唐氏综合征胎盘差异miRNA表达谱分析：基于全转录组测序分析技术

Abstract

目的

通过筛选唐氏综合征胎盘中表达变化的miRNAs并分析具体生物学途径来探讨唐氏综合征新的标记物及其分子发病机制。

方法

运用全转录组测序分析技术分析唐氏综合征确诊胎盘（DS，n=3）和产前诊断确诊正常胎盘（n=3）样本，筛选出显著差异表达的miRNA，通过miRWalk、Targetscan、miRDB软件预测其靶基因并进行GO和KEGG-Pathway功能富集分析。

结果

测序分析共检出82个差异表达的miRNA。DS胎盘组织中有29个miRNA表达上调（变化倍数≥2，P < 0.05），15个miRNA表达下调（变化倍数≥2，P < 0.05）；根据表达丰度共筛选出4个表达上调的miRNA，6个表达下调的miRNA。其共同靶基因BTBD3、AUTS2均与神经发育相关。GO富集分析结果显示差异表达miRNA的靶基因主要富集到蛋白结合、水解酶活性、金属离子结合、转移酶活性、核苷酸结合、胞质组分、细胞核组分、转录调控、RNA代谢过程调控、DNA依赖性RNA聚合酶Ⅱ启动子转录调控、眼睛发育、感觉器官发育等。KEGG富集分析结果显示差异表达miRNA靶基因主要参与的信号通路包括肿瘤相关信号通路、PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路、Rap1信号通路、细胞骨架调控信号通路、嘌呤代谢相关信号通路、P53相关信号通路。

结论

miRNAs可能参与了唐氏综合征胎盘损伤和相关的妊娠病理，并可能对其他智力障碍相关疾病提供一定临床思路及对未来的预防治疗发挥重要作用。

唐氏综合征（DS）是最常见的染色体非整倍体，发病率约为1∶700活产^[1]。该综合征包括80多种影响所有主要器官的临床表现，以及不同程度的认知功能障碍和颅面异常，这是唐氏综合征患者最常见的临床特征。同时，唐氏综合征常伴发生先天性心脏缺陷、胃肠道异常、儿童白血病或早发性阿尔茨海默病等^{[2, 3]}。唐氏综合征的表型可能是基因失衡所引起，由于21号染色体基因剂量增加了50%且存在与其他基因相互不平衡的作用^[4]。目前，唐氏综合征在临床缺乏治疗的有效手段，主要通过产前筛查和诊断的方式减少唐氏患儿的出生。

目前常用于唐氏儿的筛查方法是一种联合检测，包括从母体血液中提取的几种生化标记物和胎儿超声标记物，但检出率仅60%~70%^[5]。无创胎儿DNA检查对于唐氏综合征检出率较高，但检查费用高，技术操作复杂，检查周期长，不易在基层医疗机构推广。筛查的阳性结果需要通过侵入性产前诊断检测绒毛膜绒毛取样（CVS）或羊膜穿刺术来确认^[6]。然而，这两种手术对操作者的临床经验要求高，且仍有1%导致流产的机率^[7]。因此，建立一种安全、价格合理又特异性的唐氏综合征产前筛查手段仍是产前诊断领域探索的方向。

miRNA是真核生物中常见的一类由内源基因编码的长度约为20~25个核苷酸的非编码单链RNA分子，参与转录后基因表达的调控^[8]。继妊娠者血浆中胎儿游离DNA被发现后，有文献报道母体外周血中还存在胎儿游离RNA^{[9, 10]}。胎盘是胎儿特有的组织，筛出胎盘特异表达miRNA会产生新的胎儿特异性标志物，对其检测也更具针对性，可以提高检测的特异性和灵敏性，但目前最具特异性的miRNA分子尚有待探讨^[11]。

本研究重点比较了正常胎盘和唐氏综合征胎盘中miRNA的表达；通过使用阵列技术对82个miRNA全转录组进行了分析；使用生物信息学工具分析选定的miRNA的靶基因，以绘制潜在的受影响的功能通路。

1. 资料和方法

1.1. 一般资料

选取同期昆明市妇幼保健院产科产前诊断确诊唐氏综合征孕妇（n=3，年龄分别为28，35，47岁）及正常对照孕妇胎盘（n=3，年龄分别为29，30，31岁）。本研究通过医院伦理委员会审核（审批号：2021-5-7），孕妇均被提供遗传咨询并签署知情同意书。

1.2. 唐氏综合征产前诊断的细胞遗传学和高通量测序分析

使用标准程序对胎儿羊水样本进行染色体分析。超声引导下羊膜腔穿刺术，抽羊水20 mL，离心后弃上清，加入培养基，原位法进行羊水细胞培养，37 ℃培养7~9 d。用GTG显带法对中期染色体进行染色，每个病例检查30个分裂像，分析5个分裂像。采用德国QIAGEN公司DNeasy Blood and Tissue Kit（69506）试剂盒提取羊水细胞DNA。采用染色体CNV检测试剂盒（KR0040）进行DNA文库构建。在Illumina NextSeq500测序平台对DNA文库进行测序。

1.3. 标本处理

胎盘娩出后2 h内完成组织采样。以脐带附着点为中心，在对称的四个方位（A\B\C\D），子面、母面、绒毛层分别取1 cm³样本，放入含RNA-later试剂的EP管中4 ℃过夜，后置于液氮中速冻，之后置于-80 ℃冰箱保存。

1.4. 转录组测序及数据分析

采用高通量测序技术。选取唐氏综合征胎盘和正常胎盘组织各3例，对子面、母面、绒毛层组织进行混样，充分研磨后TRIzol法提取总RNA。miRNA测序文库制备采用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits（Illumina）试剂盒。文库制备工作完成后，对构建好的文库使用Illumina Hiseq2000/2500进行测序。实验流程按照说明书的标准步骤执行。对比分析唐氏综合征胎盘与正常胎盘组织中的差异表达miRNA，以差异倍数≥1.5且P < 0.05及检测丰度较高作为显著上调和显著下调的标准。通过miRBase（https://www.mirbase.org/）查询目标miRNA的序列信息及所在染色体。对差异表达miRNA的潜在靶基因进行GO和KEGG-Pathway功能富集分析。

1.5. 统计学分析

采用SPSS 23.0进行统计学分析，多组间比较使用Chi-square（N×N）检验分析，两组间比较使用T-test分析。对差异表达基因的筛查以|log2(Foldchange)|>1且P < 0.05为阈值。P < 0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 唐氏综合征产前诊断结果分析

唐氏综合征病例产前诊断羊水细胞染色体核型和高通量测序结果一致，均为21三体（图 1）。

图 1.

经高通量测序检测和染色体核型分析的唐氏综合征产前诊断结果

Prenatal diagnosis of Down syndrome by NGS and karyotype analysis. A, B: CNV-seq results of the amniotic fluid in prenatal diagnosis of the Down syndrome. C: Karyotype analysis of the amniotic fluid in prenatal diagnosis of Down syndrome.

2.2. 全转录组测序及质量分析

测序结果经base calling软件CASAVA分析后Q值（碱基质量值）显示由于测序一起造成的某个位置碱基错误率小于1%，测序质量可靠。在样本间重复性分析中使用Pearson相关性分析、PCA分析（主成分分析）来判断，显示数据可信度良好（图 2）。

图 2.

全转录组测序结果的质量分析

Quality analysis of whole transcriptome sequencing results. A, B: Pearson correlation analysis results. C, D: Principal component analysis results.

2.3. 唐氏综合征胎盘中miRNA差异表达情况

实验筛选出82个差异表达的miRNA。与正常胎盘组织相比，唐氏综合征胎盘组织中有29个miRNA表达上调（变化倍数≥2，P < 0.05），15个miRNA表达下调（变化倍数≥2，P < 0.05）；根据表达丰度（表达丰度300以上）共筛选出4个表达上调的miRNA，6个表达下调的miRNA。差异表达的miRNA分布在不同的染色体上，其中包括一个21号染色体衍生的miRNA（表 1）。差异表达miRNA的火山图、整体层次聚类图显示这些miRNA在两组中表达有显著差异（图 3A~C）。通过miRWalk、Targetscan、miRDB软件预测靶基因后进行分析，miRNA-323a-3p、miRNA-199b-5p和miRNA-125b-2- 3p共同靶基因为ALS2（鸟嘌呤核苷酸交换因子）。miRNA-323a-3p和miRNA-199b-5p共同靶基因为BTBD3、AUTS2等（图 3D）。对95个人的组织样本进行RNA-seq测序，靶基因BTBD3在27个不同组织中的表达情况（图 3E，数据来自Bioproject：PRJEB4337。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/22903/）。

表 1.

10个相对高丰度差异表达的候选miRNA

The 10 differentially expressed candidate miRNAs with relatively high abundance

No	miR-name	up/down	fold_change	log2(fold_change)	P value(t_test)	Control group(mean)	DS group(mean)	Location
1	hsa-miR-125b-2-3p	up	2.60	1.38	0.02	305	793	Chr21
2	hsa-miR-654-5p	up	2.02	1.02	0.04	1, 045	2, 112	Chr14
3	hsa-miR-323a-3p	up	2.81	1.49	0.04	3, 316	9, 316	Chr14
4	hsa-miR-199b-5p	up	2.15	1.11	0.05	11, 133	23, 977	Chr9
5	hsa-miR-23a-3p	down	2.24	-1.17	0.01	172, 614	76, 889	Chr19
6	hsa-miR-183-5p	down	2.04	-1.03	0.02	2, 120	1, 037	Chr7
7	hsa-miR-15b-5p	down	1.98	-0.99	0.02	6, 424	3, 239	Chr3
8	hsa-miR-193b-3p	down	5.86	-2.55	0.02	121, 719	20, 769	Chr16
9	hsa-miR-193b-5p	down	4.83	-2.27	0.03	3, 830	794	Chr16
10	hsa-miR-182-5p	down	2.03	-1.02	0.04	1, 464	722	Chr7

图 3.

唐氏综合征胎盘中miRNA差异表达情况

Differential expression of miRNAs in Down syndrome placenta. A: Cluster analysis of differential miRNAs. B: Statistical analysis of up-regulated miRNAs. C: Volcanic map of differential miRNAs. D: Venny map of the target genes of up-regulated miRNAs. E: RNA-seq sequencing for examining the expression of target gene BTBD3 in 27 different tissues from 95 individuals.

2.4. 差异表达miRNA的靶基因功能富集分析结果

通过对所有差异表达miRNA的靶基因GO和Pathway分析发现，GO富集分析结果表明，差异表达miRNA的靶基因主要参与的分子功能包括蛋白结合、金属离子结合、转移酶活性、核苷酸结合、DNA结合、水解酶活性、ATP结合、RNA结合、DNA依赖性RNA聚合酶Ⅱ启动子转录调控、同种蛋白质结合；参与的细胞组分包括质膜部分、胞质部分、细胞核部分、膜的整体成分、胞质部分、核腔、核质部分、突触、细胞连接、细胞器、细胞器腔、膜封闭腔、质膜部分、核仁、突触部分、细胞内非膜细胞器、非膜细胞器、核外围、核基质；参与的生物过程包括转录调控、RNA代谢过程调控、DNA依赖性RNA聚合酶Ⅱ启动子转录调控、眼睛发育、感觉器官发育、转录负调控、依赖DNA、磷酸化、磷代谢过程、磷酸盐代谢过程、mRNA代谢过程。KEGG富集分析结果表明差异表达miRNA靶基因主要参与的信号通路包括肿瘤相关信号通路、PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路、Rap1信号通路、细胞骨架调控信号通路、嘌呤代谢相关信号通路、P53相关信号通路（图 4）。

图 4.

唐氏综合征胎盘中差异表达miRNA的靶基因功能富集分析结果

Functional enrichment analysis of the target genes of the differentially expressed miRNAs in Down syndrome placenta.A: GO analysis. B: Pathway analysis.

3. 讨论

唐氏综合征的发生与母亲的怀孕年龄有关，高龄孕妇唐氏综合征患儿的发病率更高，卵子老化也与唐氏综合征的发生有着不可分离的关系。据报道，30岁以下的孕妇孕育唐氏综合征胎儿风险为1/1000，35岁以上孕妇风险率1/270，40岁以上孕妇风险率为1/100，45岁以上孕妇风险率为1/20^[12]。95%左右的唐氏综合征患者父母均为正常且家族中也没有唐氏综合征，其发生是受精卵早期细胞分裂错误或生殖细胞（精子或卵子）分裂错误导致的。仅有5%以下的唐氏综合征的发生与父母染色体结构异常（如易位）有关^[13]。所以理论上讲，不管是否有家族史，所有怀孕的人都应该进行唐氏筛查，提高孕妇及家属对于唐氏综合征系列产前筛查的重视程度，使更多孕妇主动接受唐氏综合征系列产前筛查，进行唐氏综合征患儿的早期诊断，具有非常重要的现实意义。

已有研究显示，通过检测母体外周血中胎儿游离RNA，可将唐氏综合征诊断的敏感度和特异性分别提高至90.0%和96.5%^[14]。胎儿来源的游离RNA在母体外周血中以亚细胞小体形式存在，不易被RNA酶降解，且在妊娠期母体血液中含量丰富，有望成为无创途径获得胎儿遗传物质的另一个候选标记物^{[15, 16]}。近年来孕妇血液特异的miRNA检测有望成为一种新型的无创产前检测手段逐渐受到重视。Karaca等^[17]对怀有唐氏综合征胎儿的孕妇的羊水miRNA进行研究发现21号染色体相关性miRNA-125b-2，miRNA-155和miRNA- 3156在怀有唐氏综合征胎儿的孕妇羊水中明显高于正常妊娠或未妊娠女性。我们的检测结果（表 1）中显示miR-125b-2-3p在唐氏综合征胎盘中的表达量高于正常胎盘，与报道一致^[18-20]。

通过使用miRWalk、Targetscan、miRDB软件工具对上调miRNA的靶基因进行预测并通过Venny软件分析，发现上调miRNA的共同靶基因为BTBD3、AUTS2、ALS2等。目前关于BTBD3的功能在很大程度上是未知的，Fagerberg等^[21]报道BTBD3基因特异性在胎盘组织和脑组织中存在高表达（图 3E）。另有研究发现，在新生儿发育过程中，BTBD3可以将树突导向活动的轴突终末，并调节初级感觉皮层中活动依赖的树突修剪，从而促进神经回路的形成^[22]。在人类和啮齿类动物中，BTBD3在皮层-纹状体-丘脑-皮层回路中高表达，包括中背丘脑、前扣带皮层和海马体。在这个回路中，BTBD3的表达在出生后早期迅速增加，在人类和小鼠中，在儿童和青少年时期达到高峰^{[23, 24]}。多篇报道显示BTBD3与神经细胞发育有关。另一靶基因AUST2（自闭症易感性候选基因2）已成为一个与广泛的神经心理疾病相关的关键基因，如自闭症谱系障碍、智力障碍、精神分裂症和癫痫^{[25, 26]}。AUTS2位于染色体7q11.22上，该区域与染色体断点的易感性相关。它共跨越1.2 Mb，包括19个外显子，其中外显子1-6位于5'末端，被大内含子分开，外显子7-13紧凑排列在基因的3'末端^[27]。最初在2002年被报道为一对同卵双胞胎因染色体新发平衡易位使AUTS2基因功能被中断而导致自闭症。AUTS2已被证明参与多种神经发育过程：在细胞核中，它作为神经发育的关键转录调控因子，而在细胞质中，它通过控制细胞骨架重排参与大脑皮质发生，包括神经元迁移和神经发生^[28]。在产后，AUTS2调节兴奋性突触的数量，以维持神经回路中兴奋和抑制之间的平衡。在本次唐氏综合征胎盘组织转录组基因测序中显示AUST2、BTBD3和ALS2转录组中表达下调。在AUST2与BTBD3均参与神经细胞的发育，鉴于唐氏综合征患儿均存在智力障碍的问题，其是否与BTBD3、AUST2基因表达下调相关是我们下一步将继续研究的方向。

通过对所有差异表达miRNA的靶基因GO和Pathway分析发现，GO富集分析结果表明，生物过程模块多数为参与RNA代谢过程及转录调控，其余与感觉器官发育、眼睛发育等相关，RNA转录过程的调控推测与唐氏综合征患儿各类代谢产物异常表达有关^[29]。参与的细胞组分方面，多数富集在细胞膜及细胞质相关组分，其余在整个细胞器、细胞核均有涉及。分子功能近年成为在肿瘤、代谢病及遗传病的研究重点，在本文中，唐氏综合征的分子功能富集主要显示在蛋白质结合和金属离子结合方面，且在各类酶活性中均有富集。研究报道在唐氏综合征中神经生长因子的代谢途径发生了改变：通过水解酶、金属蛋白酶等降低神经生长因子的数量^[30]。其余富集到转录调控过程等。

在本次分析结果中，KEGG富集分析结果表明差异表达miRNA靶基因主要参与的信号通路有肿瘤相关信号通路、PI3K-Akt信号通路等。PI3K-Akt信号通路作为脑组织受体，推测其在唐氏综合征患儿脑发育过程起到重要作用^[31]。近年来，关于唐氏综合征生物标记物及发病的分子机制已有一定研究，但尚缺乏更多临床试验验证，本次的检测可能为唐氏综合征发病的分子机制提供了新论据。

综上所述，可能提示miRNA的过度表达属于影响胎盘形成模式及对胎儿发育的所有后果的重要因素。唐氏胎儿在早期发育时胎盘组织中miRNA表达出现上调，进而抑制胎儿神经发育相关靶基因的表达。我们下一步进行血清学验证miRNA表达情况，可用于弥补血清学筛查在唐氏综合征筛查的特异性不足的问题，提高孕早期唐氏综合征筛查的准确性。

Biographies

何建萍，副主任医师，E-mail: 2311378101@qq.com

唐健，检验技师，E-mail: 455617023@qq.com

Funding Statement

国家自然科学基金地区科学基金（81760273，81360103）；云南高层次卫生技术人才项目（D-2019016）；昆明市卫生科技人才培养项目暨内设研究机构建设项目（2020-SW(研)-28）；昆明市卫生科技人才培养项目暨“十百千”工程培养计划项目（2020-SW(后备)-99）

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