛋白Bax的表达水平随褪黑素浓度增加而增多，Bcl2/Bax的比值逐渐减低（P < 0.05，图 3B）。

图 3.

褪黑素对MDA-MB-231乳腺癌细胞凋亡的影响

Effect of melatonin treatment for 24 h on apoptosis of MDA-MB-231 breast cancer cells. A: Flow cytometry of melatonin-treated MDA-MB-231 cells. B: Western blotting for detecting the expression of Bcl2 and Bax proteins in melatonin-treated MDA-MB-231 cells. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control group.

2.4. 褪黑素促进乳腺癌细胞自噬发生

与对照组相比，P62阳性蛋白着色减弱，Beclin1阳性蛋白着色增强（图 4A）。通过Western blot检测了LC3、Beclin1和P62的表达，结果显示，与对照组比较，不同浓度的褪黑素处理MDA-MB-231细胞后，LC3-ΙΙ/ LC3-Ι比值随褪黑素浓度增加呈现出递增趋势；Beclin1的蛋白表达量增高；P62表达减低（P < 0.05，图 4B）。

图 4.

褪黑素对MDA-MB-231乳腺癌细胞自噬的影响

Effect of melatonin on autophagy of MDA-MB-231 breast cancer cells. A: Immunofluorescence assay of the expression of autophagy-related proteins Beclin1 and P62. B: Western blotting for detecting the protein expressions of LC3, Beclin1 and P62 in MDA-MB-231 cells treated with melatonin for 24 h. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group.

2.5. 减少自噬可逆转褪黑素诱导的乳腺癌细胞生长、转移抑制

Western blot检测结果显示，与单独使用褪黑素的细胞相比，自噬抑制剂3-MA和褪黑素联合处理细胞后，Bcl2表达增加，Bax、E- cadherin、Beclin1、LC3-ΙΙ/ LC3-Ι表达减少，Bcl2/Bax的比值增加（P < 0.05），Snail虽无统计学差异，但其表达量也呈增加趋势（P=0.0538，图 5）。

图 5.

减少自噬对褪黑素诱导的MDA-MB-231乳腺癌细胞生长抑制的影响

Effect of autophagy inhibition by 3-MA on melatonin-induced growth inhibition of MDA-MB-231 breast cancer cells. Western blotting was used to detect the expressions of apoptosis and migration-related proteins. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs melatonin group.

3. 讨论

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤及致死原因，其发病率占女性总体癌症发病的30%^[19]。乳腺癌的治疗方法主要包括手术治疗、放疗、化疗，但都难以有效地控制^[21]，常规疗法的有限疗效以及严重的副作用，促使人们寻找基于天然产品和草药提取物的新型抗癌药物。褪黑素被认为是生理性的肿瘤抑制剂，其毒性作用极低^{[10, 20]}。关于褪黑素抗肿瘤的机制极为复杂，本研究通过研究褪黑素对乳腺癌细胞的作用及相关机制，为乳腺癌的治疗提供新视野。

诱导肿瘤细胞凋亡以及抑制肿瘤细胞转移是肿瘤治疗的重要途径^[22-23]。据报道，褪黑素对卵巢癌^[24]、结直肠癌等^[25]多种肿瘤具有抑制作用。本研究通过CCK-8、集落实验证实，经褪黑素作用后的MDA-MB-231乳腺癌细胞的活力以及集落形成能力均被抑制，表明褪黑素对乳腺癌细胞具有潜在抑制肿瘤的作用。为评估褪黑素抑制乳腺癌细胞是否由凋亡诱导，我们采用流式细胞术证实褪黑素作用后的乳腺癌细胞凋亡率增加，同时，通过Western blot检测凋亡相关蛋白的表达。由于Bcl2和Bax是细胞凋亡的必需因子，Bcl2具有抑制凋亡的作用^[26]，而Bax可形成同源二聚体诱导细胞凋亡发生^[27]，Bcl2/Bax的比值被认为是调控细胞凋亡的开关，两蛋白之间的比例关系是决定对细胞凋亡作用强弱程度的关键因素，当Bcl2/Bax比值上调，能够抑制细胞凋亡，Bcl2/Bax比值下调，促进细胞凋亡，比值的大小能够反映凋亡的程度^[28-30]。本研究中的乳腺癌细胞经过褪黑素处理后，Bcl2和Bax分别随褪黑素浓度的递增下调和上调，Bcl2/Bax的比值逐渐减低，说明随着褪黑素浓度的增加，褪黑素促进乳腺癌细胞凋亡的作用越明显，这与前面CCK-8、集落实验和流式细胞术的实验结果一致，与Nadir等^[31]使用褪黑素抑制MCF-7乳腺癌细胞增殖，促进细胞凋亡的研究结果一致。基于以上结果，表明褪黑素可通过诱导乳腺癌细胞发生凋亡从而抑制细胞生长。此外，我们发现，经褪黑素处理后的细胞划痕愈合的能力下降，同时细胞内伴随着E-cadherin表达的降低和Snail的增加。由于EMT是发生转移的关键步骤，而EMT最重要的标志性变化就是E-cadherin的减少和丢失^[32]，E-cadherin作为EMT中最重要的上皮标志物，其表达的减少，被认为与癌症转移的风险增加有关^[33]，Snail作为一种转录抑制因子，可直接作用于E-cadherin，通过直接滞留E-cadherin的表达，使上皮细胞转变为间充质细胞，进而诱导EMT^[34]，以上结果证明，经褪黑素处理后的乳腺癌细胞转移能力受到抑制，这也与Maroufi等^[35]使用褪黑素抑制乳腺癌干细胞侵袭、转移的研究结果相符合。总之，本研究证实了褪黑素能够抑制MDAMB-231乳腺癌细胞的生长、转移。

目前自噬在褪黑素抑制肿瘤中起着重大作用^[36]，且自噬在褪黑素抑制乳腺癌生长中的作用尚不清楚。LC3作为自噬标志物，LC3-ΙΙ/LC3-Ι比值在一定程度上能够反应自噬程度^[37]，P62作为自噬降解蛋白参与清除细胞内的蛋白质聚合物、受损的细胞器，可以与LC3相互作用，并通过自噬-溶酶体系统降解^[38]，Beclin1参与自噬起始阶段，是形成自噬体的重要分子^[39]。基于以上原因，本研究通过使用免疫荧光检测了褪黑素处理MDAMB-231后P62和Beclin1的表达，发现P62蛋白阳性着色减弱，Beclin1蛋白阳性着色增强，同时，我们使用Western blot检测褪黑素作用MDA-MB-231后LC3、P62和Beclin1的变化趋势，结果发现褪黑素可诱导LC3-ΙΙ/LC3-Ι比值和Beclin1表达上调，P62表达降低，证实褪黑素可诱导乳腺癌细胞自噬发生。由于Beclin1与抗凋亡蛋白Bcl2具有相互作用，这也是细胞凋亡和自噬相互作用的重要连接点^[40]。本研究中，褪黑素通过下调Bcl2的表达来抑制乳腺癌细胞生长，同时伴随着Beclin1的增加，说明自噬极可能参与了褪黑素抑制乳腺癌细胞生长，这与褪黑素治疗睡眠剥夺小鼠模型中通过激活自噬抑制Bcl2的结果相似^[41]。

为证实自噬的发生是否参与褪黑素抑制乳腺癌细胞生长和转移，我们在存在及不存在自噬抑制剂3-MA时，用褪黑素处理乳腺癌细胞，与仅作用褪黑素的细胞相比，发现3-MA和褪黑素联合处理的细胞中，Bcl2、Snail以及Bcl2/Bax的比值增加，Bax、E-cadherin、LC3- ΙΙ/LC3-Ι以及Beclin1的表达减少，说明由褪黑素诱导的细胞生长、转移受抑可得到部分回复，这一结果进一步提示自噬参与褪黑素抑制乳腺癌的生长、转移。Huang等^[42]发现褪黑素通过促进胃癌细胞自噬，从而诱导肿瘤细胞凋亡，抑制转移，与本研究结果一致。

综上所述，本研究以乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞为实验对象，研究了褪黑素在乳腺癌中的作用及潜在机制，重点在细胞自噬，结果表明，褪黑素能够抑制乳腺癌细胞增殖和转移、诱导凋亡，同时，褪黑素抑制乳腺癌的行为是通过激活自噬发挥作用的。鉴于较大浓度褪黑素除使人产生镇静和困倦外，对其他生理器官等等并无太大副作用^[10]，故本研究对褪黑素的相关机制研究，可为褪黑素治疗乳腺癌提供实验基础。

Biography

吴道秋，硕士，E-mail: 326166112@qq.com

Funding Statement

国家自然科学基金（82173378，81960476，81460365，81760039，81402451）；贵州省卫生健康委基金（gzwkj2021-160）；贵州省科技厅资助项目([2019]1270，[2020]4Y160)

Supported by National Natural Science Foundation of China (82173378, 81960476, 81460365, 81760039, 81402451)