Leptin对缺氧状态下大鼠视网膜祖细胞体外增殖和分化的影响

Abstract

目的

探讨Leptin对体外培养的缺氧状态下视网膜祖细胞（RPCs）增殖、分化的影响及细胞中PTEN蛋白表达的变化。

方法

原代培养大鼠RPCs，不同浓度Leptin作用RPCs细胞，分为：常氧培养组（Control组）、缺氧培养（Hypoxia）+0、0.3、1.0、3.0、10、30 nmol/L Leptin组，分别培养至12、24、48 h，CCK-8法检测细胞增殖活性。将原代培养的RPCs细胞分为：Control组、Hypoxia组、Hypoxia+Leptin组，培养48 h后，转换为分化培养基继续培养6 d，采用免疫荧光染色法对GFAP阳性细胞比例和β- tubulin III阳性细胞比例进行统计分析。Control组、Hypoxia组、Hypoxia+Leptin组细胞培养48 h后，采用Western blot法检测各组RPCs中PTEN蛋白表达水平。

结果

原代培养的P0代RPCs为圆形悬浮生长，培养2 d后细胞可聚集成神经球。低浓度Leptin（0.3、1.0、3.0 nmol/L）作用RPCs 48 h，细胞增殖活性较Control组及Hypoxia组增强，RPCs细胞增殖活性随Leptin浓度增高呈递增趋势，其中，3.0 nmol/L Leptin作用48 h细胞增殖活性最强（P < 0.05）；高浓度Leptin（10 nmol/L，30 nmol/L）组细胞增殖活性较对照组减弱（P < 0.05）。细胞培养48 h，与Control组及Hypoxia组相比，Hypoxia+Leptin组β-tubulin III阳性细胞比例和GFAP阳性细胞比例均无显著性差异（P>0.05），而PTEN蛋白表达量较对照组显著下调（P < 0.05）。

结论

低浓度Leptin可促进缺氧状态下大鼠RPCs细胞增殖，抑制细胞中PTEN蛋白表达，对细胞分化无明显影响。

视网膜祖细胞（RPCs）神经发生和保护的研究是发展眼部干细胞替代治疗的基础。研究表明，成人眼部保留的RPCs可持续不断的分化为成熟视网膜神经细胞^[1]。体外培养的RPCs可整合入视网膜神经节细胞层，发挥保护视网膜功能的作用^{[2, 3]}。RPCs不仅可改善修复大鼠视网膜缺血再灌注损伤^[4]，还具有传递和分泌神经营养因子作用^[5]。缺氧是多种视网膜退行性变的主要病理机制，氧浓度变化是干细胞活性的主要调节因子^[6]。因此，促进缺氧状态下RPCs神经发生或保护自体RPCs活性有利于视神经损伤修复，也是眼科疾病研究热点之一。

PTEN信号在中枢神经损伤后干细胞神经发生过程中发挥必要作用^[7]。在中枢神经损伤修复中，PTEN不仅能够调控神经元的轴突伸长，而且与神经干细胞增殖和分化有着密切联系。RPCs具有干细胞特性，因此PTEN蛋白也是研究RPCs活性的重要分子。Leptin为16-kDa的多功能细胞因子，在许多中枢神经退行性疾病中表现出促进神经发生和神经保护的作用^[8-10]。而目前Leptin在眼部的作用尚无定论^[11]，2型糖尿病患者合并糖尿病神经病变时血清中Leptin水平升高^[12]，合并微血管并发症时玻璃体腔Leptin水平升高^[13]。视网膜视神经作为中枢神经系统的一部分，Leptin对缺氧状态下RPCs活性的影响及其机制，迄今为止，尚未见系统性研究报道。

本研究拟使用Leptin作用于缺氧培养RPCs，探讨Leptin对细胞增殖、分化的影响及细胞中PTEN蛋白表达的变化，为通过药物或基因干预保护视网膜干细胞提供新思路。

1. 材料和方法

1.1. 主要试剂和仪器

神经干细胞特异性培养基，含DMEM/F12基础培养基（Gibco）、B27 supplement（Gibco）、N2 supplement（Gibco）、bFGF（Gibco）、EGF（Gibco）、肝素溶液（Sigma）、penicillin-streptomycin（Gibco），TrypLE^TM Express（Gibco），Recombinant rat leptin (R & D Systems, Minneapolis），多聚赖氨酸（Sigma），Rabbit monoclonal anti- PTEN抗体（Abcam），Mouse monoclonal anti-β- actin（Abcam），Goat antibody to rabbit lgG-HRP（Abcam），Goat antibody to mouse lgG-HRP（Abcam），Rabbit monoclonal anti-β-III Tubulin抗体（CST），Mouse anti-Thy1.1 monoclonal antibody（Millipore），Mouse anti-GFAP monoclonal antibody（Millipore），Cy3-conjugated anti-rabbit IgG（康为世纪生物公司），Cy3-Goat-conjugated anti-mouse IgG（康为世纪生物公司），CCK-8（上海七海复泰生物公司），5%FBS（Gibco），ECL化学发光试剂盒（西安晶彩生物公司），GBOX-HR全自动凝胶成像分析系统（Syngene）。

1.2. 方法

1.2.1. RPCs的培养及鉴定

依据本实验室前期已建立方法原代培养及鉴定Sprague-Dawley大鼠（西安交通大学医学实验动物中心提供，双眼无眼疾）RPCs^[14]，无菌条件下，小心分离出生后1 d的乳鼠神经视网膜，剪切、吹打、过筛后获得细胞悬液，采用神经干细胞特异性培养基（含DMEM/F12基础培养基、B27 supplement、N2 supplement、bFGF、EGF、肝素溶液、penicillin-streptomycin），将细胞接种于培养瓶中，于37 ℃、5%CO₂培养箱内常规培养，观察细胞形态和生长特性。2~3 d神经球形成，使用TrypLE^TM Select (Gibco)，于37 ℃下3 min，接种于6孔板，常规换液，观察细胞形态。缺氧培养组细胞置于37 ℃，94% N2+5% CO₂+1% O₂培养箱中作用6 h，常氧培养组细胞置于37 ℃、5%CO₂常规培养箱内培养，其中约含21% O₂。使用倒置相差显微镜（Leica DMI3000B, Leica Microsystems GmbH, Wetzlar）观察细胞形态，细胞鉴定方法同本课题组前期研究^[14]。动物实验方案经西安交通大学医学部医学伦理委员会审核批准（批文号：2019-180）。

1.2.2. CCK-8法检测Leptin对细胞增殖活性的影响

RPCs细胞接种于96孔板中（细胞密度为5000/孔），在培养液中加入Leptin，Leptin不同浓度（根据Jacob C. Garza等^[15]在脑神经干细胞中的研究）分别作用RPCs细胞，分组如下：Control组、Hypoxia+0 nmol/L，0.3 nmol/L及1.0 nmol/L、3.0 nmol/L、10 nmol/L、30 nmol/L Leptin组。分别培养至12、24、48 h后，加入10 µL CCK-8溶液，各组细胞在37 ℃下4 h。用酶标仪测定吸光值A_{490 nm}。每组设置5个复孔取平均值，实验至少重复3次。

1.2.3. 免疫荧光染色法研究Leptin对RPCs分化的影响

细胞培养鉴定1 d后，进入下列实验组：Control组，Hypoxia组，Hypoxia+Leptin组，其中Leptin浓度为3.0 nmol/L。以上条件下培养48 h后，各组细胞中的培养基由细胞生长培养基转换为分化培养基（去除细胞因子EGF及bFGF，增添5%FBS）将细胞接种于24孔板，细胞密度为2.0×10⁵/mL，24孔板中放置多聚赖氨酸包被的8 mm× 8 mm的细胞玻璃爬片，培养6 d。用4 ℃预冷的PBS（0.01 mol/L，pH7.4）漂洗细胞3次，5 min/次。预冷的4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3次，5 min/次。0.3% TritonX-100孵育20 min，用PBS漂洗3次，5 min/ 次。正常山羊血清封闭非特异性抗原，常温孵育2 h。采用PBS稀释的一抗（Rabbit monoclonal anti-β-III Tubulin抗体，Mouse anti-Thy1.1 monoclonal antibody，Mouse anti-GFAP monoclonal antibody，稀释比1∶ 1000），室温0.5 h后4 ℃冰箱过夜。取出复温后，用PBS漂洗3遍，5 min/次。加入荧光素标记的二抗（0.01 mol/L PBS稀释，Cy3-conjugated anti-rabbit IgG稀释比1∶ 500）室温孵育2 h；PBS漂洗3次，3 min/次。加入DAPI（1∶1000稀释，0.1 mg/mL），5 min。PBS漂洗3次，5 min/ 次。甘油封片，在荧光显微镜下观察。采用正置荧光显微镜于10×下照相，每张细胞爬片至少随机选取10个视野。对GFAP阳性细胞比例和β-tubulin III阳性细胞比例进行统计分析，研究Leptin对RPCs分化的影响。

1.2.4. Western blot法检测Leptin对RPCs中PTEN表达的影响

细胞培养鉴定1 d后，进入下列实验组：Control组，Hypoxia组，Hypoxia +Leptin组，其中Leptin浓度为3.0 nmol/L。以上条件下培养48 h后，分别提取细胞总蛋白。SDS-PAGE蛋白电泳：将配好胶的玻璃板固定在电泳槽中，加入电泳缓冲液。用微量加样器将样品缓慢注入加样孔中，每孔10 μL。80 V电泳40~50 min，120 V电泳90~120 min。蛋白转膜：将PVDF膜和凝胶置于半干转仪中央，转印90 min。将转印好的PVDF膜置于含有5%脱脂奶粉封闭液的孵育盒中，室温条件下，在摇床上孵育1 h。将膜放入杂交袋中，加入相应一抗PTEN（1∶1000）、β-actin（1∶1000），（用5%脱脂奶粉封闭液稀释），封闭杂交袋，室温下轻摇孵育1 h后4 ℃孵育过夜。TBST将膜漂洗3×15 min。加入HRP标记的抗兔/ 小鼠（相应比例稀释1∶5000~1∶100 000）二抗，室温孵育2 h。用TBST将膜漂洗3×15 min。ECL化学发光并用凝胶成像分析系统拍照。用ImageJ软件对采集的Western blot结果进行分析，计算出条带的积分光密度，进行半定量分析。Western blot法检测PTEN蛋白表达变化。

1.3. 统计学分析

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，Graph Pad Prism v5.0软件作图。计量资料数据经W检验呈正态分布，所有结果均以均数±标准差表示，经Levene检验方差齐性。各组总体差异比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。当P < 0.05时差异具有统计学意义。所有实验独立重复3次。

2. 结果

2.1. 原代培养大鼠视网膜祖细胞

原代培养大鼠视网膜祖细胞，观察细胞形态，结果显示：P0代RPCs为圆形悬浮生长，边界清晰，胞浆透亮（图 1A），培养2 d后细胞聚集成神经球（图 1B）。

图 1.

大鼠视网膜祖细胞形态照片

Cell morphology of rat retinal progenitor cells (RPCs). A: The first generation of RPCs cultured in bottles. B: Mulberry-like cell spheres at 2 days of culture. Scale bar=200 μm.

2.2. Leptin对缺氧培养大鼠视网膜祖细胞增殖活性的作用

CCK-8法检测Leptin对缺氧培养大鼠视网膜祖细胞增殖活性的作用（图 2），结果表明，低浓度Leptin（0.3、1.0、3.0 nmol/L）作用12 h后，Hypoxia+Leptin组RPCs细胞增殖活性较对照组增强，高浓度Leptin（10 nmol/L、30 nmol/L）组细胞增殖活性减弱（F=23.554，P < 0.05），而Hypoxia+0 nmol/L Leptin与Control组在12 h时，细胞增殖活性未见明显差异（P>0.05）。各组细胞培养24 h，低于3.0 nmol/L Leptin组，RPCs细胞增殖活性增强，随Leptin浓度增高呈递增趋势，高浓度10 nmol/L、30 nmol/L Leptin组细胞增殖活性减弱（F=88.756，P < 0.05）；其中，1.0 nmol/L、3.0 nmol/L Leptin组细胞增殖活性最强，两者之前无明显差异（P>0.05）。各组细胞培养至48 h，低于3.0 nmol/L Leptin组细胞增殖活性进一步增强，其中，3.0 nmol/L Leptin作用48 h细胞增殖活性最强，与对照组相比差异具有统计学意义（P < 0.05）。

图 2.

各组大鼠视网膜祖细胞增殖活性

Comparison of viability of rat RPCs with different treatments. A: Absorbance at 12 h. B: Absorbance at 24 h. C: Absorbance at 48 h. ^*P < 0.05 vs normoxia group; ^#P < 0.05 vs hypoxia + 1.0 nmol/L Leptin group.

2.3. Leptin对缺氧培养大鼠视网膜祖细胞分化的影响

免疫荧光染色法检测3 nmol/L Leptin作用缺氧培养状态下RPCs 48 h后，细胞的分化情况，结果显示：分化培养基诱导下RPCs可分化为β-tubulin III阳性细胞（图 3A、C、E）和GFAP阳性细胞（图 3B、D、F）。统计结果显示：β-tubulin III阳性细胞百分率：Control组（34.60±4.65）%、Hypoxia组（38.10±5.32）%、Hypoxia+ Leptin组（38.30 ± 4.47）%；GFAP阳性细胞百分率：Control组（41.20±3.94）%、Hypoxia组（42.00±4.42）%、Hypoxia + Leptin组（42.40 ± 4.19）%。与Control组及Hypoxia组相比，Hypoxia+Leptin组β-tubulin III阳性细胞比例和GFAP阳性细胞比例均无显著性差异（P> 0.05，图 4）。

图 3.

各组大鼠视网膜祖细胞免疫荧光照片

Immunofluorescence staining of the RPCs. A, C, E: Merged images of β-tubulin III (red) and DAPI (blue) staining. B, D, F: Merged images of GFAP (red) and DAPI (blue) staining. Scale bar=200 μm.

图 4.

各组大鼠视网膜祖细胞免疫荧光染色统计图

Percentages of β-tubulin Ⅲ-positive (A) and GFAP-positive cells (B) after leptin treatment (3.0 nmol/L) for 48 h (P>0.05).

2.4. Leptin对各组视网膜祖细胞中PTEN蛋白表达的影响

Western blot法检测3 nmol/L Leptin作用缺氧状态下RPCs 48 h后，RPCs中PTEN蛋白相对表达量，结果显示：缺氧培养下3 nmol/L Leptin作用RPCs细胞48 h，PTEN蛋白表达量显著下调，各组PTEN蛋白相对表达量分别为：Control组1.062±0.046、Hypoxia组0.841± 0.060、Hypoxia+Leptin组0.573±0.072；差异具有统计学意义（P < 0.05，图 5）。

图 5.

各组大鼠视网膜祖细胞中PTEN表达

Protein expressions of PTEN in the RPAs. A: Control group. B: Hypoxia group. C: Hypoxia + Leptin group (F=49.245, t=-4.510, ^*P < 0.05 Hypoxia vs Con; t=-9.979, ^*P < 0.05 Hypoxia+Leptin vs Con; t=-5.469, ^#P < 0.05).

3. 讨论

RPCs起源于胚胎神经外胚层，眼部发育过程中RPCs主要分化为视网膜神经节细胞及Müller细胞。成人RPCs保留于眼部的几种组织中，包括睫状体边缘区域、神经视网膜、视网膜色素上皮层及虹膜组织中^[16-18]。本次研究中使用神经干细胞特异性培养基，依据本课题组已建立方法原代培养RPCs，免疫荧光法鉴定细胞Nestin及Pax6表达阳性^[14]，结合细胞形态结果显示：本研究所培养的细胞为RPCs。缺氧是多种眼底疾病的病理机制^[19]，本研究中缺氧培养为1%O₂细胞培养箱6 h，与多种干细胞缺氧研究中实验条件一致，如其他在体外培养骨髓间充质干细胞缺氧的研究^{[20, 21]}。在CCK-8结果示：缺氧刺激RPCs后，继续培养至24 h及48 h，RPCs细胞增殖活性较对照组细胞增殖活性增强，与本课题组前期研究结果一致，提示RPCs细胞对缺氧的耐受性较强^[14]。研究也显示低于3%氧气浓度条件下缺氧培养可提高人视网膜祖细胞增殖活性，其细胞中Ki67及CyclingD1表达增加^[6]，提示短时间缺氧状态可激活RPCs增殖活性。

脂肪细胞因子Leptin为由肥胖基因（ob gene）编码的16 000脂肪因子，最初只知道其通过作用于下丘脑弓状核发挥内源性能量平衡调控功能^[22]，其特异性跨膜受体（LepR）广泛表达于中枢神经系统中，视网膜新生血管网、视网膜神经节细胞层及色素上皮层中均可发现LepR^[23]。研究发现外源性Leptin可诱导脑中风后神经发生及血管生成，提高脑神经干细胞增殖活性^{[24, 25]}，本研究设置了不同Leptin浓度及时间梯度，检测细胞增殖活性变化，筛选出后续实验中Leptin的最佳作用浓度及时间。CCK-8结果示：低浓度Leptin（0.3、1.0、3.0 nmol/L）作用48 h后，Hypoxia组RPCs细胞增殖活性进一步增强，随Leptin浓度增高呈递增趋势，其中，3.0 nmol/L Leptin作用48 h细胞增殖活性最强，提示Leptin可进一步促进缺氧刺激后RPCs细胞增殖。此结果与在脑神经干细胞中的研究结果一致^[26]。而高浓度10 nmol/L，30 nmol/L Leptin作用48 h细胞增殖活性减弱；观察到细胞数量明显减少，且细胞形态受到影响。可能因为高浓度Leptin产生了细胞毒性或结合了其他非特异性受体，抵消了LepR的作用^[15]。因此，选用3.0 nmol/L Leptin浓度、48 h作用时间进行下一步实验。

β-微管蛋白III（β-tubulin III）是原始神经上皮中表达最早的神经元标志物之一。胶质纤维酸性蛋白是成熟星形胶质细胞特有的中间丝蛋白，为星形胶质细胞的特异性标志物。本研究发现，3 nmol/LLeptin作用缺氧刺激后的RPCs 48 h，分化培养基继续培养6 d，β-tubulin III阳性细胞比例和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞比例均无显著性差异，提示3 nmol/L Leptin对视网膜祖细胞向星形胶质细胞和神经元的分化无明显影响。而研究发现Leptin（300 ng/mL）可促进大鼠骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞^[27]，可抑制骨髓间充质干细胞分化为成脂细胞^[28]。可能与视网膜祖细胞及骨髓间充质干细胞特性差异有关。

PTEN蛋白具有磷酸酯酶活性，可拮抗PI3K/AKT信号通路。在RPCs神经发生过程中，PTEN可调控RPCs神经发生与RPCs保存之间的动态平衡^[29]。下丘脑神经元中，外源性Leptin可通过抑制PTEN促进神经元生长^[30]。因此，PTEN蛋白为调控干细胞内源性神经发生的重要分子^{[31, 32]}。本研究发现3 nmol/L Leptin作用于缺氧刺激下RPCs 48 h，RPCs细胞活性增强。PTEN蛋白是否为RPCs细胞中Leptin识别AKT信号过程中的重要节点，尚未见报道。本研究结果发现，3 nmol/L Leptin可抑制Hypoxia组RPCs中PTEN表达，与上述研究结果一致，Leptin是否通过解除PTEN对PI3K/AKT通路的抑制，增强RPCs增殖，将在后续研究中进行验证。

因此，本研究通过实验发现低浓度Leptin可促进体外缺氧培养下大鼠RPCs增殖，抑制细胞PTEN蛋白表达，对细胞分化未见明显影响，初步探讨了Leptin对RPCs神经发生的作用，为通过药物或基因操作干预内源性神经干细胞修复视神经损伤提供了新思路。

Biography

邢瑶，博士，助理研究员，E-mail: xysz.good@163.com

Funding Statement

陕西省重点研发项目（S2021-YF-YBSF-0718）；陕西省重点研发项目（S2021-YF-YBSF-0674）