原位3D生物打印技术在骨和软骨损伤修复中的研究进展

Abstract

Objective

To review the research progress of in-situ three dimensional (3D) bio-printing technology in the repair of bone and cartilage injuries.

Methods

Literature on the application of in-situ 3D bio-printing technology to repair bone and cartilage injuries at home and abroad in recent years was reviewed, analyzed, and summarized.

Results

As a new tissue engineering technology, in-situ 3D bio-printing technology is mainly applied to repair bone, cartilage, and skin tissue injuries. By combining biomaterials, bioactive substances, and cells, tissue is printed directly at the site of injury or defect. At present, the research on the technology mainly focuses on printing mode, bio-ink, and printing technology; the application research in the field of bone and cartilage mainly focuses on pre-vascularization, adjusting the composition of bio-ink, improving scaffold structure, printing technology, loading drugs, cells, and bioactive factors, so as to promote tissue injury repair.

Conclusion

Multiple animal experiments have confirmed that in-situ 3D bio-printing technology can construct bone and cartilage tissue grafts in a real-time, rapid, and minimally invasive manner. In the future, it is necessary to continue to develop bio-inks suitable for specific tissue grafts, as well as combine with robotics, fusion imaging, and computer-aided medicine to improve printing efficiency.

由外伤、疾病或肿瘤切除导致的大段骨和软骨损伤大多超过骨自身愈合能力，需要手术修复重建^[1-4]。临床常用手术方法包括自体/同种异体骨移植、软骨移植、带血管蒂骨移植以及关节置换等^[5-8]。上述骨、软骨移植修复方法存在供区组织有限、额外手术损伤、疾病传播等问题^[9-13]，关节置换只适用于晚期软骨退变且假体价格昂贵^[14]。3D生物打印技术是在体外将生物材料、活细胞及其他生物活性物质层层打印构建移植体，有望代替上述修复方法^{[5, 14-15]}。但由于打印的移植体难以完美匹配缺损形状，植入前需对缺损部位进行额外的外科清创术以适配移植体形状，以及存在感染风险等问题，限制了该技术在骨科领域的进一步应用发展^[16-18]。

鉴于此，学者们提出了原位3D生物打印技术，即基于缺损部位扫描结果，将患者细胞与生物材料、生物活性因子等直接在该部位进行打印，制成的移植体能精确适应目标缺损部位^{[2, 19]}。该技术主要包括打印设备、生物墨水、打印技术等要素^[20]。目前，原位3D生物打印技术的研究主要集中于骨、软骨和皮肤组织损伤等方面，将其临床转化还存在诸多问题。现对该技术在骨和软骨损伤修复方面的研究进展作一综述，分析未来发展方向，以期为后续研究提供参考。

1. 研究文献检索

从CNKI、万方数据、维普、ScienceDirect、Nature、Springer、PubMed、Web of Science等数据库检索，以“原位3D生物打印”、“骨修复”、“软骨修复”、“组织工程”、“In situ 3D bioprinting”、“Bone repair”、“Cartilage repair”、“Tissue engineering”作为关键词，检索时间为2021年12月26日。共检索到11 778篇参考文献，排除与文章主题相关性较差的10 081篇文献、内容重复的1 609篇文献、观点不明确的14篇文献及无法获取文献全文的6篇文献，最终获得68篇文献。

2. 研究结果

2.1. 原位3D生物打印技术简介

2.1.1. 打印过程

原位3D生物打印过程主要包括3个阶段。首先，采用3D扫描仪、CT、MRI和超声成像等手段采集图像^[8]。然后，将图像数据导入计算机辅助设计/制造软件，获得生物打印机可读取和处理的文件^{[12, 21-22]}。最后，将患者细胞和生物材料按照规划的打印路径在缺损部位打印移植体^[23]。

2.1.2. 打印模式

原位3D生物打印模式分为手持式及机器人两种。前者采用可以直接打印的便携式打印设备，形状类似注射器，具有尺寸小、便于在缺损内部和周围移动、易于消毒、成本相对较低的优势^[17]。但由于设备由术者操纵，打印目标形状完全依赖于术者控制^[24-25]，因此该模式难以设计并打印复杂结构移植体，也难以实现多种生物材料打印，仅适用于位置表浅、结构简单的小缺损。

机器人模式类似于传统3D生物打印技术，打印的移植体结构由计算机辅助设计，打印时术者只需操控系统控制台，生物打印单元的运动由三轴便携式系统驱动^[24]。该模式可以较好地解决缺损解剖定位以及复杂组织结构设计的问题。有学者提出将上述两种模式结合起来，可以更加灵活、有效地打印复杂组织结构移植体^[17]。

2.1.3. 打印介质

生物墨水被定义为可生物打印的介质，包括生物材料、细胞、功能因子等^[26-27]。理想的生物墨水可打印性强，具有高稳定性、不溶于细胞培养基、无毒、无免疫原性，并能促进细胞黏附等特性^[28]。

常用的生物材料为藻酸盐水凝胶、胶原蛋白和透明质酸等有机溶液^{[12, 14, 29]}。其中，藻酸盐水凝胶具有良好的生物相容性，在紫外线照射下可调节硬度，能形成有利于细胞再生的多孔结构^[14]。透明质酸钠水凝胶可以刺激软骨细胞代谢、合成软骨基质成分、抑制炎症过程等，常用于修复软骨缺损^[30-31]。目前正在开发的新型多材料生物墨水不仅可打印性提高，机械阻力和刚度等特性也得到增强，同时还能添加对细胞行为和组织形成有显著影响的生物活性成分^[32-34]。例如，由聚乙二醇-二丙烯酸酯和变性纤维蛋白原组成的无细胞水凝胶，具有良好的生物相容性、生物降解性、高度水合微环境等^[35-37]。此外，可渗透细胞和可注射的明胶水凝胶可以封装细胞和药物，作为水凝胶前体溶液直接输送至缺损部位，并进行原位凝胶化^[38-39]。

支架是将生物材料经不同打印技术制成的三维结构框架，其需要模拟天然骨、软骨等组织的结构，创造类似细胞外基质环境，为细胞和组织提供良好的生存环境，进而诱导和调节细胞附着、增殖、迁移和分化^[40-41]。基于此，生物相容性好的生物材料是制备支架的理想选择^[42]，学者们进行了大量研究，从最初的纯生物材料支架、复合支架，到近期的负载特定功能细胞和蛋白质的支架^[43-44]。目前新兴的四维支架是指由形状记忆聚合物构建、能随时间和刺激因素改变动态模仿组织结构功能的三维混合支架。其中，形状记忆聚合物是一种可以根据湿度、温度、电、磁和光等刺激因素改变自身特性的材^{[39, 45]}。有研究将BMSCs包裹的温敏性羟丙基甲壳质水凝胶注入3D打印聚己内酯/纳米羟基磷灰石支架中，获得的复合支架显示出优异的抗压强度，并能刺激巨噬细胞分泌血管生成和骨诱导生长因子，创造了有利于血管和骨生成的微环境^[32，46]。

2.1.4. 打印技术

在选择适合目标组织和器官的原位3D生物打印技术时，打印分辨率、打印速度和兼容生物墨水材料的数量是需要考虑的关键因素^[26]。根据打印系统所利用的能量和打印方式，目前打印技术可以分为基于挤压的生物打印、基于液滴/喷墨的生物打印、激光辅助生物打印、基于还原聚合的生物打印^[47]、生物电喷雾和细胞电喷雾生物打印。

① 基于挤压的生物打印：该技术通过气动或机械挤压系统将生物墨水从喷嘴中连续挤出，打印成设计的三维结构^{[12, 17]}。其优点包括沉积和打印速度快以及能获得多孔结构；缺点为由于分辨率有限，降低了打印介质模拟形状的能力和形成组织的精度^{[5, 12]}。其中，低温挤压打印技术在改善支架多孔结构、生物可降解性和生物活性方面具有优势^{[41, 46]}，有望成为制造高孔隙率支架的一种候选工具^[7]。

② 基于液滴/喷墨的生物打印：该技术是通过热或声学方式将生物墨水喷洒至组织缺损处以构建移植体，减少了与组织的直接接触^[39]，通常用于打印组织和器官。该打印方式可以在非水平面进行打印，这对将原位3D生物打印技术用于修复复杂组织损伤具有重要意义。该技术主要缺点是生物墨水必须处于液态，并具有适当黏度，以便从喷嘴小孔中喷出^[12]。

③ 激光辅助生物打印：该技术是基于激光诱导正向转移原理，采用高能激光脉冲使生物墨水薄层中产生高压气泡，然后将其喷射到指定位置^{[2, 12]}。该技术的优势在于无需与打印机直接接触，避免了机械应力；在手术室无菌环境中，医生可以指导全自动机器人打印机实现微米到毫米级别的细胞植入^[48]，具有分辨率和精度高的优势，生物墨水可以更准确地打印至缺损部位^{[2, 48]}。但是，打印过程中细胞会暴露于紫外线，可能产生一些负面作用^{[5, 12]}。

④ 基于还原聚合的生物打印：该技术包括立体平版印刷、数字光处理和连续数字光处理，是利用光源（激光束、激光投影或双光子激光）选择性地交联载有细胞的可光固化聚合物溶液^[26]。基于光的生物打印比基于挤压的生物打印更快，分辨率更高^[49]，但具有与激光辅助生物打印相似的缺点，光固化反应涉及的紫外线通常对封装细胞有害^{[17, 50]}。考虑到应用于原位打印，紫外线和可见光需要更强的穿透能力，以实现在组织深处固化打印结构，或必须进行逐层连续曝光^{[17, 48]}。Chen等^[51]研发了一种基于数字近红外线聚合的3D生物打印技术，该技术能够对组织结构进行无创的原位体内3D生物打印。

⑤ 生物电喷雾和细胞电喷雾生物打印：该技术是利用两个带电电极之间的电场来连续排出生物墨水^[39]。有学者对它能否进行原位3D生物打印持怀疑态度，因为打印过程中需要使用高电压。然而，有研究显示打印时其电流很低，不会对生物墨水和患者缺损周围组织产生危害，支持其可用于原位3D生物打印^[12]。

2.2. 原位3D生物打印技术在骨损伤领域的应用

原位3D生物打印技术作为一种新兴的组织工程技术，可通过使用天然或合成生物材料在缺损部位直接打印移植体刺激骨再生，可作为骨移植的替代选择^[52-54]。Vidal等^[13]的研究通过原位打印预血管化合成骨移植体修复15 mm临界尺寸兔尺骨缺损，8周后CT和组织学检查显示，预血管化合成骨移植体的骨再生率明显高于不带血管的人工骨。Kérourédan等^[2]通过原位打印人脐静脉内皮细胞改善了小鼠颅骨缺损中的血管化和骨再生，也从一方面验证了原位打印预血管化移植体促进骨再生的结论。

此外，原位骨再生迫切需要具有均匀互连孔结构、合适的机械性能、优异的生物相容性，以及更强刺激成骨能力的可生物降解聚合物支架^[53]。Ma等^[44]采用空气驱动挤压3D生物打印技术，开发了一系列具有不同含量聚丙烯的可生物降解哌嗪基聚氨酯尿素支架。首次证实小分子哌嗪具有以剂量依赖方式调节成骨细胞的能力，并且与聚氨酯尿素结合后具有更好的生物相容性和骨传导性，共同增强了哌嗪基聚氨酯尿素支架的新骨形成能力。Wu等^[55]模拟具有高孔隙率的天然木材微/纳米结构层次，将3D生物打印技术与水热工艺相结合，制备了具有微/纳米晶须涂层的层次化多孔磷酸钙陶瓷骨组织工程支架。Zhang等^[41]采用低温原位3D生物打印技术构建负载氧化石墨烯和成骨肽的新型多孔支架修复临界尺寸骨缺损。体外实验以及动物体内实验表明，层次化多孔结构界面是细胞活性和分化的重要调节因素^[53]。以上研究中的多层仿生支架展现了良好的骨诱导活性，有利于支架中细胞的存活，是一种具有临床应用前景的支架生物材料。

然而，临床上还有很多伴有多种病理改变的骨组织损伤，需要支架负载相应治疗药物，以达到修复缺损同时进行支持治疗的目的。为此，Feng等^[38]开发了一种独特的可注射明胶水凝胶，在激素性股骨头坏死动物模型中，通过原位注射包裹BMSCs和淫羊藿素的可注射水凝胶，有效地防止了骨密度降低并促进了骨形成。该研究首次证明了应用可注射水凝胶作为治疗药物载体的可行性，为后续临床应用提供了新方向，如可携带不同治疗药物和细胞，通过在深层和封闭的解剖位置进行微创手术治疗各种临床疾病。

总的来说，骨再生高度依赖于充足的血管系统，支架植入体内后早期新生的血管能促进细胞增殖、组织向内生长^[56]，随后是骨矿化和再生，而血管浸润稀少和缺氧常导致移植体中心坏死或表现为纤维包裹的骨整合失败^[57]。上述研究尝试了预血管化、多层仿生以及负载生物活性成分等多种方法来提高支架生物活性，以抵消合成聚合物所具有的惰性，并创造一个微环境试图招募、调节局部干细胞，以实现原位血管化骨再生和提高移植体骨整合能力。究其根本，血管内皮细胞和骨形成相关细胞之间交互的微环境可能在血管化骨再生中扮演着重要角色，为此有待进一步构建一种具有生物指导意义的微环境，以促进原位血管化骨再生，从而增强移植体骨整合能力。介导H型血管形成、负载富含生物活性成分的囊泡^[58]等可作为研究方向。原位3D生物打印技术在骨损伤领域的应用研究详见表1。

表 1.

Application ofin-situ 3D bio-printing technology in the field of bone injury

原位3D生物打印技术在骨损伤领域的应用

打印模式 Printing mode	打印技术 Printing technology	生物材料 Biomaterial		活性成分 Active ingredient		动物模型 Animal model		结果 Result		参考文献 Reference
机器人模式	基于挤压的生物打印	15%β-磷酸三钙和含镁的硅灰石		−		新西兰兔颅骨缺损模型		植入后 12 周新生骨组织明显增加		Shao等[53]
机器人模式	基于挤压的生物打印	可注射甲基纤维素-磷酸钙纳米复合水凝胶		BMSCs		新西兰大白兔颅骨缺损模型		植入后 8 周可观察到新骨形成		Kim等[36]
机器人模式	基于挤压的生物打印（空气驱动）	哌嗪基聚氨酯尿素		小鼠颅骨前成骨细胞（MC3T3-E1）		12 周龄雄性 SD 大鼠胫骨缺损模型		植入后 8 周可观察到新骨形成		Ma等[44]
机器人模式	基于挤压的生物打印	甲基丙烯酸明胶、海藻酸钠和聚乙二醇二丙烯酸酯		−		雄性巴马小型猪胫骨中段缺损模型		植入后 12 周骨形成质量更高		Li等[56]
机器人模式	基于挤压的生物打印	氧化石墨烯和 BMP-2 和 β-磷酸三钙复合		大鼠 BMSCs		雄性 Wistar 大鼠临界尺寸颅骨缺损模型		植入后 12 周观察到更多骨形成		Zhang等[41]
机器人模式	激光辅助生物打印	含有 MSCs 和 VEGF 的胶原蛋白		人脐静脉内皮细胞		小鼠颅骨缺损模型		增强骨缺损血管化，促进骨再生		Kérourédan 等[2]
机器人模式	−	双相磷酸钙颗粒		基质血管部分		成年雌性新西兰兔尺骨缺损模型		植入后 8 周带血管蒂的人工骨促进尺骨缺损愈合		Vidal等[13]
手持式模式（G21针）	−	载淫羊藿素的可注射明胶水凝胶		人BMSCs		大鼠激素性股骨头坏死模型		植入后6周骨缺损处更多BMSCs，促进新骨形成		Feng等[38]

2.3. 原位3D生物打印技术在软骨损伤领域的应用

骨关节炎、衰老和关节创伤导致的软骨损伤，是关节疼痛和慢性致残的主要原因^{[30, 59]}。而成熟软骨损伤相较于骨损伤因缺乏血管、神经和淋巴管供应，常难以自然愈合^[60-62]。目前，关节镜手术、软骨细胞移植、自体骨软骨移植和镶嵌成形术是治疗国际软骨修复协会软骨损伤分级系统（ICRS）Ⅲ～Ⅳ级软骨缺损的常用方法^{[49, 59]}。然而对于晚期软骨退变，由于受到供区并发症发生率高、宿主结合不良，以及再生组织为纤维软骨而不是透明软骨等限制^[63]，关节置换术是主要治疗方法^[35]，但存在高度侵入性、手术复杂和费用较高等不足^[14]。

软骨组织工程为骨关节炎或创伤损伤的关节软骨再生提供了新的选择^{[59-60, 62]}。如Gatenholm等^[64]通过3D扫描仪扫描人工全膝关节置换术中取出的有软骨缺损的骨关节炎胫骨平台，使用含人软骨细胞的打印介质对缺损部位进行原位打印，观察到良好的软骨细胞分化现象，为软骨组织工程用于软骨缺损或早期骨关节炎的治疗提供了有力证据。不过软骨功能的发挥依赖于细胞外基质的双相性质^{[15, 35]}，结构复杂难以模拟。为此，3D打印混合软骨结构多采用疏水聚己内酯（用于结构支持）和高度亲水的浸渍细胞海藻酸盐水凝胶（水合和生物功能）模拟关节软骨细胞外基质的双相性质，动物实验证明该3D打印混合软骨结构移植体能维持细胞活力始终在70%以上，软骨特异性细胞外基质分泌随时间延长显著增加^[22]。

原位3D生物打印技术的一个重要挑战是维持活细胞活力、生长因子敏感性和生物活性物质的活性^{[61- 62]}。Ma等^[24]发明了一种手持式3D打印设备（Biopen），它可以将生物支架和培养细胞同时直接挤压至软骨缺损处。Biopen允许以手动、直写方式同时同轴沉积活细胞和生物材料^[39]。同轴策略是指在空间上划分了一个有利于适当硬度要求的固相和一个黏性液相，通过将在固相内发生交联反应的细胞毒性化学副产物与来自液相的细胞分离，提高细胞的生存能力^{[40, 61]}。同时，Duchi等^[19]研究表明，同轴挤出有利于在高强度紫外线照射下快速光交联，从而沉积出含活细胞的明胶微球/羟基磷灰石水凝胶，进而原位打印出可行生物合成的软骨修复结构。此外，该研究首次将核/壳沉积原理与原位打印应用于临床肌肉骨骼组织如软骨的修复，从而减少手术前基于实验室生物制造的耗时步骤^[50]。

然而当使用单一支架时，随着水凝胶降解，结构完整性丧失，这可能损害包裹的细胞，并损伤周围软骨组织，不利于将原位打印用于治疗局部组织缺损^{[61, 65]}。为了克服上述缺点，Zhu等^[61]研究了一种基于混合支架的微创方法，该支架包含一种缓慢降解并能提供支撑的临时结构，填充在该结构中的软骨细胞负载水凝胶促进新组织形成。Aisenbrey等^[49]的研究选择立体平版印刷3D打印制造三维支撑结构，选择由光聚合反应制备的聚乙二醇水凝胶作为负载细胞的水凝胶，选取猪膝关节软骨缺损模型进行实验，4周后用混合支架处理的软骨缺损附近区域硫酸化糖胺聚糖保留率高。

多项研究表明，软骨下骨同时再生对于骨软骨缺损修复非常重要，因为它可以为软骨提供机械支撑^[63]。然而，到目前为止，实现两种不同组织同时再生仍然是一个挑战。Shen等^[59]提出了一种结合大孔纤维蛋白和硅灰石（含8%氧化镁）的双相支架，分别用于软骨和软骨下骨的再生，而不涉及其他生物活性分子。体外及动物体内实验证明，无论是否加载BMSCs都可以在很大程度上诱导软骨和软骨下骨的再生。因此，双相支架具有很好的应用前景，特别是通过进一步优化结构，如在两层之间构建梯度层，以及通过一些生物活性肽或细胞生长因子对其进行功能化处理，以诱导细胞侵袭和在支架内优先分化，从而在骨软骨再生中发挥更加积极的作用。

相较于骨组织而言，软骨损伤因缺乏血管、神经和淋巴管供应，往往对修复材料的特性要求更复杂。既往研究中将同轴沉积打印和负载生物活性因子的混合、双相支架用于软骨损伤修复，展现出了可喜的结果^[66-67]。近年来，研究表明多孔结构支架表面能增强营养运输、细胞渗透、细胞黏附和支持细胞增殖，进而支持软骨组织形成^[68]。因此，有必要进一步将多孔结构支架进行适当表面修饰，通过促进营养供应、细胞黏附、细胞扩散和软骨形成分化来增强支架的生物活性。上述所涉及到的原位3D生物打印技术在软骨损伤领域的具体应用研究详见表2。

表 2.

Application of in-situ 3D bio-printing technology in the field of cartilage injury

原位3D生物打印技术在软骨损伤领域的应用

打印模式 Printing mode		打印技术 Printing technology		生物材料 Biomaterial		活性成分 Active ingredient		动物模型 Animal model		结果 Result		参考文献 Reference
机器人模式（AutoCAD）		−		丝素蛋白和明胶		大鼠BMSCs		成年雄性新西兰大白兔		具有更高的软骨形成能力		Shi等[62]
机器人模式		基于挤压的生物打印		大孔纤维蛋白和硅灰石（含8%氧化镁）		新西兰大白兔BMSCs		新西兰大白兔膝关节		植入 18 周后细胞种植组缺损表面形成一层软骨样组织，与软骨下骨连接良好		Shen等[59]
机器人模式（六自由度）		激光辅助生物打印		透明质酸甲基丙烯酸酯		−		雌性新西兰兔膝关节		12周后软骨损伤修复		Ma等[24]
手持式模式（Biopen）		基于挤压和基于还原聚合的生物打印（光交联）		甲基丙烯酰明胶/透明质酸甲基丙烯酸酯		髌下脂肪衍生MSCs/ 基质细胞		−		同轴结构中大量的活细胞（>95%）		Duchi等[50]
手持式模式（Biopen）		基于挤压的生物打印		明胶甲基丙烯酰胺/ 透明质酸甲基丙烯酸酯水凝胶		MSCs		雄性美利奴羊膝关节		新生软骨较多		Di Bella等[18]
手持式模式		基于还原聚合的生物打印（光交联）		明胶甲基丙烯酰胺/ 透明质酸甲基丙烯酸酯水凝胶		人脂肪干细胞		−		具有高细胞活力的核/壳生物支架		Duchi等[19]
手持式模式		基于还原聚合的生物 打印（立体平版印刷）		聚乙二醇水凝胶		基质金属蛋白酶 2、软骨细胞		猪膝关节		在缺损附近区域显示出更高的硫酸化糖胺聚糖保留率		Aisenbrey 等[49]
手持式模式		基于挤压的生物打印		聚乳酸-羟基乙酸		雄性新西兰大白兔富血小板血浆		4～5 月龄兔膝关节严重骨软骨缺损模型		植入 12 周后再生部位以新形成的透明软骨组织为主，修复部位关节表面光滑		Chang等[63]

3. 总结与展望

作为一种新兴的组织工程技术，凭借体内微环境比体外含有更多信号分子，原位3D生物打印移植体的成熟性、功能和整合性比体外构建组织更好。当前研究主要通过预血管化，调整生物墨水组成，改善支架结构、打印方式，负载药物、细胞和生物活性因子等方式来促进骨和软骨组织损伤修复。上述方法的有效性在体外及动物实验中得到证实，但临床转化应用有待进一步研究。

迄今为止，相关研究已验证了原位3D生物打印技术的可行性和实用性，采用该技术构建的移植体有望解决移植组织和器官短缺问题，以及患者对实时设计的新组织和器官的特定需求，其在临床上的应用可能会提高预后、缩短恢复时间和住院时间，减少感染发生。未来需要不断开发和优化适应于原位打印的生物墨水和生物打印机，进一步验证其生物相容性、装置的安全性和无菌性，以及尽可能减少需术者控制的打印参数，以增强打印单元的稳定性、一致性和打印结构的可重复性，确保打印精度和手术质量。并且在原位3D生物打印中使用刺激响应生物墨水，可能会再现组织的自然形态和结构变化。此外，机器人技术、融合成像和计算机辅助医疗干预也可用于临床原位3D生物打印过程，以进一步提升打印效果。

利益冲突　在文章撰写过程中不存在利益冲突

作者贡献声明　裴志伟：查阅文献、整理数据和论文撰写；王建忠：文章审阅并参与观点形成，对文章修改提出建设性意见