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. 2022 Mar 20;42(3):330–337. [Article in Chinese] doi: 10.12122/j.issn.1673-4254.2022.03.03

Bax抑制因子1通过促进视神经萎缩蛋白1表达抑制小鼠动脉血管钙化

Bax inhibitor 1 inhibits vascular calcification in mice by activating optic atrophy 1 expression

Weiren CHEN 1,2,3, Hui DU 2,3, Geng QIAN 3,*, Yujie ZHOU 1,*, Yundai CHEN 3, Qian MA 1, Xueping WU 2, Yuan SHA 2
PMCID: PMC9010980  PMID: 35426795

Abstract

Objective

To investigate the effects of Bax inhibitor 1 (BI- 1) and optic atrophy protein 1 (OPA1) on vascular calcification (VC).

Methods

Mouse models of VC were established in ApoE-deficient (ApoE-/-) diabetic mice by high-fat diet feeding for 12 weeks followed by intraperitoneal injections with Nε-carboxymethyl-lysine for 16 weeks. ApoE-/- mice (control group), ApoE-/- diabetic mice (VC group), ApoE-/- diabetic mice with BI-1 overexpression (VC + BI-1TG group), and ApoE-/- diabetic mice with BI-1 overexpression and OPA1 knockout (VC+BI-1TG+OPA1-/- group) were obtained for examination of the degree of aortic calcification using von Kossa staining. The changes in calcium content in the aorta were analyzed using ELISA. The expressions of Runt-related transcription factor 2 (RUNX2) and bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) were detected using immunohistochemistry, and the expression of cleaved caspase-3 was determined using Western blotting. Cultured mouse aortic smooth muscle cells were treated with 10 mmol/L β-glycerophosphate for 14 days to induce calcification, and the changes in BI-1 and OPA1 protein expressions were examined using Western blotting and cell apoptosis was detected using TUNEL staining.

Results

ApoE-/- mice with VC showed significantly decreased expressions of BI-1 and OPA1 proteins in the aorta (P=0.0044) with obviously increased calcium deposition and expressions of RUNX2, BMP-2 and cleaved caspase-3 (P= 0.0041). Overexpression of BI-1 significantly promoted OPA1 protein expression and reduced calcium deposition and expressions of RUNX2, BMP-2 and cleaved caspase-3 (P=0.0006). OPA1 knockdown significantly increased calcium deposition and expressions of RUNX2, BMP-2 and cleaved caspase-3 in the aorta (P=0.0007).

Conclusion

BI-1 inhibits VC possibly by promoting the expression of OPA1, reducing calcium deposition and inhibiting osteogenic differentiation and apoptosis of the vascular smooth muscle cells.

Keywords: Bax inhibitor 1, optic atrophy protein 1, vascular calcification, osteogenic differentiation, apoptosis

Bax抑制因子1（BI-1）是重要的细胞凋亡抑制因子[1, 2]。本课题组前期研究发现BI-1与血管钙化密切相关，血管钙化中，BI-1蛋白表达下降，细胞钙含量、碱性磷酸酶活性、Runt相关转录因子2（Runx-2）、细胞凋亡增加；过表达BI-1蛋白后细胞钙含量、碱性磷酸酶活性、Runx-2、细胞凋亡减少，血管钙化减轻[3]。但BI-1通路的下游调控蛋白并未清楚。视神经萎缩蛋白1（OPA1）作为介导线粒体内膜融合的主要因子，在维持线粒体结构和功能稳态中发挥重要作用[4-6]。前期研究结果显示血管钙化下调OPA1蛋白表达，线粒体融合减少，线粒体损伤增加，钙沉积、Runx-2蛋白表达、细胞凋亡率增加，而过表达OPA1能促进线粒体融合，抑制钙沉积、细胞骨型分化和凋亡，减轻血管钙化[7]。

BI-1是线粒体形态和功能的重要调节蛋白[8-10]。BI-1能调控心肌微血管内皮细胞线粒体融合－分裂，保护线粒体结构和功能，减少氧化应激损伤和细胞凋亡[11]。在急性肾损伤中，肾小管上皮细胞BI-1表达下调，线粒体分裂增加；上调BI-1表达后，线粒体分裂减少，氧化应激损伤和细胞凋亡减轻[12]。但BI-1蛋白是否直接影响OPA1蛋白表达？BI-1是否通过OPA1抑制钙沉积、细胞骨型分化和细胞凋亡，进而减轻血管钙化，这些问题尚未见研究。因此，本研究构建小鼠血管钙化模型，并探究BI-1如何通过调控OPA1蛋白影响血管钙化。

1. 材料和方法

1.1. 材料

ApoE-/-小鼠、BI-1TG；ApoE-/-小鼠、BI-1TG；OPA1-/-；ApoE-/-小鼠（北京赛业生物公司）。动物实验规程已获批准，符合国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》。

HE染色试剂盒（北京索莱宝公司）；von Kossa染色试剂盒（北京索莱宝公司）；TUNEL试剂盒（罗氏）；钙含量测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；BI-1、OPA1、Runx-2、骨形态发生蛋白2（BMP-2）和β-肌动蛋白（β-actin，Abcam）。SDS-PAGE凝胶电泳仪（Bio-Rad）、光学显微镜（奥林巴斯）。

1.2. 转基因小鼠的构建方法

构建血管平滑肌特异性蛋白SM22α启动子与BI-1位点突变体真核表达质粒，通过显微注射受精卵的方法制备目标小鼠，经过Western blot法证明BI-1在小鼠血管平滑肌细胞特异性高表达。将BI-1TG转基因小鼠与ApoE-/-小鼠多次杂交并做基因鉴定之后，得到基因型为BI-1TG；ApoE-/-小鼠用于试验。

将平滑肌特异性表达Cre酶的转基因雄性小鼠（Tagln-cre）与雌性OPA1flox/flox小鼠交配，通过繁殖筛选，得到Tagln-cre；OPA1flox/+转基因小鼠，并与BI-1TG；ApoE-/-小鼠交配繁殖，并筛选出BI-1TG；OPA1-/-；ApoE-/-转基因小鼠，通过Western blot鉴定OPA1敲低的程度与特异性。

1.3. 小鼠钙化模型的建立和分组

8周ApoE-/-小鼠，禁食不禁水12 h后，于腹腔内注射链脲佐菌素（50 mg/kg），1次/d，连续5 d。如连续2 d测量血糖≥250 mg/dL，则认为糖尿病小鼠模型成功。高糖高脂饲料喂养12周后，开始腹腔注射Nε（- 1-羧甲基）- L-赖氨酸促进斑块钙化，注射剂量为60 μg/次，连续注射16周，取其主动脉弓用于实验[13]。实验分为4组（n=6）：Control组（ApoE-/-小鼠普通饲料喂养），VC组（ApoE-/-小鼠建立钙化模型），VC+BI-1TG组（BI-1TG；ApoE-/-小鼠建立钙化模型）和VC+BI-1TG+OPA1-/-组（BI-1TG；OPA1-/-；ApoE-/-小鼠建立钙化模型）。

1.4. 小鼠主动脉血管平滑肌细胞培养和钙化模型的建立

无菌条件下取出C57BL/6、BI-1TG或者BI-1TG；OPA1-/-小鼠主动脉，剪成小组织块，置于培养皿底部，37 ℃培养箱中培养，等到细胞达到80%融合的时候即可传代用于试验。经α-SMA免疫组织化学染色鉴定纯度>95%。

血管平滑细细胞长至融合状态后用于实验，在常规培养基（10% DEME细胞培养液）中加入10 mmol/L β磷酸甘油（β-GP）和7.2 mmol/L氯化钙，每隔2 d换1次液体，连续培养14 d，建立血管平滑肌细胞钙化模型。

1.5. 小鼠血清血脂、血糖检测

小鼠摘取眼球取血，4 ℃下3000 r/min离心10 min，取上清液，使用BECKMAN COULTER Au2700全自动生物化学仪分析血糖、血甘油三酯、血胆固醇水平。

1.6. HE染色和von Kossa染色

HE染色：小鼠主动脉弓经4%多聚甲醛固定后，然后进行包埋、切片、脱蜡、脱水、HE染色处理，于普通光学显微镜下拍照记录。von Kossa染色：组织石蜡切片经脱蜡、脱水后，置于硝酸盐溶液中照射30 min进行染色，蒸馏水清洗3次后，使用硫代硫酸钠溶液定影和中性品红复染，蒸馏水再次冲洗后于显微镜下观察钙盐沉积情况，使用Image-Pro Plus分析钙盐沉积面积百分比。

1.7. 免疫组织化学染色检测Runx-2和BMP-2表达量

取组织石蜡切片，柠檬酸缓冲液中修复后，BSA封闭液封闭，然后滴加一抗抗体Runx-2（1∶300）或BMP-2（1∶300），4 ℃孵育过夜，蒸馏水冲洗3次，然后滴加二抗抗体，37 ℃孵育1 h，蒸馏水冲洗3次，滴加DAB显色，然后复染、脱水、封片，在显微镜下观察并拍照。每张切片取5个高倍镜视野，计算Runx-2或BMP-2阳性面积百分率。

1.8. 主动脉组织钙含量的测定

取主动脉组织放入盐酸中过夜，次日取上清液进行钙含量测定，使用酶标仪检测吸光度，计算出钙含量（mg/g）。

1.9. TUNEL法检测血管平滑肌细胞凋亡情况

取血管平滑肌细胞建立钙化模型，使用多聚甲醛固定细胞，使用TUNEL试剂盒测定细胞凋亡，每样本中加入50 μL标记液，常温下培养60 min，然后加入辣根过氧化物培育30 min，PBS冲洗后，加入显色剂，细胞核染成棕色提示细胞凋亡，显微镜下计数并记录。

1.10. Western blot法检测主动脉组织BI-1、OPA1蛋白的表达水平

取主动脉组织制备匀浆，加入细胞裂解液裂解30 min，BCA法检测蛋白浓度，经上样、电泳、电转、封闭后，加入一抗（BI-1抗体、OPA1抗体、Runx-2抗体、BMP-2抗体、活化的caspase-3抗体均按1∶1000稀释）4 ℃孵育过夜，洗膜后使用辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1000）室温孵育2 h。冲洗后，暗室曝光，扫描条带。使用Image J软件分析灰度值，以β-actin为内参。

1.11. 统计学方法

应用SPSS19.0软件进行统计学处理。计量资料用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较作独立样本t检验，计数资料以百分数表示，组间比较采用χ2检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 小鼠体质量、血糖、血脂比较

与Control组比较，VC组、VC+BI-1TG组和VC+ BI-1TG+OPA1-/-组体质量、血糖、血胆固醇、血甘油三酯均升高（P < 0.001）。与VC组比较，VC+BI-1TG组和VC+ BI-1TG+OPA1-/-组体质量、血糖、血胆固醇、血甘油三酯差异无统计学意义（P>0.05，表 1）。

表 1.

小鼠体质量、血糖、血脂比较

Comparison of body weight, blood glucose, and plasma lipid levels among the 4 groups of mice (n=6)

Parameter Control group VC group VC+BI-1TG VC+BI-1TG+OPA1-/-
*P < 0.05 vs control.
Weight(g) 27.42±0.98 35.22±1.58* 34.27±1.27* 34.21±1.39*
Serum glucose (mmol/L) 5.58±0.52 23.54±1.09* 22.64±1.23* 22.93±1.44*
Blood cholesterol (mmol/L) 10.78±1.22 23.82±2.49* 22.13±2.17* 24.11±2.33*
Blood triglyceride (mmol/L) 1.58±0.10 2.65±0.11* 2.59±0.15* 2.61±0.13*
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2.2. 小鼠血管钙化后BI-1和OPA1的蛋白表达

小鼠血管钙化时，BI-1和OPA1蛋白表达均下降，差异有统计学意义（P=0.0044）。而过表达BI-1蛋白促进OPA1蛋白表达（P=0.0142，图 1）。为进一步验证BI-1和OPA1的相互作用关系，我们建立了血管平滑肌细胞钙化模型，结果显示β-GP和氯化钙能降低血管平滑肌细胞BI-1和OPA1蛋白，而上调BI-1蛋白能增加OPA1蛋白表达（图 2）。

图 1.

图 1

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Western blot测定血管钙化BI-1蛋白和OPA1蛋白表达

Protein expression levels of BI-1 and OPA1 in the 4 groups of mice (n=6). *P < 0.01 vs control, #P < 0.05 vs VC, & P < 0.01 vs VC+BI-1TG.

图 2.

图 2

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Western blot测定血管平滑肌细胞钙化BI-1蛋白和OPA1蛋白表达

Protein expression levels of BI-1 and OPA1 in vascular smooth muscle cells with calcification (n=6). *P < 0.01 vs control, #P < 0.01 vs β-GP, & P < 0.01 vs β-GP+BI-1TG.

2.3. BI-1/OPA1蛋白通路对小鼠血管钙化钙沉积和斑块面积的影响

von Kossa染色结果显示，血管钙化后钙盐沉积明显增多，过表达BI-1蛋白后钙盐沉积减少（P=0.0006），沉默OPA1蛋白后钙盐沉积再次增加（P=0.0007，图 3）。过表达BI-1蛋白不仅能减少钙化面积，还能减少斑块面积，而沉默OPA1蛋白后斑块面积增多（P=0.0013，图 4）。血管钙化后钙含量增加，过表达BI-1蛋白能降低钙含量，而沉默OPA1蛋白后钙含量再次增高（P < 0.001，图 5）。

图 3.

图 3

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von Kossa染色测定钙化面积

Calcification area in the aorta in different groups (n=6). The black nodules indicated by the arrows are the calcified nodules. *P < 0.01 vs control; #P < 0.01 vs VC, & P < 0.01 vs VC+BI-1TG.

图 4.

图 4

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HE染色测定斑块面积

Atherosclerotic lesions in different groups (n=6). Arrows indicate the atherosclerotic plaques. *P < 0.01 vs control, #P < 0.01 vs VC, & P < 0.01 vs VC+BI-1TG.

图 5.

图 5

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各组主动脉组织钙含量测定

Calcium content in different groups (n=6). *P < 0.01 vs control; #P < 0.01 vs VC; & P < 0.01 vs VC+BI-1TG.

2.4. BI-1/OPA1蛋白通路对小鼠血管钙化Runx-2和BMP-2表达的影响

免疫组织化学和Western blot结果显示，血管钙化后Runx-2和BMP-2表达增加，过表达BI-1蛋白后Runx-2和BMP-2表达下降，而沉默OPA1蛋白后Runx-2（P=0.0008）和BMP- 2表达恢复到钙化时水平（P= 0.0045，图 6~8）。

图 6.

图 6

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免疫组织化学染色测定Runx-2表达

Expression levels of Runx-2 in different groups (n=6). The arrow indicates the Runx-2-positive area. *P < 0.01 vs control; #P < 0.01 vs VC; & P < 0.01 vs VC+BI-1TG.

图 8.

图 8

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Western blot测定Runx-2蛋白和BMP-2蛋白表达

Protein expression levels of Runx-2 or BMP-2 in different groups (n=6). *P < 0.01 vs control; #P < 0.01 vs VC; & P < 0.01 vs VC+BI-1TG.

图 7.

图 7

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免疫组织化学染色测定BMP-2表达

Expression levels of BMP-2 in different groups (n=6). Arrows indicate the BMP-2 positive area. *P < 0.01 vs control; #P < 0.01 vs VC; & P < 0.01 vs VC+BI-1TG.

2.5. BI-1/OPA1蛋白通路对小鼠血管钙化活化的caspase-3表达的影响

血管钙化后活化的caspase-3表达增加，过表达BI-1蛋白后活化的caspase-3蛋白表达减少；而沉默OPA1蛋白后活化的caspase-3蛋白表达再次增多（P=0.0054，图 9）。为进一步证实BI-1/OPA1蛋白通路对细胞凋亡的作用，我们建立了血管平滑肌细胞钙化模型，结果显示过表达BI-1蛋白明显抑制血管平滑肌细胞凋亡，而沉默OPA1蛋白后细胞凋亡又恢复到钙化时水平（P= 0.0002，图 10）。

图 9.

图 9

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Western blot测定活化的caspase-3蛋白表达

Protein expression levels of active caspase- 3 in different groups (n=6). *P < 0.01 vs control; #P < 0.01 vs VC; & P < 0.01 vs VC+BI-1TG.

图 10.

图 10

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TUNEL法测定血管平滑肌细胞凋亡情况

Apoptosis rate in different groups (n=6). Arrows indicate nuclei of brown color as apoptotic cells. *P < 0.01 vs control; #P < 0.01 vs β-GP; & P < 0.01 vs β-GP+BI-1TG.

3. 讨论

血管钙化在糖尿病血管病变、动脉粥样硬化、慢性肾脏疾病中非常常见，是心血管急症的重要危险因子[14-16]。血管钙化分为两类：一类是发生在内膜的动脉粥样硬化钙化，另一类是发生在中膜的慢行肾脏疾病或者糖尿病肾病的钙化[17-19]。血管钙化的机制十分复杂，目前认为多种信号转导途径调节的主动过程，类似于骨发育过程。其机制学说主要包括：血管平滑肌细胞成骨型分化学说、钙或磷酸盐稳态失常、细胞凋亡、炎症等[20-23]。有学者提出BI-1在冠状动脉粥样硬化心脏病中发挥一定作用，BI-1可以抑制心肌微血管内皮细胞凋亡和结构破坏，进而减轻缺血再灌注引起的心脏损伤[24]。有研究结果提示过表达BI-1能减少心肾综合征引起的心肌细胞凋亡和心脏的损害[25]。最近研究表明BI-1是抗血管平滑肌细胞钙化的关键分子[3]。本研究通过构建小鼠血管钙化模型，发现血管钙化后，BI-1蛋白表达明显下降，血管组织钙含量、Runx-2、BMP-2和活化的caspase-3蛋白表达增加，而过表达BI-1蛋白能降低细胞钙含量、Runx-2、BMP-2和活化的caspase-3蛋白表达，进而减轻血管钙化。本研究从动物试验方面进一步证实了BI-1通过抑制细胞凋亡和细胞骨型分化发挥对血管的保护作用。

血管钙化时，激活线粒体融合/自噬能起到减轻血管钙化的作用[26-29]。前期研究发现，血管钙化时，OPA1表达减少，而促进OPA1表达能减少线粒体分裂，促进线粒体融合和自噬，保护线粒体结构和功能完整，减少氧化应激损伤等，进而减轻血管钙化[7, 30]。有研究发现BI-1能保护肾小管上皮细胞线粒体结构完整，减少线粒体氧化应激，促进线粒体呼吸功能，抑制线粒体分裂和线粒体凋亡，进而减轻急性肾损伤[12]。有研究发现BI-1蛋白能抑制心肌缺血再灌注损伤时线粒体膜通透性转换孔的开放，减少线粒体分裂和线粒体损伤引起的细胞凋亡[31]。但是血管钙化时BI-1是如何调控线粒体融合蛋白OPA1的，BI-1是否通过OPA1影响血管钙化，还有待于进一步明确。本研究结果发现，血管钙化后BI-1失活抑制OPA1蛋白表达，过表达BI-1蛋白后OPA1蛋白表达增加，结果提示BI-1可以调控OPA1的表达。另外我们进一步发现过表达BI-1能抑制钙沉积、细胞骨型分化和细胞凋亡，而基因敲除OPA1蛋白后，钙沉积、细胞骨型分化和细胞凋亡指标增加，血管钙化加重。

综上所述，本研究首次探讨BI-1/OPA1通路和血管钙化的关系，并进一步验证了BI-1对OPA1的调控关系，结果提示血管钙化可以抑制BI-1，减少OPA1表达；而促进BI-1蛋白表达，能激活OPA1表达，减轻血管钙化。相信随着研究的深入，将来一定为血管钙化诊断和治疗开辟新的方法和途径。本研究局限性在于缺乏更深入的机制研究，比如内质网应激、线粒体自噬等；另外缺乏BI-1TG；ApoE-/-小鼠组、BI-1TG；OPA1-/-；ApoE-/-小鼠组作为对照，有待进一步研究。

Biographies

陈韦任，博士，副主任医师，E-mail: chen_weiren@sina.com

杜辉，副主任护师，E-mail: hdu301@126.com

Funding Statement

国家重点研发计划“精准医学研究”重点专项（2017YFC0908800）；北京市医院管理局“使命”计划专项经费资助（SML20180601）；首都卫生发展科研专项（首发2020-2-2063）；北京市教育委员会科技计划（KM200910025012）；北京市自然科学基金（7202041）；北京市博士后资助项目（202011）

Contributor Information

陈 韦任 (Weiren CHEN), Email: chen_weiren@sina.com.

杜 辉 (Hui DU), Email: hdu301@126.com.

钱 赓 (Geng QIAN), Email: qiangeng9396@263.net.

周 玉杰 (Yujie ZHOU), Email: azzyj12@163.com.

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