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. 2022 Mar 20;42(3):405–410. [Article in Chinese] doi: 10.12122/j.issn.1673-4254.2022.03.13

甘珀酸增强RSL3对耐顺铂睾丸癌细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用

Carbenoxolone enhances inhibitory effect of RSL3 against cisplatin-resistant testicular cancer cells by promoting ferroptosis

Jiaru DU 1, Bin LI 1, Chenlu ZHU 1, Jiale HAN 1, Xuhui TONG 1,*
PMCID: PMC9010993  PMID: 35426805

Abstract

Objective

To investigate the inhibitory effect of RSL3 on the proliferation, invasion and migration of cisplatinresistant testicular cancer cells (I-10/DDP) and the effect of carbenoxolone on the activity of RSL3 against testicular cancer.

Methods

MTT assay was used to evaluate the survival rate of I-10/DDP cells following treatment with RSL3 (1, 2, 4, 8, 16 or 32 μmol/L) alone or in combination with carbenoxolone (100 μmol/L) or after treatment with Fer-1 (2 μmol/L), RSL3 (4 μmol/L), RSL3+Fer-1, RSL3+carbenoxolone (100 μmol/L), or RSL3+Fer-1+carbenoxolone. Colony formation assay was used to assess the proliferation ability of the treated cells; wounding-healing assay and Transwell assay were used to assess the invasion and migration ability of the cells. The expression of GPX4 was detected using Western blotting, the levels of lipid ROS were detected using C11 BODIPY 581/591 fluorescent probe, and the levels of Fe2+ were determined with FerroOrange fluorescent probe.

Results

RSL3 dose-dependently decreased the survival rate of I-10/DDP cells, and the combined treatment with 2, 4, or 8 μmol/L RSL3 with carbenoxolone, as compared with RSL3 treatment alone, resulted in significant reduction of the cell survival rate. The combination with carbenoxolone significantly enhanced the inhibitory effect of RSL3 on colony formation, wound healing rate (P=0.005), invasion and migration of the cells (P < 0.001). Fer-1 obviously attenuated the inhibitory effects of RSL3 alone and its combination with carbenoxolone on I-10/DDP cells (P < 0.01). RSL3 treatment significantly decreased GPX4 expression (P=0.001) and increased lipid ROS level (P=0.001) and Fe2+ level in the cells, and these effects were further enhanced by the combined treatment with carbenoxolone (P < 0.01).

Conclusion

Carbenoxolone enhances the inhibitory effect of RSL3 on the proliferation, invasion and migration of cisplatin-resistant testicular cancer cells by promoting RSL3-induced ferroptosis.

Keywords: testicular cancer, RSL3, carbenoxolone, proliferation, invasion, migration, ferroptosis

睾丸癌是20~34岁男性最常见的实体肿瘤[1]，且近几十年来全球发病率稳步上升[2]。顺铂是临床上广泛使用治疗睾丸癌的一线化疗药物[3]，虽然睾丸癌患者对以顺铂为基础的治疗效果好，但仍有一小部分年轻男性由于内在的或获得性耐药表现出对传统的治疗方式无效，最终死于进展性疾病[4]。因此，寻找新的药物或靶点提升睾丸癌患者治愈率具有重要研究意义。

铁死亡是一类以铁依赖的、脂质过氧化物积累为特征的死亡形式[5]。RAS选择性致死化合物3（RSL3）是常用的铁死亡诱导剂之一，其作用机制是通过抑制谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）造成细胞脂质过氧化物堆积而导致铁死亡的发生[6]。研究表明，铁死亡诱导剂在多种癌症类型的模型中显示出很好的抗肿瘤活性，包括非小细胞肺癌[7]、结直肠癌[8]、胶质瘤细胞[9]。急性白血病MOLM13耐药细胞株较非耐药细胞株对RSL3的抑制作用更加敏感，更容易被诱导发生铁死亡[10]。铁死亡诱导剂对肿瘤细胞铁死亡的诱导，为肿瘤治疗提供了新的思路。然而，铁死亡诱导剂RSL3对耐顺铂睾丸癌的作用尚不明确。

甘珀酸（CBX）是一种半合成药物，源自天然三萜化合物甘草次酸，能够诱导多种癌细胞凋亡和生长抑制[11]，并且甘珀酸可以提高神经母细胞瘤对依托泊苷和阿霉素的敏感性[12]。本课题组前期研究发现，甘珀酸可以影响睾丸癌敏感株I-10对顺铂的敏感性[13]。然而甘珀酸是否可以影响睾丸癌耐药株I-10/DDP对RSL3的敏感性尚未有相关研究。为此，本文旨在研究RSL3是否可以诱导耐药睾丸癌细胞（I-10/DDP）发生铁死亡以及是否影响耐顺铂睾丸癌细胞增殖、侵袭和迁移能力，并探讨甘珀酸对RSL3抗耐药睾丸癌活性的影响及其作用机制，为铁死亡诱导剂在睾丸癌治疗中的应用提供实验依据。

1. 材料和方法

1.1. 细胞株与细胞培养

耐顺铂睾丸癌细胞株（I-10/DDP）[14]采用浓度递增法诱导耐药，后续通过检测耐药指数（RI=耐药细胞系IC50/亲本细胞系IC50）>3确定其耐药性。细胞在含5% CO2的细胞培养箱中培养。

1.2. 主要试剂

RPMI 1640培养基（Biosharp）；顺铂（DDP）（Gibco）；胎牛血清（杭州四季青）；RSL3、四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、甘珀酸（SigmaAldrich）；GSH试剂盒（南京建成）；GPX4抗体（Abcam）；C11 BODIPY 581/591荧光探针（赛默飞）；FerroOrange荧光探针（DOjindo）；GAPDH（Proteintech）；胰酶、细胞裂解液（上海碧云天）；其他常用试剂均为国产分析级。

1.3. 细胞活力测定-MTT

取对数生长期细胞（I-10/DDP），以5×104 cells/mL密度接种于96孔板，待细胞长至约60%后，更换含药培养液；对于甘珀酸与RSL3的联合实验，实验分为单用RSL3组和甘珀酸合用组，RSL3浓度分别为0、1、2、4、8、16、32 μmol/L，甘珀酸浓度为100 μmol/L；对于铁死亡抑制剂ferrostatin-1（Fer-1）联合RSL3以及甘珀酸合用RSL3实验，实验分为：Control组、Fer-1（2 μmol/L）组、RSL3（4 μmol/L）组、RSL3+Fer-1组、甘珀酸（100 μmol/L）合用RSL3组、甘珀酸+RSL3+Fer-1组继续培养24 h后，添加5 mg/mL MTT溶液（10 µl/孔），在37 ℃的黑暗条件下孵育4 h。弃去培养液后每孔加入100 μL DMSO置于37 ℃烘箱中孵育30 min，酶标仪检测A490值。样品检测全程避光操作。根据公式计算细胞存活率。

1.3.

1.4. 集落克隆实验

将细胞以1500个/孔接种于六孔板，待细胞紧贴壁以后，用含药培养液培养9 d，药物分组为：Control组、甘珀酸（100 μmol/L）、RSL3（2 μmol/L）组、甘珀酸合用RSL3组；显微镜下观察集落数大于50，弃培养液，用PBS清洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min后，再用0.1%结晶紫染色30 min，并拍照。

1.5. 划痕实验

将细胞以2×105/孔铺种于6孔板，待细胞生长至80%汇合时，用200 μL枪头沿孔板中央划一条直线，用PBS清洗去除漂浮细胞，每孔加入2 mL含药无血清培养基继续培养，药物分组为：Control组、甘珀酸（100 μmol/L）组、RSL3（2 μmol/L）组、甘珀酸合用RSL3组；分别在培养0 h、24 h用显微镜拍照。划痕愈合率=（0~24 h的划痕宽度/0 h的划痕宽度）×100%。

1.6. Transwell侵袭实验

在Transwell上室内加入50 µL基质胶，置于37 ℃恒温箱中孵育30 min，待胶凝固。收集I-10/DDP细胞，用无血清RPMI 1640培养基调整为含药的细胞悬液（2× 105/mL），药物分组为：Control组、甘珀酸（100 μmol/L）组、RSL3（2 μmol/L）组、甘珀酸合用RSL3组；分别取100 µL加入上室，下室加入含10% 胎牛血清的培养液600 µL。每组设置2个复孔，实验重复3次；培养48 h后取出Transwell小室；用4%多聚甲醛室温固定30 min，结晶紫室温染色30 min。采用光学倒置显微镜（×200）下计数侵袭至微孔膜下层的细胞，每个样本观察5个视野。

1.7. Transwell迁移实验

无需在Transwell上室内铺基质胶，其余步骤同1.6。

1.8. FerroOrange荧光探针—检测细胞内Fe2+水平

取对数生长期细胞以1×105/mL的密度接种于12孔板中，培养至细胞密度为60%左右，药物处理24 h，药物分组为：Control组、RSL3（2 μmol/L）组、甘珀酸（100 μmol/L）合用RSL3组；将旧培养液倒掉，用不含血清的培养液清洗细胞2次，再加入用无血清培养液配制的1 μmol/L的FerroOrange荧光探针工作液，避光的条件下在37 ℃细胞培养箱中孵育30 min。将12孔板转移到活细胞工作站下观察细胞荧光强度，并每组随机选择视野进行拍照。

1.9. Lipid ROS检测

将细胞以2×105/mL的密度接种于六孔板，待细胞长至60%左右，药物处理24 h后，药物分组为：Control组、RSL3（2 μmol/L）组、甘珀酸（100 μmol/L）合用RSL3组；加入浓度为5 μmol/L的C11 BODIPY 581/591荧光探针避光染色。在37 ℃细胞培养箱中孵育30 min后，用无EDTA的胰酶消化细胞并收集至10 mL离心管中，1200 r/min离心8 min，再用PBS离心清洗2次。在细胞沉淀中加入300 μL PBS让细胞重悬，转移至流式管中在激发光为488 nm检测氧化态细胞数量，收集数据并保存文件，使用Flowjo进行数据分析。

1.10. Western blot检测

收集细胞，加适量增强型RIPA，冰上裂解1 h后，离心收集蛋白并定量。配制12%SDS-PAGE凝胶。将定量样品上样，电泳，转膜，封闭，一抗（GPX4）4 ℃孵育过夜，二抗（GAPDH）于室温孵育2 h，TPBS洗膜；ECT发光试剂盒暗室发光，显影；Bio-Rad凝胶成像系统采集图像，Bio Imaging system（Gene Genius）扫描灰度值定量分析。

1.11. 统计学分析

使用SPSS 20.0进行统计分析，数据表示为均数±标准差，两组之间均数比较采用两样t检验，两组以上均数比较采用单因素方差分析。统计图采用Graphpad Prism 5.0绘制，P < 0.05为差异具有统计学意义。

2. 结果

2.1. 甘珀酸增强RSL3抑制I-10/DDP细胞生长增殖的作用

MTT法检测发现甘珀酸浓度为100 μmol/L时对细胞存活率无影响，RSL3呈浓度依赖性降低细胞存活率，且在RSL3浓度2、4、8 μmol/L时，甘珀酸（100 μmol/L）合用RSL3组的细胞存活率明显低于单用RSL3组（P < 0.05图 1A）。根据MTT结果，为了保证进行侵袭、迁移实验时细胞存活率90%以上，实验中选用低浓度RSL3（2 μmol/L），后续实验包括集落以及铁死亡相关指标检测也是选用RSL3（2 μmol/L）。在甘珀酸（100 μmol/L）、RSL3（2 μmol/L）或甘珀酸合用RSL3处理后，集落克隆实验检测发现单用RSL3组集落形成数明显低于Control组；与单用RSL3组相比，甘珀酸合用RSL3组集落形成数显著进一步下降（图 1B）。

图 1.

图 1

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甘珀酸对RSL3抑制I-10/DDP细胞增殖的影响

Effect of carbenoxolone (CBX) on inhibitory effect of RSL3 on proliferation of I-10/DDP cells. A: Cell viability assessed by MTT assay. B: Colony formation assay of I-10/DDP cells at 9 days of culture. *P < 0.05 vs RSL3 (2 μmol/L), ##P < 0.01 vs RSL3 (4 μmol/L), & & P < 0.01 vs RSL3 (8 μmol/L).

2.2. 甘珀酸增强RSL3抑制I-10/DDP细胞侵袭、迁移能力的作用

I-10/DDP细胞在甘珀酸（100 μmol/L）、RSL3（2 μmol/L）或甘珀酸合用RSL3处理后，划痕实验和Transwell迁移实验发现，与Control组相比，RSL3组划痕愈合率减小、穿膜细胞数减少（P=0.012，图 2A；P < 0.001，图 2B）；与单用RSL3组相比，甘珀酸合用RSL3组划痕愈合率进一步减小、穿膜细胞数进一步减少（P= 0.005，图 2A；P=0.001，图 2B）。Transwell侵袭实验发现，与Control组相比，RSL3组穿膜细胞数减少（P < 0.001，图 2C）；与单用RSL3组相比，甘珀酸合用RSL3组穿膜细胞数进一步减少（P=0.002，图 2C）。

图 2.

图 2

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甘珀酸对RSL3抑制I-10/DDP细胞侵袭、迁移能力的影响

Effect of carbenoxolone (CBX) on inhibitory effects of RSL3 I-10/DDP cell invasion and migration. A: Wounding-healing assay. B: Transwell assay for assessing migration of I-10/DDP cells. C: Transwell assay for assessing invasion ability of I-10/DDP cells. *P < 0.05, ***P< 0.001; ##P < 0.01, ###P< 0.001.

2.3. 甘珀酸促进RSL3诱导I-10/DDP细胞的铁死亡

本实验选用较高浓度RSL3（4 μmol/L），MTT法观察发现铁死亡抑制剂ferrostatin-1（Fer-1）可以逆转RSL3（4 μmol/L）、甘珀酸（100 μmol/L）合用RSL3对I- 10/DDP细胞的增殖抑制作用（P=0.001, P < 0.001，图 3A）。I-10/DDP细胞经单用RSL3（2 μmol/L）、甘珀酸（100 μmol/L）合用RSL3处理24 h后，Western blot检测出，与Control组相比，单用RSL3组GPX4的表达水平下降，而与单用RSL3组相比，甘珀酸合用RSL3组GPX4的表达水平明显下降（P=0.001, P=0.01，图 3B）；C11 BODIPY 581/591荧光探针处理细胞后，使用流式细胞术检测发现，相比于Control组，单用RSL3组细胞中lipid ROS的表达水平增加，而与单用RSL3组相比，甘珀酸合用RSL3组细胞中lipid ROS水平明显增加（P=0.001, P=0.001，图 3C）；FerroOrange荧光探针检测细胞内Fe2+水平，橙色荧光越强代表Fe2+水平越高，相比于Control组，单用RSL3组荧光强度增强，而与单用RSL3组相比，甘珀酸联合RSL3处理后细胞释放出更强的荧光（图 3D）。

图 3.

图 3

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甘珀酸对RSL3诱导I-10/DDP细胞铁死亡的影响

Effect of carbenoxolone on ferroptosis of I-10/DDP cells induced by RSL3. A: Cell viability evaluated by MTT assay. 1: Control; 2: Fer-1; 3: RSL3; 4: RSL3+Fer-1; 5: CBX+RSL3; 6: CBX+RSL3+Fer-1. B: Western blotting for detecting the expression of GPX4. C: Cellular lipid ROS level analyzed with flow cytometry. D: Cellular Fe2+ level determined using FerroOrange. **P < 0.01, #P < 0.05, ##P < 0.01, & & & P< 0.001.

3. 讨论

睾丸癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，20世纪70年代在临床治疗中引入了顺铂[15]，使睾丸癌患者的生存率得到了提高，但目前仍然存在限制顺铂治疗的两个主要因素为药物引起的包括肾毒性、耳毒性和肝毒性在内的不良反应[16]，以及肿瘤耐药性的发生。因此，探索新的治疗方案对睾丸癌患者至关重要。

铁死亡是新近发现的一种程序性死亡形式，与凋亡、坏死、自噬等死亡程序不同，典型的形态学表现为细胞容积皱缩、线粒体嵴减少等[17]。最近的研究表明，激活铁死亡能有效地阻止肿瘤的进展，并能提高靶向治疗和化疗的疗效[18]。然而，睾丸癌与铁死亡的关系尚不明了。深入研究铁死亡与睾丸癌之间的作用关系可能为治疗睾丸癌提供一种全新的思路。RSL3是铁死亡最常用的诱导剂之一，目前研究表明其可以在多种肿瘤中诱导铁死亡并抑制肿瘤细胞的生长，包括肾癌[19]、结直肠癌[20]、前列腺癌[21]等。RSL3是否可以诱导耐药睾丸癌I- 10/DDP细胞发生铁死亡以及是否可以抑制I-10/DDP细胞增殖、侵袭和迁移能力尚未有研究报道。我们采用RSL3处理I-10/DDP后，结果发现，细胞增殖能力、侵袭和迁移能力显著降低，这表明RSL3可以抑制睾丸癌耐药株I-10/DDP细胞活力。同时，为了验证RSL3致I- 10/DDP细胞死亡的模式为铁死亡，我们将铁死亡抑制剂Fer-1与RSL3联用，观察RSL3对细胞的抑制作用是否能被逆转。Fer-1是一种铁死亡强效抑制剂，可以通过抑制脂质活性氧的生成而抑制铁死亡的发生[22]。结果显示Fer-1能逆转RSL3降低细胞存活率的作用，证明RSL3诱导的细胞死亡模式为铁死亡。铁死亡的发生与Fe2+水平以及脂质活性氧的生成密不可分。细胞内游离的Fe2+在芬顿反应中与过氧化氢结合产生过多的羟基自由基和ROS，从而导致多不饱和脂肪酸被氧化，产生过多的脂质过氧化物从而导致铁死亡[23]。GPX4是铁死亡的主要调节因子之一[24]，其利用谷胱甘肽将有毒的脂质过氧化物转化为无毒的脂质醇，减少脂质过氧化物积累从而负性调控铁死亡[25]。本实验在铁死亡指标中，与Control组相比，RSL3可使I-10/DDP细胞内GPX4表达下降、Lipid ROS和Fe2+水平升高，以上结果更进一步说明RSL3可以诱导I-10/DDP发生铁死亡。上述结果提示铁死亡诱导剂在睾丸癌患者的临床治疗上具有一定前景。

甘珀酸是一种盐皮质激素激动剂，它已被临床批准用于治疗食管溃疡[26]。除了抗炎作用外，甘珀酸也存在抗肿瘤作用。甘珀酸通过抑制细胞凋亡抑制蛋白BIRC5/ survivin，从而在K562白血病细胞中引发细胞凋亡，并且可以增强TRAIL诱导的人神经胶质瘤细胞凋亡[27]。甘珀酸还可以提高神经母细胞瘤对依托泊苷和阿霉素的敏感性。而甘珀酸是否参与铁死亡进程以及是否也可以增加I-10/DDP细胞对RSL3敏感性尚未有研究。我们采用甘珀酸联合RSL3共同处理I-10/DDP细胞，结果显示，甘珀酸合用RSL3组与单用RSL3组相比，I-10/ DDP细胞的增殖、侵袭和迁移能力明显进一步下降，这表明甘珀酸可以增强RSL3的抗肿瘤活性。为了进一步探究甘珀酸是否是通过促进RSL3诱导的铁死亡从而增敏RSL3，本实验检测Fer-1能逆转甘珀酸合用RSL3降低细胞存活率的作用；同时检测铁死亡相关指标，甘珀酸合用RSL3组与单用RSL3组相比，I-10/DDP细胞内GPX4蛋白表达水平降低、lipid ROS水平升高、Fe2+水平升高，得出甘珀酸促进RSL3诱导的铁死亡。

综上所述，RSL3能够诱导耐药睾丸癌细胞发生铁死亡，并可以抑制耐顺铂睾丸癌细胞增殖、侵袭和迁移能力；甘珀酸通过促进RSL3诱导的铁死亡从而增强RSL3的抑制作用。单用RSL3或者合用甘珀酸可能是一种有前景的治疗睾丸癌策略。甘珀酸是否通过抑制Pannexins通道增加RSL3诱导的铁死亡水平，课题组后期将对此具体机制进行深入研究，从而为睾丸癌的临床治疗提供理论依据。

Biography

杜家如，在读硕士研究生，E-mail: 1723475013@qq.com

Funding Statement

安徽省自然科学基金（2008085MH275）；蚌埠医学院512人才培育计划（BY51201210）；蚌埠医学院研究生科研创新训练项目（Byycx21029）；蚌埠医学院大学生创新训练项目（202110367064）

Contributor Information

杜 家如 (Jiaru DU), Email: 1723475013@qq.com.

童 旭辉 (Xuhui TONG), Email: bbmctxh@126.com.

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