不同肠内营养开始时间对极低出生体重儿肠道菌群及代谢产物影响的前瞻性研究

Abstract

Objective

To study the influence of enteral feeding initiation time on intestinal flora and metabolites in very low birth weight (VLBW) infants.

Methods

A total of 29 VLBW infants who were admitted to the Department of Neonatology, Children's Hospital of Chongqing Medical University, from June to December, 2020, were enrolled as subjects. According to the enteral feeding initiation time after birth, the infants were divided into two groups: <24 hours (n=15) and 24-72 hours (n=14). Fecal samples were collected at weeks 2 and 4 of hospitalization, and 16S rDNA high-throughput sequencing and gas chromatography-mass spectrometry were used to analyze the microflora and short-chain fatty acids (SCFAs) respectively in fecal samples.

Results

The analysis of microflora showed that there was no significant difference between the two groups in Chao index (reflecting the abundance of microflora) and Shannon index (reflecting the diversity of microflora) at weeks 2 and 4 after birth (P>0.05). The analysis of flora composition showed that there was no significant difference in the main microflora at the phylum and genus levels between the two groups at weeks 2 and 4 after birth (P>0.05). The comparison of SCFAs between the two groups showed that the <24 hours group had a significantly higher level of propionic acid than the 24-72 hours group at week 4 (P<0.05), while there was no significant difference in the total amount of SCFAs and the content of the other SCFAs between the two groups (P>0.05).

Conclusions

Early enteral feeding has no influence on the diversity and abundance of intestinal flora in VLBW infants, but enteral feeding within 24 hours can increase the level of propionic acid, a metabolite of intestinal flora.

肠道是人类微生物种群最多、最复杂的部位，在成人肠道内有400多种细菌，总数达1×10¹⁴个。肠道菌群对宿主整个生命周期的健康发挥重要作用，通过对肠道菌群动态变化的检测，可以反映出宿主发育的轨迹。研究表明，肠道菌群与新生儿发育和免疫系统的形成密切相关，生命早期肠道菌群的结构、相对丰富度及其代谢产物短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）影响儿童日后患疾病的概率^［1］。因此，监测肠道菌群在生命早期的变化具有重要的临床意义。而新生儿生后肠道菌群定植受多种因素影响，如出生方式、喂养方式、胎龄和抗生素应用等，尤其是喂养方式，其中肠内营养开始时间的早晚直接影响了新生儿期肠道菌群的建立^［2］。极低出生体重儿（very low birth weight infant，VLBWI）由于消化系统未成熟，常需静脉营养支持以满足基本营养需要，但也容易发生院内感染和由深静脉置管引起的并发症^［3］。故指南推荐VLBWI营养策略是在保证安全的前提下，尽早建立肠内营养，尽快达到足量全肠内喂养^［4］。然而，目前VLBWI肠内营养开始时间存在争议，且开始时间“早”或“晚”的定义尚不统一，过早易导致喂养不耐受、坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC）的发生，而延迟喂养又可能影响胃肠道的发育^［5-6］。故本研究通过前瞻性地观察VLBWI肠内营养开始时间，探讨不同肠内营养开始时间对肠道菌群及其代谢产物的影响，为寻找适宜的VLBWI肠内营养开始时间提供参考依据。

1. 资料与方法

1.1. 研究对象

前瞻性选取重庆医科大学附属儿童医院新生儿科2020年6~12月收治的VLBWI为研究对象。纳入标准：（1）胎龄<30周；（2）出生体重<1 500 g；（3）日龄<24 h；（4）纯母乳喂养。排除标准：（1）住院期间死亡或放弃治疗者；（2）入院诊断为NEC（Bell分期Ⅱ期及以上）、食物蛋白过敏性肠炎、乳糖不耐受等能够影响肠道菌群的消化道疾病者；（3）合并先天性消化道畸形者；（4）未完成粪便菌群及SCFAs测定者；（5）不愿参加本研究者。共纳入29例患儿，根据生后肠内营养开始时间（开奶时间）不同分为<24 h组（n=15）和24~72 h组（n=14）。

本研究通过由我院伦理委员会批准（No.2021-67），并签署了家属知情同意书。

1.2. 肠内及肠外营养方案

参照2015年加拿大VLBWI喂养指南^［4］，生后24 h内开始静脉营养支持，并根据患儿病情和喂养是否耐受择期进行肠内营养。（1）肠内营养：采用母乳喂养、经管饲喂养；间歇喂养每3 h 1次；开始喂养量10~20 mL/(kg·d)，缓慢增加，增加速度15~20 mL/(kg·d)，直至达到全肠内营养150 mL/(kg·d)。病情稳定、无喂养禁忌证者，生后24 h内开始喂养，通过胃内回抽残余奶量的方式判断消化吸收情况，若3 h后胃残余量超过前1次喂养量的50%，并伴有呕吐和/或腹胀，则视为喂养不耐受，予暂禁食，次日9点再试喂1次；反之为喂养耐受，当天即开始肠内营养^［7］。（2）静脉营养：第1天给予氨基酸，起始剂量为1.0~1.5 g/(kg·d)，按0.5~1 g/(kg·d)增加，直至总量达到3.5~4.0 g/(kg·d)；第2天开始给予脂肪乳剂，起始剂量为1.0 g/(kg·d)，按0.5~1 g/(kg·d)增加，直至总量达到3 g/(kg·d)。

1.3. 粪便标本收集及保存

所有纳入本研究的患儿均于生后第2周、第4周用无菌粪便收集器采集新鲜粪便标本后，每管称量250 mg粪便标本分装至1.5 mL消毒去酶EP管中，冻存于-80℃冰箱备用。

1.4. 粪便标本DNA提取、PCR扩增和高通量测序

用QIAamp FAST DNA Stool Mini-Kit（德国Qiagen）提取粪便菌群基因组DNA。在1％的琼脂糖凝胶上检测DNA提取物，并用分光光度计（NanoDrop 2000 UV-vis，Thermo Scientific，美国）评估DNA的浓度和纯度。用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'），806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）扩增肠道细菌16S rDNA基因的V3~V4高变区。扩增步骤如下：初始变性（95℃、3 min），变性（95°C持续30 s），退火（55°C持续30 s）和延伸（72°C持续45 s），共27个循环，再进行延伸（72°C持续10 min）。凝胶电泳分离产物，使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒（Axygen BioSciences）回收，并用Quantus Fluorometer（Promega，USA）定量。创建数据库，并在与Illumina MiSeq相关的平台上对其进行排序。

1.5. 粪便标本生物信息分析

使用UPARSE 7.1版将处理后的序列分为可操作的生物分类单位（operational taxonomic units，OTU），以97％的相似性阈值与OTU进行生物信息学聚类分析，对数据进行Alpha多样性分析（肠道菌落中物种的丰富度、多样性分别用Chao指数值和Shannon指数值来体现）和群落组成分析。

1.6. 粪便标本SCFAs测定

乙酸乙酯依次加入 8种SCFAs标品和2-乙基丁酸制得8种SCFAs的混标储备溶液和内标储备液。两者混合后用乙酸乙酯稀释成8个不同浓度的工作液。适量样本研磨（3 min、2次）、冰浴（30 min）、静置（4℃、30 min）、离心（4℃、15 min），萃取后冰浴（10 min），13 000 g离心（4℃、10 min）后进行气相色谱-质谱检测分析。采用Masshunter定量软件对目标SCFAs进行自动识别和积分，并辅助人工检查。通过标准曲线计算并换算出样品中SCFAs的实际含量。

1.7. 统计学分析

采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。正态分布的计量资料用均数±标准差（ $\overline{x}\pm s$ ）表示，组间比较采用两样本t检验，组内比较采用配对t检验。非正态分布的计量资料用中位数（四分位数间距）［M（P ₂₅，P ₇₅）］表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验，组内比较采用Wilcoxon符号秩和检验。计数资料采用例数和百分率（%）表示，组间比较采用Fisher确切概率法。P<0.05差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 患儿一般资料

共收治60例VLBWI，其中住院期间死亡和放弃者7例，先天性消化道畸形9例，未完成肠道菌群和SCFAs测定者5例，不愿意参与本研究者10例，最终纳入29例VLBWI。生后开奶时间<24 h组15例，24~72 h组14例，所有患儿均在3 d内成功开奶。2组VLBWI性别、出生情况、母孕期情况、呼吸机使用时间和药物使用情况、住院时间及并发症等指标比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1.

2组不同肠内营养开始时间VLBWI临床指标对比

项目	<24 h组 (n=15)	24~72 h组 (n=14)	Z/t值	P值
性别 (男/女, 例)	6/9	10/4	-	0.139
出生情况
胎龄 ( $\overline{x}\pm s$ , 周)	28.7±1.1	28.5±0.8	0.585	0.563
出生体重 ( $\overline{x}\pm s$ , g)	1 160±165	1 116±213	0.626	0.537
顺产 [例(%)]	8(53)	4(29)	-	0.264
1 min Apgar评分 ( $\overline{x}\pm s$ )	7.5±1.4	7.2±1.3	0.630	0.534
5 min Apgar评分 ( $\overline{x}\pm s$ )	8.8±0.9	8.3±1.1	1.324	0.197
母孕期情况
胎膜早破≥18 h [例(%)]	6(40)	3(21)	-	0.427
宫内窘迫 [例(%)]	2(13)	5(36)	-	0.215
妊娠高血压 [例(%)]	1(7)	5(36)	-	0.080
妊娠糖尿病 [例(%)]	5(33)	4(29)	-	1.000
产前使用糖皮质激素 [例(%)]	12(80)	9(64)	-	0.427
产前使用抗生素 [例(%)]	7(47)	10(71)	-	0.264
住院时间 ( $\overline{x}\pm s$ , d)	61±17	68±14	-1.167	0.253
中心静脉置管时间 ( $\overline{x}\pm s$ , d)	31±13	34±10	-0.725	0.475
抗生素疗程 ( $\overline{x}\pm s$ , d)	15±13	18±10	-0.684	0.500
抗生素使用日龄 [M(P 25, P 75), d]	0(0, 1)	0(0, 0)	-1.284	0.354
呼吸机使用时间 [M(P 25, P 75), d]	14(12, 19)	18(6, 26)	-0.704	0.482
恢复出生体重时间 ( $\overline{x}\pm s$ , d)	7.0±2.1	6.4±1.8	-0.113	0.397
生后第2周体重增长率 [ $\overline{x}\pm s$ , g/(kg·d)]	13±8	11±5	0.957	0.347
生后第4周体重增长率 [ $\overline{x}\pm s$ , g/(kg·d)]	21±6	17±5	1.624	0.116
达到全肠内营养时间 [ $\overline{x}\pm s$ , d]	32±15	37±16	-0.801	0.368
生后第2周奶量 [ $\overline{x}\pm s$ , mL/(kg·d)]	101±24	98±24	0.283	0.780
生后第4周奶量 [ $\overline{x}\pm s$ , mL/(kg·d)]	150±39	139±47	0.678	0.504
住院期间发生腹胀 [例(%)]	6(40)	5(36)	-	1.000
住院期间发生便秘 [例(%)]	3(20)	4(29)	-	0.682
住院期间发生腹泻 [例(%)]	4(27)	5(36)	-	0.700
坏死性小肠结肠炎 [例(%)]	0(0)	2(14)	-	0.224
新生儿败血症 [例(%)]	4(27)	6(43)	-	0.450
化脓性脑膜炎 [例(%)]	2(13)	0(0)	-	0.483

2.2. 肠道菌群Alpha多样性分析

开奶时间<24 h组生后第4周Chao指数较第2周下降（P<0.05），Shannon指数差异无统计学意义（P>0.05）。24~72 h组生后第2周和第4周Chao指数和Shannon指数差异均无统计学意义（P>0.05）。开奶时间<24 h组与24~72 h组比较，生后第2周和第4周Chao指数和Shannon指数差异均无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2.

不同肠内营养开始时间VLBWI粪便的菌群Alpha多样性分析

组别	例数	Chao指数 [M(P 25, P 75)]				Shannon指数 ( $\overline{x}$ ±s)
		第2周	第4周	Z值	P值	第2周	第4周	t值	P值
<24 h组	15	63.09(54.42, 75.00)	46.75(43.92, 63.90)	-2.281	0.023	1.1±0.4	1.3±0.4	-1.939	0.064
24~72 h组	14	63.57(44.12, 81.10)	36.00(30.50, 77.66)	-1.816	0.069	1.2±0.4	1.0±0.4	0.654	0.520
Z/t值		-0.279	-1.739			-0.656	1.846
P值		0.780	0.168			0.519	0.076

2.3. 肠道菌群丰富度比较

在门水平上，开奶时间<24 h组生后第4周变形菌门减少，厚壁菌门增加（P<0.05）；在属水平上，不动杆菌属减少，韦荣球菌属、梭菌属增加（P<0.05）。24~72 h组生后第4周肠道菌群在门、属水平上变化差异均无统计学意义（P>0.05）。见图1。

图1. 肠道菌群丰富度组内比较 图A~B分别为开奶时间<24 h组第2周和第4周门、属水平群落丰富度比较；图C~D分别为24~72 h组第2周和第4周门、属水平群落丰富度比较。*示P<0.05。.

开奶时间<24 h组与24~72 h组比较，生后第2周和第4周主要菌群在门、属水平上差异均无统计学意义（P>0.05），见图2。

图2. 肠道菌群丰富度组间比较 图A~B分别为开奶时间<24 h组和24~72 h组第2周门、属水平群落丰富度比较；图C~D分别为开奶时间<24 h组和 24~72 h组第4周门、属水平群落丰富度比较。*示P<0.05。.

2.4. SCFAs测定

开奶时间<24 h组和24~72 h组第4周SCFAs总量较第2周均升高（P<0.05）。第4周，开奶时间<24 h组乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、异己酸均升高（P<0.05），24~72 h组丙酸、丁酸、戊酸升高（P<0.05）。生后第4周开奶时间<24 h组丙酸高于24~72 h组（P<0.05），SCFAs总量及其他各SCFAs含量差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

表3.

不同肠内营养开始时间VLBWI粪便的SCFAs含量分析 ［M（P ₂₅，P ₇₅），μg/g］

组别	例数	总SCFAs				乙酸				丙酸
		第2周	第4周	Z值	P值	第2周	第4周	Z值	P值	第2周	第4周	Z值	P值
<24 h组	15	213.16 (189.23, 236.95)	689.60 (464.30, 810.88)	-3.351	0.001	209.46 (181.04, 227.99)	262.73 (237.53, 303.31)	-2.272	0.023	4.63 (1.30, 13.89)	175.13 (95.00, 328.51)	-3.351	0.001
24~72 h组	14	229.41 (116.77, 441.52)	713.87 (512.18, 837.09)	-2.856	0.004	215.17 (114.32, 303.33)	240.86 (144.81, 368.20)	-0.408	0.683	2.21 (0.56, 8.23)	34.14 (6.27, 100.08)	-2.542	0.011
Z值		-0.349	-0.306			-0.218	-1.091			-1.091	-2.531
P值		0.727	0.760			0.827	0.275			0.275	0.011

组别	例数	丁酸				异丁酸				戊酸
		第2周	第4周	Z值	P值	第2周	第4周	Z值	P值	第2周	第4周	Z值	P值
<24 h组	15	0.60 (0.34, 1.09)	46.88 (4.44, 210.06)	-3.408	0.001	0.37 (0.26, 0.51)	0.63 (0.41, 7.27)	-2.726	0.006	0.29 (0.12, 0.43)	1.00 (0.56, 3.21)	-3.408	0.001
24~72 h组	14	0.87 (0.36, 2.19)	3.38 (1.64, 189.69)	-2.856	0.004	0.29 (0.21, 0.42)	0.60 (0.26, 4.83)	-1.601	0.109	0.19 (0.11, 0.44)	0.56 (0.26, 3.36)	-2.417	0.016
Z值		-0.698	-1.004			-1.004	-0.917			-0.611	-0.829
P值		0.485	0.315			0.315	0.359			0.541	0.407

组别	例数	异戊酸				己酸				异己酸
		第2周	第4周	Z值	P值	第2周	第4周	Z值	P值	第2周	第4周	Z值	P值
<24 h组	15	0.29 (0.17, 0.52)	0.75 (0.31, 2.53)	-2.442	0.015	1.59 (1.08, 1.91)	2.32 (1.06, 3.13)	-1.647	0.100	0.20 (0.12, 0.26)	0.27 (0.21, 0.52)	-2.215	0.027
24~72 h组	14	0.22 (0.10, 0.75)	0.68 (0.24, 2.51)	-0.785	0.433	1.55 (0.86, 2.13)	1.47 (0.90, 4.35)	-1.036	0.300	0.26 (0.18, 0.61)	0.35 (0.18, 1.78)	-0.157	0.875
Z值		-0.087	-0.524			-0.146	-0.218			-1.353	-0.829
P值		0.930	0.600			0.885	0.827			0.176	0.407

注：［SCFAs］短链脂肪酸。

3. 讨论

肠道菌群的组成与NEC、喂养不耐受等新生儿肠道疾病的发生存在明显相关性，而开奶时间的早晚直接影响了VLBWI早期肠道菌群的建立。本研究发现不同开奶时间对肠道代谢产物SCFAs水平产生较大影响，而对肠道菌群的多样性、丰富度的影响则不明显。

VLBWI由于离开母体时胎龄不足，胃肠道运动发育不成熟，导致VLBWI不能早期开始肠内营养或出现喂养不耐受。动物实验显示，小鼠完全肠外营养禁食3 d后，会出现肠绒毛变平、肠黏膜萎缩等症状，提示仅进行肠外营养支持对消化功能发育有一定影响^［8］。国外研究已证实，VLBWI开奶时间越晚，其喂养不耐受发生率越高，而早期经口喂养可使VLBWI肠道较早得到食物有效刺激，从而使其肠道蠕动活动增多，增加机体内肠道激素分泌，有利于胃肠动力学改变，促使肠道黏膜的上皮细胞发育和成熟，故早期喂养策略对VLBWI而言不仅是营养支持更是治疗手段^［9］。本研究中，VLBWI生后24 h内开始肠内营养的15例（占52%），其余14例均在72 h内成功实现肠内喂养，总体开奶时间早于于新颖等^［10］的研究，其原因可能是喂养乳品不同。本研究采用母乳开奶，相比早产儿配方奶，母乳不仅可为VLBWI提供丰富的营养物质，保证其生长发育，且其中所含的高比例的乳清蛋白和低含量的脂肪、乳糖量，更有利于VLBWI吸收和加速胃排空。

新生儿肠道菌群的定植最早可追溯至宫内时期。研究发现，在宫内时新生儿少量的菌群定植可能来源于母体子宫内胎盘和羊水^［11］；在分娩时，分娩方式的不同（如顺产/剖宫产）则明显影响不同微生物菌群在新生儿的定植，有研究报道，与剖宫产新生儿相比，顺产新生儿经过产道时更有机会接触更多的共生菌群，从而有益于优势菌群的定植^［12］；在出生后，不同的生活环境及抗生素的使用则明显改变新生儿微生物菌群的丰富度和多样性^［13］。本研究中，与开奶时间<24 h组相比，24~72 h组VLBWI在生后第2周、第4周时间点的肠道菌群丰富度和多样性指标均无差异，这可能有几方面的原因。第一，开奶时间<24 h组和24~72 h组的顺产比例不同（53% vs 29%）。虽然2组数据差异无统计学意义，但后者顺产比例相对较低，可能会影响2组间肠道菌群的组成。第二，采集时间点单一。由于影响肠道菌群组成的因素众多，仅在单一的时间点（生后第2周、第4周）采集样本可能会使结果产生偏倚。第三，样本量局限。由于不同个体的肠道菌群分布差异较大，尤其在人群样本中更为明显，故在小样本调查研究时，可能导致出现2组间差异无统计学意义。

SCFAs大多是未经吸收利用的膳食纤维被大肠的肠道菌群发酵而生成的，其中丁酸、乙酸、丙酸是主要SCFAs，占肠腔内产生SCFAs 85%以上^［14］。在本研究中，与24~72 h组相比，开奶时间<24 h组VLBWI在生后第4周时的丙酸水平明显偏高，其他SCFAs水平则无明显改变。许多研究已经报道，不同SCFAs在维持肠道稳态、糖脂代谢调节、神经认知调节、免疫调节等方面扮演重要的作用^［14-16］，而其中大多数研究关注丁酸盐，再较少延伸至乙酸盐，丙酸在生理和病理方面的潜在作用一直被低估，相关文献较少。现有证据表明，丙酸在维持肠道稳态、免疫调节等方面起重要的作用，如丙酸可增加肠道紧密连接蛋白如ZO-1、occludin的含量以增强了肠道上皮屏障，减少了肠道炎症及氧化应激^［17-18］，且丙酸可通过肠-脑轴对抗中枢和肠道神经系统的炎症激活^［19］；此外，丙酸还具有调节适应性免疫的重要生理功能，抑制组蛋白去乙酰化酶的活性，增加调节T细胞的产生，调节T细胞对减少肠道炎症至关重要^［20］，且减少了肠道γδT细胞产生白细胞介素-17和白细胞介素-22^［21］，促进结肠内环境的稳定。在动物实验中，补充丙酸可激活Nrf2介导的抗炎和抗氧化途径，保护新生小鼠肺微血管内皮细胞免受由脂多糖引起的肺泡简单化和异常血管生成，以预防支气管肺发育不良^［22］。而本研究中2组患儿均存活出院，且住院时间及腹泻、腹胀、便秘等相关指标差异无统计学意义，考虑样本量小，观察时间较短，仍需后期随访等。

本研究有一定的局限性。本研究涉及的取样时间点及样本量较少，而新生儿出生后由于环境的突然改变导致的生理指标变化较大，使得本研究的结论有一定的片面性；另外，由于只检测肠道SCFAs的含量而不是直接检测血液及组织中SCFAs的含量，导致SCFAs解释糖脂类调节、免疫调节等疾病的相关性较低。然而，该指标用于评价由肠道菌群失调、肠道SCFAs紊乱导致的肠道疾病时则有一定的参考价值。

因此，与肠道营养开始时间较晚相比，在24 h内开始肠道营养可增加VLBWI第4周时肠道丙酸水平，而对其他SCFAs水平及肠道微生物分布则可能没有明显影响，这为解释早期肠内营养患儿的预后总体较好提供可能的依据。

利益冲突声明

所有作者声明不存在利益冲突。