带TRS基序突变的新型冠状病毒威胁更大

Abstract

目的

研究冠状病毒转录调控序列（TRS）基序突变，为深入研究冠状病毒的爆发、传播规律以及开发减毒活疫苗等提供理论基础。

方法

采用进化与分子功能联合分析法，对公开的全部套目病毒基因组数据进行分析。

结果

冠状病毒基因组内的前导转录调控序列（TRS-L）通常由其5'端非编码区内的前60~70个核苷酸残基组成，长度不同的基因体转录调控序列（TRS-B）位于除ORF1a和1b外的其它基因紧邻的上游，每个冠状病毒基因组的TRS-L和TRS-B共有一段特定的一致性序列，即TRS基序，TRS基序中出现的碱基变化叫做TRS基序突变。TRS基序突变如果发生在TRS-L或多个TRS-B中，会形成超级减毒株。超级减毒株的扩散，可引起无症或轻症感染者增多，潜伏时间长，以及漏检率上升等问题，对SARS-CoV-2的防控提出新的挑战。超级减毒株还会增大与人类长期共存的概率，将长期威胁人类健康。Delta突变株与此前出现的突变株有显著不同，如果不高度重视，可能引起大规模传播。带TRS基序突变的Delta突变株已经在新加坡出现并有扩散趋势，因此新加坡，甚至东南亚可能形成下一波疫情的传播中心。

结论

各种SARS-CoV-2突变株都将产生TRS基序突变，只有带TRS基序突变的超级减毒株，才能最终失去跨物种传播和大爆发的能力。

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）属于套式病毒目（Nidovirales）、冠状病毒科（Coronaviridae）、冠状病毒亚科（Coronavirinae）、Beta冠状病毒属的B亚群（Sarbecovirus）。在本文中，如不特别说明，冠状病毒特指冠状病毒亚科。根据国际病毒分类委员会第9次会议报告，冠状病毒亚科（Coronaviridae）分为4个属，分别是Alpha、Beta、Gamma和Delta冠状病毒；Beta冠状病毒属又再分为5个亚属，即Embecovirus、Sarbecovirus、Merbecovirus、Nobecovirus和Hibecovirus，分别对应此前已定义的A、B、C和D4个亚群^[1-2]和一个我们新定义的E亚群。SARS-CoV-2的基因组与其他冠状病毒基因组结构相似，是一个不分节段的单股正链RNA，其12个基因共编码26个蛋白，其中，ORF1a和ORF1b基因各编码一个多聚蛋白，这两个多聚蛋白被切割成16个成熟蛋白（NSP1-16）以行使功能。此外，SARS-CoV-2基因组还编码4个结构蛋白（S、E、M和N）和6个辅助蛋白（3a、6、7a、7b、8和10）。

冠状病毒基因组的复制和转录由复制转录复合体Replication、transcription complex完成^[3]，其核心是RNA依赖型RNA聚合酶（RdRp，也常表示为NSP12）。冠状病毒，乃至整个套目病毒的一个非常重要的特征就是存在跳跃式转录，也称为不连续转录、聚合酶跳跃或模板转换。跳跃式转录的分子机制是一个长期没有得到解答的科学问题，有研究提出“Leader-body fusion”模型用以解释跳跃式转录^[4]，但其分子机制依然未知。直到2021年首次报道了TRS基序是冠状病毒的尿苷酸特异性RNA内切酶（NendoU，常表示为NSP15）的酶切位点，NSP15的酶切作用是实现冠状病毒跳跃式转录的分子基础，并提出了NSP15对冠状病毒复制和转录的负反馈调控模型^[5]。由于冠状病毒的跳跃式转录与重组都需要依赖NSP15的酶切作用，即共享一个分子机制，冠状病毒可在其生存周期中随时发生重组，成为导致其反复暴发的最主要因素^[5]。在随后的研究中又发现了NSP15蛋白酶切位点与RNA甲基化的相互关系，特别是TRS发卡结构的重要作用，进一步解释了冠状病毒复制转录复合体的工作原理^[3]。TRS基序将冠状病毒转录调控和重组等重要功能联系到一起，因此，值得深入研究。

本研究报道全部冠状病毒的TRS基序以及多种SARS-CoV-2突变株已出现TRS基序突变，为深入研究冠状病毒的爆发、传播规律以及开发减毒活疫苗等建立了基础；本研究采用进化与分子功能联合分析法，分析了TRS基序突变在冠状病毒进化中的作用，预测了SARS-CoV-2大流行后期有可能出现带TRS突变的超级减毒株，并分析了其危害，为大流行后期的防控提供理论依据；带TRS基序突变的Delta突变株已经在新加坡出现并有扩散趋势，因此新加坡，甚至东南亚可能形成下一波疫情的传播中心。

1. 材料和方法

1.1. TRS基序的鉴定

从NCBI RefSeq、GenBank和GISAID等数据库获取冠状病毒亚科和环曲病毒亚科所有病毒的基因组序列。将下载的基因组按照亚群分类，使用Clustal W工具进行多重比对，将结构蛋白基因（S、E、M和N）对齐，找出所有5'UTR中以及结构蛋白基因上游的TRS，鉴定每个病毒的TRS-L和TRS-Bs。

1.2. TRS基序突变的监测

通过检索国家生物信息中心2019新型冠状病毒信息库（https://ngdc.cncb.ac.cn/ncov/），监测TRS-L中的经典TRS基序ACGAAC（基因组位置为MN908947：70-75）的突变情况；从GISAID数据库获取带TRS基序突变的SARS-CoV-2的基因组序列，通过Perl脚本编程再次确认TRS基序突变信息并进行统计。

1.3. SARS-CoV-2突变株对中和抗体效力的影响

通过Outbreak.info网站对SARS-CoV-2 S蛋白突变位点的频率进行统计。结合Beta冠状病毒B亚群的5个重组区（RC3至RC5位于NTD结构域中，RC6和RC7位于S1亚基的RBD结构域中）分析各种RBD突变对中和抗体的影响。

2. 结果

2.1. 冠状病毒跳跃式转录的分子机制

如果RNA合成酶RdRp不间断地读取基因组RNA [记做gRNA(+)]，则合成反义基因组RNA[记做gRNA (-)]，如果RdRp在合成过程中遇到基因体转录调控序列（TRS-B）时产生跳跃，并将模板转换为前导转录调控序列（TRS-L），则合成产物为反义亚基因组RNA[记做sgRNAs(-)]；RdRp的连续合成完成复制以及ORF1a和1b两个基因的转录，RdRp的不连续合成完成其它10个基因的转录，即跳跃式转录；RdRp以gRNAs(-)和sgRNAs(-)为模板分别合成gRNAs(+)和sgRNAs(+)；gRNAs(+)用作ORF1a和ORF1b翻译的模板，sgRNAs (+)用作其它10种蛋白质翻译的模板；TRS-L通常由冠状病毒基因组前60至70个核苷酸残基（位于5'端非编码区内）组成，长度不同的TRS-B位于除ORF1a和1b外的其它基因的紧邻上游，并调控其紧邻下游的基因；每个冠状病毒基因组的TRS-L和TRS-B共有一段特定的一致性序列，叫做转录调控序列基序，简称TRS基序（图 1）。

图 1.

SARS-CoV-2中的跳跃式转录与TRS基序

Jumping transcription and TRS motifs in SARS-CoV-2. The elements used to represent the SARSCoV- 2 genome (GenBank: MN908947.3) were originally used in the previous study^[5]. A TRS-L usually comprises the first 60-70 nts of the 5' UTR in a CoV genome, while TRS-Bs with varied lengths are located immediately upstream of genes except ORF1a and 1b. In each CoV genome, the TRS-L and TRS-Bs share a specific consensus sequence, namely the TRS motif (e.g. ACGAAC for SARS- CoV- 2). Any changes of nucleotide residues in the TRS motifs are defined as TRS motif mutations. TRS-L: Transcription regulatory sequence in the leader; TRS-B: Transcription regulatory sequence in the body; gRNA(+): genomic RNA; gRNA(-): Antisense genomic RNA; sgRNA(+): Subgenomic RNA; sgRNA(-): Antisense subgenomic RNA. nsp12: RNA-dependent RNA polymerase (RdRP); nsp15: Nidoviral RNA uridylatespecific endoribonuclease (NendoU).

2.2. 全部冠状病毒TRS基序的鉴定

在使用NCBI公开数据进一步验证NSP15蛋白酶切位点的过程中，我们鉴定了套目下全部病毒的经典TRS基序（图 2），特别是确认了冠状病毒的经典TRS基序（canonical TRS motif）都是以腺苷酸残基A开始的含A最多其次是C的一致性序列这一规律。结合进化分析的结果，进一步定义如下：一个冠状病毒基因组只有一个经典TRS基序（这个TRS基序与该病毒所在类群最早分化出来的祖先的TRS基序最接近），一般情况下，冠状病毒亚科病毒TRS-L中的TRS基序是经典TRS基序，而TRS-B中的基序可以是经典TRS基序，也可以是非经典TRS基序（non-canonical TRS motif）。非经典TRS基序与经典TRS基序可以有几个核苷酸残基的差异，这些差异显然是来自进化过程中保留下来的突变。

图 2.

冠状病毒亚科病毒基因组中的经典TRS基序

Canonical TRS motifs of viruses in Coronaviridae. Embecovirus, Sarbecovirus, Merbecovirus, Nobecovirus and Hibecovirus are also defined as subgroups A, B, C, D and E. In the present study, we only list canonical TRS motifs (in red color) of viruses in Coronaviridae.

在鉴定环曲病毒亚科的经典TRS基序（图 2）的过程中，我们首次发现了TRS-L中的TRS基序突变，突破了基于冠状病毒科数据对经典TRS基序的认识，最典型的一个案例来自白鳊鱼病毒基因组（RefSeq: NC_ 008516），新发现包括两点：（1）其经典TRS基序是AACACAGCACTACA（表 1），该基序长度远远大于冠状病毒亚科的经典TRS基序的常见长度（6~8 nt），推测此长度更接近冠状病毒祖先的经典TRS基序的长度；（2）其TRS-L中的TRS基序突变为非经典TRS基序AACACACAACAAG（表 1），而冠状病毒亚科的所有病毒的TRS-L中不存在TRS基序突变。

表 1.

白鳊鱼病毒基因组中的TRS基序

TRS motifs in white bream virus genome

TRS Motif	Region	Position	Gene (Start-End)
All TRS motifs in the genome of white bream virus (RefSeq: NC_008516) were annotated in the present study: The first column is the TRS motif; The second column is the region which contains the TRS motif; The third column is the genomic position of the first nucleotide residue in the TRS motif; The fourth column is the nearest downstream gene of the TRS motif. This virus does not has the gene E.
AACACACAACAAG	TRS-L	24	Orf1ab(906-21523)
AACACAGCACTACA	TRS-B	21506	S(21525-25187)
ACACAGCACTACA	TRS-B	25194	M(25214-25897)
AACACTACAGCC	TRS-B	25899	N(25915-26400)
AACACACACCCATACA	TRS-B	26404	-

2.3. TRS基序突变在冠状病毒进化中的作用

本研究采用此前提出的进化与分子功能联合分析法，分析了GenBank数据库全部冠状病毒的基因组序列，结果发现：（1）冠状病毒亚科的每一个属（的所有病毒）只有一种经典TRS基序（高度保守），只有Beta冠状病毒A亚群例外，它与同属的其它几个亚群的经典TRS基序不同（图 1）；（2）Beta冠状病毒B亚群（特别是SARS-CoV和SARS-CoV-2）的所有病毒基因组中的TRS-L和调控4个结构基因（S、E、M和N）的TRS-B中的经典TRS基序均没有突变发生；（3）Beta冠状病毒B亚群以外的各类群（即Alpha、Beta、Gamma和Delta冠状病毒以及Beta冠状病毒其它亚群）普遍存在至少一个调控结构基因的TRS-B中的经典TRS基序突变为非经典TRS基序。因此推断：TRS基序突变导致Beta冠状病毒B亚群以外的各类群病毒的基因转录能力以及NSP15的调控能力降低，病毒减毒后最终失去了跨物种传播和大爆发的能力，而仅与少量最适宿主长期共存；不带TRS基序突变的Beta冠状病毒B亚群是冠状病毒中毒力最强的一个分支，将长期威胁人类健康。

2.4. RBD突变对中和抗体效力的影响

Beta冠状病毒B亚群的重组区域全部集中在ORF1a基因和S基因的S1亚基对应的基因组区域（图 3），其中3个重组区（RC3至RC5）位于S1亚基的NTD结构域对应的基因组区域，另外两个（RC6和RC7）位于S1亚基的RBD结构域对应的基因组区域。RC3至RC7重组区分别对应S蛋白的67-78，137-164，239-262，438- 452，468-486位置的氨基酸。位于RBD结构域的RC6和RC7重组区对应的氨基酸对于病毒与宿主细胞受体结合至关重要。而中和抗体可以通过与病毒RBD结构域的关键氨基酸结合来阻断病毒与受体结合，进而阻止病毒进入细胞。

图 3.

SARS-CoV-2 S蛋白的重组区

Recombination regions in the Spike protein of SARS-CoV-2. To initiate a CoV infection, the S protein encoded by the S gene needs to be cleaved into the S1 and S2 subunits for receptor binding and membrane fusion. RC3-7 are recombination regions in the genomes of betacoronavirus subgroup B. Three recombination regions (RC3, RC4 and RC5) are localized in the N-terminal domain (NTD) of the S1 subunit, while two other recombination regions (RC6 and RC7) are localized in the receptor binding domain (RBD) of the S1 subunit. A: Only mutations in RBD regions across SARS-CoV-2 lineages are represented, based on the data from 2, 678, 671 SARS-CoV-2 genomes downloaded from outbreak. info on August 8th, 2021. B: The elements used to represent the structure of the S protein were originally used in a previous study ^[10]. RBD (in blue color) and NTD (in blue color) are two domains of the S1 subunit.

2.5. 多种SARS-CoV-2突变株出现TRS基序突变

根据对SARS-CoV-2资源库中全部基因组突变信息的实时跟踪与分析，我们发现多种突变株的基因组中已出现TRS-L中的TRS基序突变，这些病毒主要来自新加坡和墨西哥等国家。根据新加坡2021年3~5月采样的基因组数据（表 2），我们发现有一些毒株的TRS-L中的经典TRS基序ACGAAC（基因组位置为MN908947：70-75）中的C突变为M（表示A或C）、S（表示G或C）或Y（表示T或C）；而G突变为R（表示A或G）。这些位点呈现的核苷酸残基多态性（M、S、Y和R）不是测序错误导致的，极大可能是样本（个人）体内存在了多个毒株共感染导致的。特别是，我们发现了分类为Delta突变株B.1.617.2型的一个新毒株（GISAID：EPI_ISL_2508633）的基因组的TRS-L中的TRS基序突变为ACAAAC（表 2）。由于病毒群体的极大多样性，基于当前获得的少量样本还无法准确评估TRS基序突变对于病毒流行的影响，因此还需进一步收集数据以得到准确的结果。

表 2.

多种突变株出现TRS基序突变

TRS motif mutations in several SARS-CoV-2 variants

Position/Wild	GISAID ID	Collection date	Mutant	Strain
The first column is the position of the nucleotide residue in the SARS-CoV-2 genome (GenBank: MN908947.3) and its wild type; The second column is the identifier of the record in the GISAID database; The third column is the sample collection date; The fourth column is the mutant of the TRS motif ACGAAC in the TRS- L (the mutated nucleotide residue is highlighted); The fifth column is the classification of the virus according to GISAID. EPI_ISL_2508633 is defined as the reference genome of the Delta variant with TRS motif mutation. M is A or C; S is G or C; Y is T or C; R is A or G; and W is T or A.
71C	EPI_ISL_1229164	2021/3/4	A<span style="background:#ffd700">M</span>GAAC	B.1.524
	EPI_ISL_1489724	2021/3/23	A<span style="background:#ffd700">S</span>GAAC	B.1.1.7
	EPI_ISL_2349776	2021/5/5	A<span style="background:#ffd700">M</span>GAAC	B.1.1.7
	EPI_ISL_2508657	2021/5/14	A<span style="background:#ffd700">M</span>GAAC	B.1.617.2
	EPI_ISL_2508861	2021/5/22	A<span style="background:#ffd700">Y</span>GAAC	B.1.617.2
72G	EPI_ISL_462431	2020/3/21	AC<span style="background:#ffd700">R</span>AAC	B.1.1
	EPI_ISL_483591	2020/5/2	AC<span style="background:#ffd700">R</span>AAC	B.6.6
	EPI_ISL_1816969	2021/4/23	AC<span style="background:#ffd700">R</span>AAC	B.1.617.2
	EPI_ISL_2349852	2021/5/11	AC<span style="background:#ffd700">R</span>AAC	B.1.617.2
	EPI_ISL_2508633	2021/5/16	AC<span style="background:#ffd700">A</span>AAC	B.1.617.2
	EPI_ISL_2508830	2021/5/20	AC<span style="background:#ffd700">R</span>AAC	B.1.617.2
	EPI_ISL_2508981	2021/5/27	AC<span style="background:#ffd700">R</span>AAC	B.1.617.2
73A	EPI_ISL_2508907	2021/5/24	ACG<span style="background:#ffd700">W</span>AC	B.1.617.2
75C	EPI_ISL_500540	2020/6/22	ACGAA<span style="background:#ffd700">T</span>	B.6.6

GISAID数据库中2020年1月27日~2021年5月6日采样的29 205条印度地区SARS-CoV-2的基因组几乎不带TRS基序突变，特别是在印度早期传播的毒株中未发现TRS基序突变。因此，我们将EPI_ISL_2508633指定为带TRS基序突变的Delta突变株的参考基因组。新突变株不仅具备Delta突变株的全部特性（如免疫逃逸），而且带TRS基序突变，可能已是或将发展成为超级减毒株。进一步的研究显示，在带TRS基序突变的Delta突变株中，除了RBD结构域中的两个重要突变L452R（RC6内）和T478K（RC7内），还有最早流行的一个突变D614G；此外，NTD结构域中的RC4重组区有多个突变（G142D、E156G、F157del和R158del），比RBD结构域变异还要频繁。

3. 讨论

根据跳跃式转录的分子机制，TRS基序突变必然导致冠状病毒基因的转录下降，这一点已得到实验验证^[6-8]。前期研究对冠状病毒的其它基因组特征（最主要是S1/S2交界处的Furin蛋白酶切位点^[2]）导致的减毒也进行了系统性分析^[10]，并发现了冠状病毒传播和爆发的一些规律，特别是：（1）Beta冠状病毒的祖先与其他类群分化后形成Beta冠状病毒的各分支，这些分支总体上通过减毒或再次爆发得以广泛传播；（2）A亚群的直接祖先与Beta冠状病毒的直接祖先分化最早，减毒程度最大，而且具有最高的多样性；（3）B、D亚群的直接祖先随后分开，伴随进一步减毒；（4）C亚群的直接祖先分化最晚，仍然保留了第二Furin蛋白酶切位点，因此减毒程度很小。对比本研究与以上前期研究结果，我们发现：TRS基序突变导致的减毒与Furin蛋白酶切位点导致的减毒在冠状病毒进化中的变化趋势整体一致，特别是：Beta冠状病毒B亚群所有病毒均未发生TRS基序突变；C亚群（例如MERS-CoV，GenkBank：JX869059）仅有N基因的TRS-B中的TRS基序突变为ACGAATC；E亚群（例如GenkBank：NC_025217）仅有S基因的TRS-B中的TRS基序突变为ACGGAAC。因此，我们推断：Beta冠状病毒B、C和E亚群仍然处于活跃期，将长期威胁人类健康，直到这些病毒通过TRS基序突变继续减毒，才能最终失去跨物种传播和大爆发的能力。

根据重组区RC6和RC7内关键氨基酸的鉴定结果，有研究对2021年初流行的Alpha（B.1.1.7）、Beta（B.1.351）和Delta（B.1.617）突变株对中和抗体的影响做了简单评估^[10]。Alpha突变株的3个主要突变（69- 70Del、N501Y和P681H）均不涉及RC6和RC7重组区；Beta突变株的3个主要突变（K417N、E484K和N501Y）中，有一个E484K涉及RC7重组区，预测会对中和抗体的作用效果产生轻微影响；作为SARS-CoV-2最著名的突变D614G，不涉及RC6和RC7重组区。然而，Delta突变株的两个突变位点（L452R和E484K）分别位于RC6和RC7重组区内，预测会对作用效果产生重大影响；来自南美的Lambda突变株（C37）同时具有8个主要突变，分别位于RC3（G75V和T76I）、RC4（R246N、247- 253Del）、RC6（L452Q）和其它区域（F490S、D614G和T859N），因此，也对中和抗体的作用效果产生较大影响。特别是，247-253Del几乎导致了RC4的缺失。从最早的突变E484K开始，到Delta突变株的双重突变（L452R和E484K），SARS-CoV-2已经产生了逃逸，即在中和抗体的选择压力下，一部分突变株生存下来，并获得进一步传播的机会，以上分析已得到后续的实验验证^[11]。Delta突变株出现后，Delta突变株与此前出现的突变株有显著不同，如果不高度重视，可能引起大规模传播。如果Delta突变株产生TRS基序突变，可能会导致超级减毒株的出现，可引起无症或轻症感染者增多，潜伏时间长，以及漏检率上升等问题，对SARSCoV-2的防控将提出新的挑战。根据前期研究结果^[10]，NTD结构域与RBD结构域发生过同样多的重组事件，说明有同样大的正向选择压力，因此有可能存在第二受体与NTD相互作用。

冠状病毒强大的重组能力是导致其反复爆发的最主要因素，冠状病毒的进化历史显示了其爆发-减毒-再次爆发的规律性。减毒的来源^[10]主要包括RBD区域突变、S1/S2交界处的Furin蛋白酶切位点突变和TRS基序突变等。值得注意的是，TRS基序突变与其导致的减毒不可逆，而其它因素导致的减毒是可逆的。SARSCoV-2爆发的一个重要原因就是因获得Furin蛋白酶切位点而导致其传播力增强^[2]。而SARS-CoV-2爆发不久，就有报道Furin蛋白酶切位点丢失的减毒株（GISAID: EPI_ISL_417443）；最近出现的Omicron突变株^[12]则可能产生双重Furin蛋白酶切位点，因此获得更大传播力。Omicron突变株，经过多次重组形成，情况非常复杂，但基本上属于RBD区域突变导致的减毒株。目前尚未发现大量Omicron突变株的基因组中存在TRS基序突变，因此，当前的Omicron突变株并不是最终的超级减毒株。根据我们的模型，包括Omicron突变株在内的各种突变株都将产生TRS基序突变，只有带TRS基序突变的超级减毒株，才能最终失去跨物种传播和大爆发的能力。超级减毒株通过回复突变再引起大爆发的可能性几乎不存在，然而，如果多种超级减毒株长期共存，会形成一个庞大的基因库，可与其他非减毒株进行重组，因此，其威胁更大。

本研究分析了墨西哥2021年3~4月采样的大量数据，发现大量（被GISAID）分类为B.1.1.519型的毒株也出现了TRS基序突变。来自新加坡和墨西哥的不同毒株在相近的时间段都出现TRS基序突变，值得进一步深入研究。当前的病毒核酸检测一般无法获得基因组数据；高通量测序可以获得基因组数据，但是对于多个病毒株的共感染样品，含量高的毒株会掩盖含量低的减毒株，最后得到的一致性序列会丢失很多重要的信息。因此，希望疾控部门监测上传的基因组数据（特别是高通量测序数据）中的TRS基序突变，以便及早应对可能出现的超级减毒株。带TRS基序突变的B.1.1.7突变株已经向日本（GISAID：EPI_ISL_2771613等）和德国（GISAID：EPI_ISL_2759898等）扩散；带TRS基序突变的B.1.617.2突变株已经向印度尼西亚（GISAID：EPI_ISL_2931745等）和英国（GISAID：EPI_ISL_ 2852198等）扩散。这些数据再次验证了我们的部分预测。

Biography

贝锦龙，副研究员，硕士生导师，E-mail: beijinlong@gdaas.cn

Funding Statement

广东省自然科学基金（2021A1515011072）