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. 2022 Mar 20;42(3):367–374. [Article in Chinese] doi: 10.12122/j.issn.1673-4254.2022.03.08

雷公藤甲素抑制类风湿关节炎患者的成纤维样滑膜细胞的炎症和迁移：基于circRNA 0003353/JAK2/STAT3信号通路

Triptolide inhibits inflammatory response and migration of fibroblast like synovial cells in rheumatoid arthritis through the circRNA 0003353/JAK2/STAT3 signaling pathway

王 杰 1, 刘 健 1,*, 文 建庭 1, 王 馨 1
PMCID: PMC9010992  PMID: 35426800

Abstract

目的

探讨雷公藤甲素（TPL）通过调控环状非编码RNA（circRNA）0003353对类风湿关节炎（RA）成纤维样滑膜细胞（FLS）炎症和细胞迁移的作用机制。

方法

纳入我院风湿科住院RA患者50例和正常人30例，收集外周血单个核细胞（PBMCs）及血清，检测circRNA 0003353的表达、免疫炎症指标[类风湿因子（RF）、C反应蛋白（CRP）、红细胞沉降率（ESR）、anti-CCP、IgA、IgG、IgM、C3、C4]和计算DAS28评分; 采用最佳浓度10 ng/mL TPL处理RA-FLS，并转染circRNA 0003353过表达质粒。采用CCK-8法和Transwell实验检测RA-FLS细胞活力、迁移能力; ELISA法检测细胞因子IL-4、IL-6、IL-17;RT-qPCR法检测circRNA 0003353、Western blot检测p-JAK2、p-STAT3、JAK2、STAT3蛋白。

结果

circRNA 0003353在RA患者PBMCs中表达升高，在协助诊断RA方面有良好效能（AUC=90.5%，P < 0.001，95% CI：0.83-0.98），circRNA 0003353与ESR、RF、DAS28呈正相关（P < 0.05）; TPL呈时间依赖性降低circRNA 0003353表达，抑制RA-FLS的细胞活力和迁移能力，降低促炎细胞因子IL-6、IL-17，升高抑炎细胞因子IL-4（P < 0.01）; TNF-α刺激后，RA-FLS中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值升高，而TPL干预后降低（P < 0.01）; 在TPL干预基础上，转染circRNA 0003353过表达质粒，RA-FLS中circRNA 0003353表达升高，细胞活力和迁移能力升高，IL-4降低，IL-6、IL-17升高，p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值升高（P < 0.01）。

结论

circRNA 0003353在RA-PBMCs和RA-FLS中表达均升高，TPL可通过circRNA 0003353，调控JAK2/STAT3信号通路，抑制RA-FLS炎症和细胞迁移。

Keywords: 类风湿关节炎, 雷公藤甲素, circRNA 0003353, JAK2/STAT3, 炎症, 细胞迁移

类风湿关节炎（RA）是一种以对称性多关节炎为主要临床表现的自身免疫性疾病[1]，以关节滑膜炎症、关节进行性破坏为特征，影响患者生活质量[2, 3]。成纤维样滑膜细胞（FLS）的增殖过度、凋亡不足、炎性细胞的大量浸润，是导致RA患者关节畸形、功能障碍重要因素之一[4-6]。JAK2/STAT3是多种细胞生长、活化、分化、凋亡及其功能发挥过程中重要的信号转导通路[7, 8]。研究发现JAK2/STAT3信号通路的异常活化可导致RA患者体内免疫炎症反应升高，影响关节腔血管生成等[9, 10]。circRNAs是一类新型的RNA，在FLS迁移、分子信号通路、免疫炎症反应等方面具有调控作用[11-13]。本团队前期通过高通量测序及GO分析研究，认为circRNA 0003353是参与RA炎症反应的关键circRNA[14]。

本院RA住院患者多为疾病活动期，主要临床表现为关节肿痛而热、屈伸不利，发热、口渴、不欲饮、烦闷不安、小便黄等[15]。雷公藤甲素（TPL）是环氧化二萜内脂化合物，大多从雷公藤属植物中提取而来，活性高，研究表明TPL能降低滑膜组织血管内皮生长因子、白细胞介素（IL-6）的表达水平[16, 17]。但是RA患者体内circRNA 0003353表达如何、炎症指标表达如何，以及TPL能否通过circRNA 0003353/JAK2/STAT3改善RA-FLS的炎症及细胞迁移尚不明确。

本研究首先临床观察RA患者体内circRNA 0003353及免疫炎症指标变化，再体外细胞培养，将circRNA 0003353过表达质粒转染至RA-FLS细胞中，以最佳浓度TPL干预，观察过表达circRNA 0003353状态下，TPL对RA-FLS中JAK2/STAT3信号通路、细胞因子和细胞迁移的影响，从而推测TPL能否通过circRNA 0003353/JAK2/STAT3影响RA炎症反应和细胞迁移，为TPL治疗RA临床应用提供新的思路。

1. 资料和方法

1.1. 基本资料

收集安徽中医药大学第一附属医院风湿免疫科住院RA患者（2021年3月~2021年9月）50例，30例正常人来自我院健康体检中心。其中男性5例，女性45例，年龄57.32±10.85岁；30例正常人来自我院健康体检中心，其中男性3例，女性27例，年龄53.28±16.03岁，两组基本情况一致，差异无统计学意义。用肝素钠抗凝管清晨空腹留取静脉血4 mL，利用Ficoll提取PBMCs，保存至-80 ℃冰箱备用。本研究通过安徽中医药大学第一附属医院伦理委员会审查（伦理编号：2019AH-12）。

1.2. 诊断及纳入、排除标准

诊断标准：所有患者均采用2010年美国风湿病学会（ACR）联合欧洲抗风湿病联盟（EULAR）提出的RA诊断标准[18]；纳入标准：符合上述诊断；均签署知情同意书；一般资料齐全；排除标准：关节完全丧失功能者；合并有其他器官功能病变或免疫性疾病；妊娠或哺乳期妇女；观察期间应用免疫抑制剂和生物制剂者。

1.3. FLS的培养与转染

RA原代成纤维样滑膜细胞经SV40过表达慢病毒转染而成的永生化细胞系。在青霉素（终浓度为100 U/mL）和链霉素（终质量浓度为0.1 mg/mL）的RPMI 1640培养基，5% CO2、37 ℃的细胞培养箱中培养，待细胞融合度达70%即可传代。根据制造商的说明，将pcDNA3.1- circRNA 0003353与其阴性对照用Li-pofectamine2000转染至RA-FLS中，继续孵育24 h。pcDNA3.1-circRNA 0003353与其阴性对照由上海GenePharma公司合成。

1.4. 药物、试剂与仪器

TPL试剂购自上海源叶生物技术有限公司（编号B20709）。本团队前期用CCK-8检测来评估不同浓度TPL处理RA-FLS活力，结果显示，当TPL浓度为10 ng/mL干预后，RA-FLS细胞活力降低至50%左右[19]。因此，本文研究采用10 ng/mL TPL作为最佳浓度进行实验。

DMEM培养基（Hyclone）；胎牛血清（浙江天杭生物公司）；逆转录试剂盒（TaKaRa）；Fluoromount-G荧光封片剂（SourthernBiotech）；Human IL- 4/IL- 6/IL- 17 ELISA试剂盒（RX106128H/RX106126H/RX106160H，泉州市睿信生物科技有限公司）；JAK2/p-JAK2/STAT3/ p-STAT3（ab39636/ab32101/ab68153/ab32143, Abcam）。

荧光显微镜（Motic，BA410E）；普通PCR仪（杭州晶格科学仪器有限公司，K960）；荧光定量PCR仪（Thermo Scientific，PIKOREAL 96）；高速台式冷冻离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司，JW-3021HR）；酶标仪（雷杜生命科学股份有限公司，RT-6000）。

1.5. 检测指标

1.5.1. RT-qPCR检测circRNA 0003353的表达

Trizol提取各组RA-FLS总RNA，逆转录反应，进行扩增反应，琼脂糖凝胶电泳，采用Gelpro32凝胶图像分析软件对PCR产物进行半定量分析，以β-actin表达量为参照采用2-△△Ct进行相对定量分析。

表 1.

基因的引物序列

Primer sequences for the target genes

Gene Forward primer (5'→3') Reverse primer (5'→3')
circRNA 0003353 GTCCGAATGGTTTCCAGGTG AGGCATACAGAAGCCCAAAGT
β-actin CCCTGGAGAAGAGCTACGAG GGAAGGAAGGCTGGAAGAGT
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1.5.2. ELISA检测细胞因子IL-4、IL-6、IL-17

收集各组RA-FLS培养上清液，1000 r/min离心10 min，弃去沉淀。将上清液加入酶标板中（100 μL/孔），37 ℃孵育1.5 h，采用ELISA方法，严格按照各试剂盒说明书进行操作。

1.5.3. Western blot检测p-JAK2，p-STAT3，JAK2，STAT3蛋白的表达

收集细胞样本，加入RIPA裂解液1 mL（内含1 mmol/L PMSF）进行裂解。离心10 min，收集上清液，在收集的蛋白样品中按照1∶4加入5×SDSPAGE蛋白上样缓冲液。上样，电泳，转膜后，把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗，封闭。滴加p-JAK2（1∶1000）、p-STAT3（1∶1000）、JAK2（1∶1000）、STAT3（1∶1000）一抗，4 ℃缓慢摇动孵育过夜；洗涤后，滴加1∶20 000用二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，室温孵育1.5 h。漂洗后用ECL发光试剂盒来检测蛋白。

1.5.4. CCK-8检测RA-FLS的细胞活力

将细胞接种到96孔板中并培养24 h。然后在指定的时间点（第24、48、72 h）将CCK-8（10 µL）装载到每个孔上，然后在37 ℃下再次培养4 h。使用微孔板读取器（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）测量A450 nm值。根据A450 nm值绘制细胞活力曲线。本实验独立重复3次。

1.5.5. Transwell实验检测RA-FLS细胞迁移

将RAFLS细胞消化后，洗涤、重悬调整细胞密度至2×105/mL，取细胞悬液200 µL至Transwell小室中，下室加趋化因子培养24 h，多聚甲醛固定、PBS洗涤后，加0.5%结晶紫染色20 min，擦去未迁移细胞。使用微孔板读取器（Bio-Rad，Hercules, CA, USA）测量A450 nm值。根据A450 nm值绘制图表。本实验独立重复3次。

1.6. 统计学分析

采用SPSS 23.0软件进行统计学处理，计量资料以均数±标准差表示，两组之间比较，符合正态性和方差齐性，则采用两独立样本t检验，反之，则采用秩和检验，多组数据比较采用one-way ANOVA检验。相关性分析中，符合正态性的连续变量数据采用Pearson分析，反之，则采用Spearman分析。P < 0.05时认为差异具有统计学意义。

2. 结果

2.1. circRNA0003353在RA患者PBMCs中的表达升高

RT-qPCR结果显示，与正常对照组相比，circRNA 0003353在RA患者PBMCs中表达升高（P < 0.05）；ROC曲线结果显示，circRNA 0003353可以作为协助诊断RA的分子标志物（AUC=90.5%，P < 0.001，95% CI: 0.83-0.98）（图 1）。

图 1.

图 1

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circRNA 0003353在RA患者PBMCs中表达

Expression of circRNA 0003353 in PBMCs of RA patients. A: The expression of circRNA 0003353 is increased in PBMCs from RA patients. B: ROC curve analysis of circRNA 0003353 for diagnosis of RA. *P < 0.05. RA: Rheumatoid arthritis. HC: Healthy control.

2.2. circRNA 0003353与RA湿热痹阻证患者炎症指标的相关性分析

Pearson相关性分析结果显示，RA湿热痹阻证患者circRNA 0003353与ESR、RF、DAS28呈正相关（P < 0.05，图 2）

图 2.

图 2

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circRNA 0003353与RA湿热痹阻证患者炎症指标的相关性分析

Correlation analysis between circRNA 0003353 and inflammatory indexes in RA patients with damp heat obstruction syndrome. circRNA0003353 is positively correlated with ESR (A), RF (B), and DAS28 (C).

2.3. TPL降低RA-FLS中circRNA 0003353表达

RT-qPCR实验结果显示，在0、24、48、72 h，最佳浓度TPL降低RA-FLS中circRNA 0003353表达，且呈时间依赖性（P < 0.05，图 3）

图 3.

图 3

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TPL对RA-FLS中circRNA 0003353表达影响

Expression of circRNA 0003353 is increased in RA-FLS at 24, 48 and 72h after TPL treatment. *P < 0.05 vs TNF-α.

2.4. TPL抑制RA-FLS细胞活力和细胞迁移能力

CCK-8法检测最佳浓度10 ng/mL TPL处理RAFLS 24、48、72 h的活力。结果显示，在24、48、72 h内，TPL抑制RA-FLS的细胞活力（P < 0.05），且呈时间依赖性；在48 h时，RA-FLS细胞活力为0.547，最接近50%（图 4A）。因此，选择48 h为最佳作用时间进行进一步的研究。Transwell迁移实验结果表明，经TNF-α刺激后，在24、48、72 h，RA-FLS的细胞迁移数量增多，而TPL可以抑制RA-FLS的细胞迁移（P < 0.05，图 4B、C）。

图 4.

图 4

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TPL对RA-FLS细胞活力和细胞迁移能力影响

Effects of TPL on viability and migration of RA-FLS cells. A: Results of CCK-8 assay for detecting viability of RA-FLS at 24, 48 and 72 h after TPL intervention. B, C: Transwell assay for detecting changes in migration of RA-FLS after TPL intervention (*P < 0.05 vs 0 h, #P < 0.05 vs RA-FLS+TNF-α).

2.5. TPL升高RA-FLS抑炎细胞因子IL-4，降低促炎细胞因子IL-6、IL-17

ELISA实验结果表明，在0、24、48、72 h，最佳浓度TPL升高RA-FLS抑炎细胞因子IL-4（P < 0.05），降低促炎细胞因子IL-6、IL-17，且呈时间依赖性（P < 0.05，图 5）。

图 5.

图 5

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TPL对RA-FLS细胞因子的影响

Results of ELISA for detecting IL-4 (A), IL-6 (B) and IL-17 (C) expression in RA-FLS at 24, 48 and 72 h after TPL intervention. *P < 0.05 vs oh.

2.6. TPL降低RA-FLS中p-JAK2、p-STAT3蛋白表达

Western blot实验结果显示，经TNF-α刺激，RAFLS中p- JAK2、p- STAT3蛋白表达升高（P < 0.01），JAK2、STAT3总蛋白表达无显著变化（P>0.05），pJAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值升高（P < 0.05）；最佳浓度TPL可降低TNF-α刺激后RA-FLS中p-JAK2、pSTAT3蛋白表达（P < 0.01），JAK2、STAT3总蛋白表达无显著变化（P>0.05），p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值降低（P < 0.05，图 6）。

图 6.

图 6

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TPL对RA-FLS中p-JAK2、p-STAT3蛋白的影响

Effects of TPL on p-JAK2 and p-STAT3 protein expressions in RA-FLS. A: Western blotting for detecting the protein expressions of p-JAK2, JAK2, p-STAT3 and STAT3 after TPL intervention. B: Quantitative analysis of the expressions of p-JAK2, JAK2, p-STAT3, and STAT3 after TPL intervention (*P < 0.05 vs RA-FLS+TNF-α).

2.7. 转染circRNA 0003353质粒后，TPL降低RA-FLS中circRNA 0003353表达

RT-qPCR实验结果显示，与TNF-α组相比，TPL组RA- FLS中circRNA 0003353表达降低（P < 0.05）；与TPL组相比，pcDNA3.1-circRNA 0003353组RA-FLS中circRNA 0003353表达升高（P < 0.05），可逆转TPL对RA-FLS作用（图 7）。

图 7.

图 7

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TPL对circRNA0003353表达影响

Expression of circRNA 0003353 in RA-FLS and its effect on cell viability after TPL intervention. TNF-α: RA-FLS+TNF- α; TPL: RA-FLS+TNF-α+TPL; pcDNA3.1-NC: RA-FLS+TNF-α+ TPL + pcDNA3.1- NC; pcDNA3.1-circRNA 0003353: RA-FLS + TNF-α+TPL+pcDNA3.1-circRNA 0003353 (*P < 0.05 vs TNF-α, #P < 0.05 vs pcDNA3.1-NC).

2.8. TPL通过circRNA 0003353抑制RA-FLS细胞活力和迁移能力

将circRNA 0003353过表达质粒转染至RA-FLS中，CCK-8实验结果显示TPL可抑制RA-FLS细胞活力（P < 0.05）；与TPL组相比，pcDNA3.1-circRNA 0003353组RA-FLS细胞活力升高（P < 0.05），可逆转TPL对RAFLS作用（图 8A）。Transwell迁移实验结果表明，TPL可抑制RA-FLS细胞迁移能力（P < 0.05）；与TPL组相比，pcDNA3.1-circRNA 0003353组RA-FLS细胞迁移能力升高（P < 0.05），可逆转TPL对RA-FLS作用（图 8B、C）。

图 8.

图 8

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TPL通过circRNA 0003353对细胞活力和迁移能力影响

Effect of TPL on viability and migration of RA-FLS with circRNA 0003353 overexpression. A: Results of CCK-8 assay for detecting viability of TPL-treated RA-FLS with circRNA 0003353 overexpression. B, C: Transwell assay for detecting changes the migration of TPL-treated RA-FLS with circRNA0003353 overexpression. *P < 0.05 vs TNF-α, #P < 0.05 vs pcDNA3.1-NC.

2.9. TPL通过circRNA 0003353升高RA-FLS抑炎细胞因子IL-4，降低促炎细胞因子IL-6、IL-17

ELISA实验结果显示，与TNF-α组相比，TPL组RAFLS中IL-4升高（P < 0.05），IL-6、IL-17降低（P < 0.05）；与TPL组相比，pcDNA3.1-circRNA 0003353组RA-FLS中IL-4降低（P < 0.05），IL-6、IL-17升高（P < 0.05），可逆转TPL对RA-FLS作用（图 9）。

图 9.

图 9

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TPL通过circRNA 0003353对细胞因子影响

Effect of circRNA 0003353 overexpression on expressions of IL-4 (A), IL-6 (B) and IL-17(C) in RA-FLS after TPL intervention. *P < 0.05 vs TNF-α, #P < 0.05 vs pcDNA3.1-NC.

2.10. TPL通过circRNA 0003353降低RA- FLS中pJAK2、p-STAT3蛋白表达

Western blot实验结果显示，与TNF-α组相比，TPL组RA-FLS中p- JAK2、p- STAT3蛋白表达升高（P < 0.05），JAK2、STAT3总蛋白表达无显著变化（P>0.05），p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值降低（P < 0.05）；与TPL组相比，pcDNA3.1-circRNA 0003353组RA-FLS中p-JAK2、p-STAT3蛋白表达升高（P < 0.05），JAK2、STAT3总蛋白表达无显著变化（P>0.05），p-JAK2/ JAK2、p-STAT3/STAT3比值升高（P < 0.05，图 10）。

图 10.

图 10

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TPL通过circRNA 0003353对p-JAK2、p-STAT3蛋白表达影响

Effects of TPL on p-JAK2, JAK2, p-STAT3 and STAT3 protein expressions in RA-FLS with circRNA 0003353 overexpression. A: Western blotting for detecting the protein expressions of p-JAK2, JAK2, pSTAT3 and STAT3 in RA-FLS with circRNA 0003353 overexpression after TPL intervention. B: Quantitative analysis of expressions of p-JAK2, JAK2, p-STAT3 and STAT3. *P < 0.05 vs TNF-α, #P < 0.05 vs pcDNA3.1-NC).

3. 讨论

RA患者主要以关节和周围组织炎症病变为主，骨质破坏，甚至关节畸形的免疫性疾病[20]，其中RA-FLS异常增殖、迁移、侵袭和炎症反应在RA进展中起着关键作用[21, 22]。中药材雷公藤具有祛风除湿、消肿止痛等功效，可以有效缓解关节肿胀、晨僵等[23]。其中TPL是从雷公藤中最主要的活性物质，可以通过抑制炎症信号通路，改善滑膜炎症环境，调节骨代谢[24, 25]。本团队前期研究发现circRNA 0003353与RA炎症反应相关[14]，但目前国内外对circRNA 0003353临床研究较少，其与炎症指标是否存在调控作用及与TPL之间的影响尚未可知，故本文选择circRNA 0003353、JAK2/STAT3组合，从炎症和细胞迁移角度研究TPL对RA治疗作用。

本文通过RT-qPCR检测发现RA-PBMCs中circRNA 0003353表达上调，且与炎症指标ESR、RF、DAS28呈正相关。研究发现lncRNA MK5-AS1在RA中表达上调，且与ESR、CRP、RF、anti-CCP呈正相关[26]。circRNA 0088194在RA-FLS中表达上调，并与DAS28相关[27]，这与本研究结果类似，lncRNAs和circRNAs同为非编码RNA，都参与了RA发生发展，在RA患者中异常表达，且与炎症指标显著相关，此外，本文还通过ROC曲线计算得到AUC=90.53%，表明circRNA 0003353是RA的危险因素，可以作为协助诊断RA的分子标志物。故circRNA 0003353可能通过调控ESR、RF、DAS28等炎症指标参与RA发病，本团队前期研究发现TPL可以通过非编码RNA干预RA-FLS，故本研究接下来在细胞实验中，通过构建circRNA0003353过表达质粒转染至RA-FLS中，探究其机制变化及TPL干预作用。

细胞实验结果表明TPL呈时间依赖性抑制RAFLS中circRNA 0003353表达、升高抑炎细胞因子IL-4，降低促炎细胞因子IL-6、IL-17和细胞活力和迁移能力，研究表明TPL通过下调lncRNA ENST00000619282促进RA-FLS的炎症反应和细胞凋亡[18]。TPL对辅助T细胞增殖及其相关细胞因子具有抑制作用[28]。这与本研究结果相同，TPL都可降低非编码RNA的表达，且抑制FLS的炎症反应。且FLS细胞增殖、迁移能力与RA患者关节肿胀、形变相关，TPL可以抑制RA-FLS的迁移，促进细胞凋亡。此外挽救实验中转染circRNA0003353过表达质粒后，circRNA0003353可以逆转TPL对免疫炎症、细胞活力、迁移的抑制作用。JAK2/STAT3是多种细胞因子转导的重要信号通路，参与RA炎症反应、增殖和凋亡[29]。本研究通过检测p-JAK2、p-STAT3、JAK2、STAT3蛋白表达发现TPL可通过circRNA 0003353抑制pJAK2、p-STAT3表达，降低p-JAK2/JAK2、p-STAT3/ STAT3比值。研究表明TPL通过lncRNARP11-83J16.1介导URI1和β-catenin信号通路，降低RA-FLS增殖、侵袭和炎症[30]。TPL可以通过JAK2/STAT3信号通路抑制炎性细胞因子表达和FLS细胞增殖[31]，这与本研究结果类似，TPL可以通过抑制非编码RNA抑制炎症信号通路，从而抑制炎症反应。URI1和β-catenin与JAK2/STAT3信号通路都是RA经典炎症信号通路，可以影响RA疾病发展[32]。

综上所述，circRNA 0003353在RA患者中表达上调，与炎症指标存在相关性，TPL可通过调控circRNA 0003353，干预JAK2/STAT3信号通路，抑制RA-FLS炎症反应和细胞迁移，发挥治疗RA作用。接下来我们将通过动物实验进一步研究TPL在RA模型大鼠中是否存在对非编码RNA和下游靶基因的调控作用。

Biography

王杰，硕士，E-mail: 1102101651@qq.com

Funding Statement

安徽省高校协同创新项目（GXXT-2020-025）; 科技部国家重点研发计划中医药现代化研究重点专项（2018YFC1705204）; 国家自然基金面上项目（82074373，81973655）; 安徽省名中医刘健工作室建设项目（中医药发展秘[2018] 11号）; 安徽省第12批“115”创新团队（皖人才办[2019]1号）; 新安医学教育部重点实验室（2020xayx10）

Supported by National Natural Science Foundation of China (82074373, 81973655)

Contributor Information

王 杰 (Jie WANG), Email: 1102101651@qq.com.

刘 健 (Jian LIU), Email: liujianahzy@126.com.

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Articles from Journal of Southern Medical University are provided here courtesy of Editorial Department of Journal of Southern Medical University

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