Abstract
目的
探究275 nm与310 nm紫外线对去卵巢骨质疏松大鼠骨代谢的影响。
方法
24只3月龄雌性SD(Sprague-Dawley)大鼠随机分为对照组、假手术组、275 nm紫外线照射组与310 nm紫外线照射组，每组6只。275 nm紫外线照射组与310 nm紫外线照射组施行双侧卵巢摘除手术，假手术组行卵巢旁少许脂肪组织摘除，对照组未行手术处理。术后24周测定大鼠颈椎、腰椎、股骨近心端、股骨中段和股骨远心端骨密度。骨质疏松大鼠模型制备成功后，分别给予骨质疏松大鼠275 nm、310 nm紫外线照射，辐照强度均为15 μW/cm2，每日照射90 min，每周照射7 d，共16周，每周定时剃去大鼠背部毛发(面积为6 cm×8 cm)。照射16周后，测定大鼠颈椎、腰椎、股骨近心端、股骨中段和股骨远心端骨密度。处死动物后，取血并分离血清，测定血清25(OH)D、Ⅰ型原胶原N-端前肽(procollagen type Ⅰ N-peptide, PINP)与骨钙素(osteocalcin, OC)的含量。
结果
双侧卵巢摘除术24周后，与对照组[(238.78±26.74) mg/cm3]相比，275 nm紫外线照射组[(193.34±13.28) mg/cm3]和310 nm紫外线照射组[(191.19±18.48) mg/cm3]大鼠骨密度均显著下降(P=0.002，P=0.001)；假手术组[(227.20±14.32) mg/cm3]与对照组相比差异无统计学意义。对骨质疏松大鼠进行紫外线照射16周后，275 nm紫外线照射组大鼠全身平均骨密度显著增加[(193.34±13.28) mg/cm3 vs. (221.68±25.52) mg/cm3，P=0.005]，310 nm紫外线照射组大鼠全身平均骨密度显著增加[(191.19±18.48) mg/cm3 vs. (267.48±20.54) mg/cm3，P < 0.001]。275 nm紫外线照射组大鼠腰椎、股骨近心端、股骨中段和股骨远心端的骨密度平均水平均增加；310 nm紫外线照射组大鼠颈椎、腰椎、股骨近心端、股骨中段和股骨远心端5个部位的骨密度平均水平均显著提高。275 nm紫外线照射组大鼠血清25(OH)D及OC含量均显著高于对照组[(46.78±5.59) μg/L vs. (21.32±6.65) μg/L，P=0.002；(2.05±0.53) U/L vs. (1.32±0.07) U/L，P=0.022]；310 nm紫外线照射组大鼠血清25(OH)D[(58.05±12.74) μg/L]、PINP[(176.16±24.18) U/L]和OC[(2.04±0.53) U/L]水平也均显著高于对照组(P < 0.001，P=0.015，P=0.005)。假手术组与对照组相比，大鼠血清25(OH)D、PINP及OC含量差异无统计学意义。
结论
275 nm和310 nm紫外线均能促进大鼠维生素D合成，显著改善骨质疏松大鼠骨质状况，310 nm紫外线照射对于骨质状况的改善作用更强。
Keywords: 紫外线, 去卵巢SD大鼠, 骨代谢, 维生素D
Abstract
Objective
To investigate the effect of 275 nm and 310 nm ultraviolet irradiation on ovariectomized rats' bone metabolism.
Methods
Twenty four 3-month-old female Sprague-Dawley (SD) rat were randomly divided into control group, sham operated group, 275 nm ultraviolet (UV) irradiation group and 310 nm UV irradiation group. Each group contained 6 rats. The rats in the two irradiation groups were treated with bilateral ovariectomy. The rats in sham operated group received sham operation (They were given the same back incision and a bit of par-ovarian fat were removed). Control group received no disposition. About 24 weeks after operation, all the rats received detailed bone mineral density (BMD) detection again. Detection regions include cervical vertebra, lumbar vertebra, proximal femur, mid femur and distal femur. Next, osteopenia rats in 275 nm irradiation group were UV irradiated 275 nm with fixed illumination intensity (15 μW/cm2) everyday for 16 weeks. The osteopenia rats in 310 nm irradiation group were UV irradiated 310 nm with fixed illumination intensity (15 μW/cm2) everyday for 16 weeks. The backs of the rats were shaved regularly as irradiation area (6 cm×8 cm). After 16-week irradiation, all the rats' BMD of cervical vertebra, lumbar vertebra, proximal femur, mid femur and distal femur were measured. At the end of the trial, all the rats' blood specimens were obtained and serum 25(OH)D, procollagen type Ⅰ N-peptide (PINP) and osteocalcin (OC) were measured.
Results
Compared with control group [(238.78±26.74) mg/cm3], the BMD of the whole body were significantly lower in 275 nm [(193.34±13.28) mg/cm3] and 310 nm [(191.19±18.48) mg/cm3] irradiation groups (P=0.002, P=0.001). There were no significant difference between sham operated group [(227.20±14.32) mg/cm3] and control group. After 16-week ultraviolet irradiation, the BMD of the whole body were significantly increased in 275 nm [(193.34±13.28) mg/cm3 vs. (221.68±25.52) mg/cm3, P=0.005] and 310 nm groups [(191.19±18.48) mg/cm3 vs. (267.48±20.54) mg/cm3, P < 0.001] after corresponding irradiation. The BMD of the four body regions (lumbar vertebra, proximal femur, mid femur and distal femur) had significantly increased after irradiation in 275 nm irradiation group. For 310 nm irradiation group, the BMD in cervical vertebra, lumbar vertebra, proximal femur, mid femur and distal femur also had increased significantly after 310 nm ultraviolet irradiation. The concentration of serum 25(OH)D and OC was higher in 275 nm irradiation group than in control group [(46.78±5.59) μg/L vs. (21.32±6.65) μg/L, P=0.002;(2.05±0.53) U/L vs. (1.32±0.07) U/L, P=0.022]. Compared with the control, the concentration of serum 25(OH)D [(58.05±12.74) μg/L], OC [(2.04±0.53) U/L] and PINP [(176.16±24.18) U/L] was significantly higher (P < 0.001, P=0.015, P=0.005) in 310 nm irradiation group. However, there were no significantly difference between sham operated group and the control.
Conclusion
Both 275 nm and 310 nm ultraviolet could improve rats' vitamin D synthesis. Both 275 nm and 310 nm ultraviolet could improve osteopenia rats' bone condition. The irradiation of 310 nm might be more effective on bone condition improvement.
Keywords: Ultraviolet, Ovariectomized Sprague-Dawley rats, Bone metabolism, Vitamin D
绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis, PMO)严重危害妇女的健康，绝经后妇女由于卵巢功能衰退，体内雌激素水平下降，破骨细胞数量增多且活性增强，引起骨吸收增强，而骨形成代偿性增强不足以抵消，最终导致骨量逐渐下降，引发骨质疏松症[1]。绝经后骨质疏松症患者多好发骨质疏松性骨折，其中髋部骨折尤为严重，不仅对患者身心造成巨大伤害，还会给患者造成巨大经济负担。
骨质疏松的防治有多种方法和策略，除了药物、激素治疗等方法外，临床上也有将紫外线照射引入骨质疏松症患者的预防和康复治疗。研究发现，中波紫外线照射可以缓解患者疼痛[2]，提升骨密度，改善骨状况[3]。在经过紫外照射治疗的群体内可发现血清钙、磷、碱性磷酸酶，骨钙素及1, 25(OH)2D的含量均有所上升。紫外线照射治疗能改善骨状况，可能与其促进维生素D合成有关。人体皮肤中的7-脱氢胆固醇在紫外线的作用下转化为维生素D前体，后者吸收热能转化为维生素D。维生素D与维生素D结合蛋白(vitamin D binding protein, DBP)结合后运输至肝，在肝维生素D-25羟化酶(25-hydroxylase, CYP2R1和CYP27A1)的羟基化作用下形成25(OH)D，最后在DBP协助下进入肾小管细胞，在细胞内CYP27B1催化酶作用下羧基化形成具有活性的1, 25-二羟维生素D[1, 25(OH)2D]与DBP结合运输到靶器官，与维生素D受体(vitamin D receptor, VDR)结合，通过调节基因转录而发挥生理作用[4]。维生素D的生理作用包括调节钙、磷代谢，有利于骨骼矿化，还可以直接作用于成骨细胞，间接作用于破骨细胞，影响骨形成和骨吸收[5]。因此，人体接受适宜的紫外线照射，有利于皮肤合成充足的维生素D，有助于维持人体钙稳态和促进骨骼健康[6]。另有研究发现，日照不足与维生素D缺乏以及骨量下降疾病(如佝偻病或骨质疏松症)的发病风险升高有关，年老者更是如此[7]。
目前针对于紫外线与骨代谢之间关联的研究较少，且大部分研究缺乏对紫外光源、照射过程、辐照强度和照射剂量等方面的描述，参考价值较低。因而在前期研究工作的基础上[8]，为进一步探究紫外线照射对维生素D合成和骨代谢的影响，本研究通过双侧卵巢摘除手术法建立骨质疏松大鼠模型，观察275 nm与310 nm紫外线照射对骨质疏松大鼠骨代谢的影响，并比较两种紫外线的作用，旨在为绝经后妇女骨质疏松症防治提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1. 动物分组及处理
健康3月龄雌性SD(Sprague-Dawley)大鼠，清洁级，体质量(300±10) g，共24只，由北京大学医学部实验动物科学部提供，使用许可证号：SXYK(京)2011-0039。动物饲养环境温度恒定[(20±2) ℃]，相对湿度40%~60%，通风良好。所有动物均单笼饲养于40 cm×25 cm×20 cm的透光动物笼中，动物自由饮水、摄食，饲料中的营养元素能满足和维持大鼠正常生长发育。
本研究开始前已经北京大学生物医学伦理委员会动物伦理分会审查批准(LA2018235)。
1.1.1. 骨质疏松大鼠模型的制备
适应性饲养一周后，将24只大鼠随机分为对照组、假手术组、275 nm紫外线照射组与310 nm紫外线照射组，每组6只。除对照组与假手术组外，其他两组动物施行双侧卵巢摘除。假手术组大鼠仅从卵巢旁摘除少量脂肪组织，不切除卵巢。手术前对所有大鼠进行骨密度测定，随后使用剃毛器剃去大鼠背部毛发，形成约3 cm×5 cm剃毛区，使用碘伏消毒剃毛区皮肤，用10%(体积分数)水合氯醛腹腔注射麻醉。动物麻醉后在背部沿背中线方向做纵形切口，切开皮肤和肌肉组织，找到卵巢，结扎并切断与之相连的子宫角，摘除卵巢，最后缝合背部肌肉及皮肤。24周后对所有大鼠进行活体骨密度检测，以评价双侧卵巢摘除手术建立骨质疏松大鼠模型的效果(图 1)。
图 1.
去卵巢骨质疏松大鼠模型建立与紫外辐照实验设计流程图
Schematic of ovariectomized osteoporotic rats modeling and ultraviolet (UV) irradiation
① refers to no disposition; ② refers to sham operation (they were given the same back incision and a bit of par-ovarian fat were removed); ③ refers to bilateral ovariectomy; ④ refers to bone mineral density (BMD) detection.
1.1.2. 紫外线照射
骨质疏松大鼠模型建立成功后，对275 nm紫外线照射组与310 nm紫外线照射组大鼠施行紫外线照射处理；对照组与假手术组大鼠不做任何照射处理，继续正常饲喂。275 nm紫外线照射组大鼠每日接受90 min 275 nm紫外线照射，辐照强度15 μW/cm2；310 nm紫外线照射组大鼠每日接受90 min 310 nm紫外线照射，辐照强度15 μW/cm2。本实验辐照强度的设计依据是预实验和课题组前期研究结果[8]，使用该辐照强度紫外线照射不会对大鼠造成明显皮损如红斑，同时长期照射可以观察到大鼠骨质状况改善。为了确保紫外线辐照强度符合设计要求，每次照射前均使用紫外辐照计对照射区域进行辐照强度测试，测试在暗室中进行(图 2)，具体测试方法为测定动物笼底部5个点的辐照强度(图 2B)，取平均值，即为动物在辐照处理中所接受的紫外辐照强度。照射过程(图 2A)中调整光源于动物笼正上方25 cm处时，所发射出的紫外线照度满足实验要求。笼顶使用不锈钢铁架防止动物在照射过程中逃逸，由于其可能阻隔紫外线，为排除这一误差，辐照强度的测试均在有铁架的情况下进行。照射过程中不限制大鼠在笼内的自由活动。两组大鼠紫外线照射总时长均为16周，照射期间每周均使用剃毛器剃去动物背部毛发，剃毛面积为6 cm×8 cm。
图 2.
紫外辐照处理示意图(A)和辐照强度测试示意图(B)
The sketch map of ultraviolet (UV) irradiation (A) and the sketch map of irradiation intensity detection (B); The irradiation intensity was average value calculated from five spots' measurement in cage (①-⑤)
1.2. 实验仪器、试剂
本实验所用紫外光源有波长为275 nm和310 nm两种，由北京大学物理学院提供，光源光谱图见图 3。测试辐照强度所用的紫外辐照计购自北京师范大学电光仪器厂。99%(体积分数)水合氯醛购自萨恩学技术(上海)有限公司，在实验室中用纯水稀释，自行配制10%(体积分数)水合氯醛。动物骨密度测定使用Ultrafocus 100动物X射线成像仪(Faxitron公司，美国)，由北京大学公共卫生学院毒理系提供。
图 3.
实验所用紫外光源光谱图
Spectrum of ultraviolet (UV) lamps used in experiment
A, 275 nm UV lamp; B, 310 nm UV lamp.
1.3. 骨密度和生物标志物测定
骨密度测试共包括三个部分：(1)实验开始动物分组后，对所有大鼠进行了全身骨密度(bone material density, BMD)测试，全身骨密度指大鼠在骨密度测量仪扫描下全身总体骨密度平均水平；(2)术后24周时再次对所有大鼠进行骨密度测试以评价骨质疏松大鼠模型建立效果，测试部位包括颈椎、腰椎及双侧股骨(股骨近心端、股骨中段和股骨远心端)，最终股骨数据为双侧股骨测量值取均数；(3)照射16周后对所有大鼠进行骨密度测量，测试部位同样包括颈椎、腰椎及双侧股骨(股骨近心端、股骨中段和股骨远心端)。实验结束处死动物，取腹主动脉血，3 000 r/min离心15 min，分离血清，保存于-80 ℃。使用酶联免疫法测定血清中的血清Ⅰ型原胶原N-端前肽(procollagen typeⅠN-peptide, PINP)与骨钙素(osteocalcin, OC)的含量，测定试剂盒购自中国武汉CUSABIO公司。使用电化学发光法测定血清25(OH)D的含量，测试仪器为罗氏COBAS e601。
1.4. 统计学分析
数据录入及整理使用Excel，数据分析使用Stata 14.0软件，计量资料以均数±标准差表示，同一时期各组间指标差异比较使用单因素方差分析(ANOVA)，两两比较采用Bonferroni t检验；同组大鼠手术前后、照射前后指标比较使用配对t检验。P < 0.05认为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1. 建立骨质疏松大鼠模型
术前各组大鼠全身骨密度差异无统计学意义(图 4)，可认为术前各组大鼠全身骨密度平均水平相同(F=0.89，P=0.484)。双侧卵巢摘除手术24周后，各组大鼠全身骨密度平均水平出现差异(F=8.09，P < 0.001)；与对照组相比，275 nm与310 nm紫外线照射组大鼠骨密度平均水平降低(P值分别为0.002，0.001)。同时对比每组大鼠术前、术后的骨密度平均水平，对照组与假手术组大鼠全身骨密度变化差异并无统计学意义(对照组t=-2.44，P=0.059；假手术组t=-1.00，P=0.364)，而275 nm紫外线照射组与310 nm紫外线照射组大鼠在手术24周后，骨密度平均水平明显下降(275 nm紫外线照射组t=2.65，P=0.038；310 nm紫外线照射组t=2.90，P=0.034)，说明骨质疏松大鼠模型制备成功。
图 4.
双侧卵巢摘除对大鼠全身骨密度的影响
The effect of bilateral ovariectomy on rats' bone mineral density of whole body
a, P < 0.05, compared with control group after operation; b, P < 0.05, compared with sham operated group after operation.
2.2. 紫外照射对骨质疏松大鼠骨代谢的影响
2.2.1. 大鼠不同部位骨密度变化情况
大鼠卵巢摘除术24周后，275 nm紫外线照射组及310 nm紫外线照射组大鼠全身骨密度平均水平显著低于对照组和假手术组(表 1)。进一步比较照射前各组大鼠身体各部位骨密度平均水平，发现各组大鼠在颈椎与腰椎部位骨密度平均水平差异无统计学意义(颈椎比较F=2.16，P=0.102；腰椎比较F=1.47，P=0.240)，但是在股骨近心端、股骨中段和股骨远心端3个部位，手术组大鼠均低于对照组和假手术组。假手术组和对照组相比，各部位骨密度差异均无统计学意义(P>0.05)。紫外线照射16周后(表 2)，再次对各组大鼠各部位骨密度平均水平进行比较，4组大鼠骨密度水平并不完全相同(F=3.64，P=0.027)，两两比较发现，310 nm紫外线照射组大鼠骨密度平均水平高于275 nm紫外线照射组大鼠(P=0.027)；275 nm和310 nm紫外线照射组与对照组相比，差异均无统计学意义(P>0.05)，275 nm和310 nm紫外线照射组大鼠照射后全身骨密度上升(t=-4.26，P=0.005；t=-8.22，P < 0.001)。除此之外，4组大鼠腰椎及股骨远心端骨密度平均水平也不完全相同，两两比较结果显示，310 nm紫外线照射组大鼠腰椎骨密度高于对照组和假手术组(P值均小于0.001)；股骨远心端骨密度平均水平高于对照组(P=0.022)。对同组大鼠同一部位照射前后骨密度平均水平进行对比，275 nm组大鼠在腰椎、股骨近心端、股骨中段和股骨远心端的骨密度平均水平均有升高(配对检验结果依次为t=-6.39，P < 0.001；t=-3.05，P=0.023；t=-2.50，P=0.047；t=-2.62，P=0.040)；310 nm紫外线照射组大鼠在紫外照射16周后，颈椎、腰椎、股骨近心端、股骨中段和股骨远心端5个部位的骨密度平均水平均显著增加(配对检验结果依次为t=-4.15，P=0.009；t=-2.65，P=0.045；t=-3.73，P=0.014；t=-3.27，P=0.022；t=-3.15，P=0.025)。进一步比较不同波长照射下大鼠骨密度的变化程度，可发现310 nm紫外线照射后大鼠骨密度上升程度更大，无论颈椎，腰椎还是股骨的骨密度都呈现更为显著的改善。
表 1.
紫外照射前不同处理组大鼠各部位骨密度比较(x±s)
The comparison of BMD in different regions before UV irradiation (x±s) /(mg/cm3)
| Items | BMD of whole body | Cervical vertebra | Lumbar vertebra | Proximal femur | Mid femur | Distal femur |
| BMD, bone mineral density；*P < 0.05，compared with control group；# P < 0.05，compared with sham operated group. | ||||||
| Control | 238.78±26.74 | 190.31±24.05 | 251.21±75.13 | 351.04±31.27 | 365.68±28.92 | 345.73±36.87 |
| Sham operated | 227.20±14.32 | 250.06±75.01 | 225.27±45.15 | 373.56±41.64 | 370.31±23.55 | 377.89±45.75 |
| 275 nm | 193.34±13.28*# | 210.88±9.99 | 260.42±35.29 | 298.48±11.59*# | 317.88±15.59*# | 307.02±14.06*# |
| 310 nm | 191.19±18.48*# | 197.69±34.42 | 300.98±23.66 | 297.32±14.62*# | 302.62±25.83*# | 301.33±14.04*# |
| F value | 8.09 | 2.38 | 2.56 | 12.42 | 12.57 | 9.07 |
| P value | < 0.001 | 0.099 | 0.083 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 |
表 2.
紫外照射后不同处理组大鼠各部位骨密度比较(x±s)
The comparison of BMD in different regions after UV irradiation (x±s) /(mg/cm3)
| Items | BMD of whole body | Cervical vertebra | Lumbar vertebra | Proximal femur | Mid femur | Distal femur |
| BMD, bone mineral density；*P < 0.05，compared with control group；# P < 0.05，compared with sham operated group；★ P < 0.05，compared with the BMD before UV irradiation in same region. | ||||||
| Control | 233.17±39.74 | 191.66±25.91 | 231.39±41.02 | 343.53±37.72 | 357.12±26.26 | 329.21±19.56 |
| Sham operated | 233.68±6.02 | 222.85±64.86 | 232.55±49.59 | 352.10±34.42 | 357.58±38.74 | 350.18±35.73 |
| 275 nm | 221.68±25.52★ | 224.62±48.72 | 289.51±27.61★ | 323.69±45.79★ | 358.44±48.86★ | 353.33±44.63★ |
| 310 nm | 267.48±20.54★ | 249.59±56.49★ | 399.60±80.90*#★ | 389.77±51.37★ | 424.00±95.52★ | 430.37±89.811★ |
| F value | 3.64 | 1.3 | 13.57 | 2.63 | 1.98 | 4.11 |
| P value | 0.027 | 0.301 | < 0.001 | 0.077 | 0.149 | 0.019 |
2.2.2. 血清25(OH)D、血清Ⅰ型原胶原N-端前肽和骨钙素水平
经过16周紫外线照射后，比较4组大鼠血清中骨代谢相关生物标志物含量(表 3)，275 nm紫外线照射组大鼠血清25(OH)D以及OC含量均高于对照组(P=0.002，P=0.022)和假手术组(P=0.001，P=0.015)；310 nm紫外线照射组大鼠血清25(OH)D、OC以及PINP含量均高于对照组(P < 0.001，P=0.022，P=0.007)与假手术组(P < 0.001，P=0.015，P=0.005)。假手术组与对照组相比，大鼠血清25(OH)D、OC和PINP含量差异均无统计学意义(P均大于0.05)。275 nm紫外线照射组与310 nm紫外线照射组相比，大鼠血清25(OH)D、PINP及OC水平差异均无统计学意义(P值分别为0.392、0.518、0.112)。
表 3.
紫外线照射后各组大鼠血清骨代谢相关生物标志物含量比较(x±s)
The comparison of serum bone related biochemical indicators among different groups after ultraviolet (UV) irradiation (x±s)
| Items | 25(OH)D/(μg/L) | PINP/(U/L) | OC/(U/L) |
| PINP，procollagen typeⅠN-peptide；OC，osteocalcin；*P < 0.05，compared with control group；# P < 0.05，compared with sham operated group. | |||
| Control | 21.32±6.65 | 129.41±2.14 | 1.32±0.07 |
| Sham operated | 20.42±5.76 | 130.12±10.17 | 1.32±0.08 |
| 275 nm | 46.78±5.59*# | 157.07±13.80 | 2.05±0.53*# |
| 310 nm | 58.05±12.74*# | 176.16±24.18*# | 2.04±0.53*# |
| F value | 19.6 | 7.68 | 7.06 |
| P value | < 0.001 | 0.001 | 0.002 |
3. 讨论
3.1. 骨质疏松大鼠模型建立效果评价
骨质疏松动物模型分为在体和离体两种模型。离体模型指将骨骼、骨代谢相关细胞(成骨细胞、破骨细胞)分离出来，使用特殊的处理方法，达到拟研究的状态或目的。在体模型制备指用物理、化学或生物的方法作用于动物，造成活体动物组织、器官或全身损害，并出现类似人体的疾病、代谢功能改变，这种造模方法主要包含手术造模、药物去势造模、失用模型、营养模型等。手术造模指切除动物双侧卵巢、睾丸或甲状旁腺等，其中双侧卵巢摘除应用较为广泛，该法通过切除雌性动物双侧卵巢，降低雌二醇水平，使动物松质骨骨丢失加快，骨量减少，骨强度下降，最终达到骨质疏松的目的，上述特征类似女性正常绝经时高转换型骨质疏松发生的骨丢失状态[9]，因此该模型可用于绝经后骨质疏松研究。SD大鼠的骨代谢、解剖与人类相似，卵巢切除后松质骨骨丢失与人体相似，造模重复性好；同时SD大鼠来源丰富且价格低廉，易于饲养管理，所以SD大鼠常被用于建立骨质疏松动物模型[10]。骨质疏松动物模型的评价指标包括骨密度、骨组织形态学变化、骨生物力学指标等[11]。根据《原发性骨质疏松症诊疗指南》(2017版)中对骨质疏松诊断的推荐策略[12]，目前公认的骨质疏松症诊断标准是基于双能X线吸收检测法(dual energy X-ray absorptiometry, DXA)测量骨密度的结果，因此骨密度可准确反映活体动物骨质状况。
本课题组既往研究发现[8]，6月龄雌性SD大鼠在双侧卵巢摘除术后24周时，股骨部位骨密度显著降低。由于6月龄SD雌鼠获取较困难，所以本实验应用3月龄SD雌鼠。研究发现，3月龄SD雌鼠双侧卵巢摘除手术24周后，全身骨密度和股骨部位骨密度显著下降，而对照组大鼠和假手术组大鼠骨密度变化不大，表明骨质疏松模型制备成功。同时，除卵巢摘除外的其他手术过程中施加的处理或刺激对大鼠骨密度无影响。
3.2. 紫外线照射对骨重塑的影响
骨组织通过不断重塑来维持结构完整，这个过程称为骨重塑，骨重塑的过程主要包括骨吸收和骨形成。骨形成和骨吸收的速率统称为骨转换率，当骨形成(或骨吸收)速率升高时，骨代谢加快，骨转换活跃。骨密度指单位体积(体积密度)或者是单位面积(面积密度)所含的骨量，可以直接反映骨质状况。
本实验首先手术切除大鼠卵巢，使大鼠体内雌二醇水平下降，此时大鼠体内骨重塑失衡，骨吸收增强，骨形成虽代偿性升高仍弱于骨吸收，骨量逐渐丢失，最终导致骨质疏松。对骨质疏松大鼠分别使用275 nm和310 nm紫外线照射16周，照射结束时310 nm紫外线照射组大鼠全身骨密度平均水平显著高于275 nm紫外线照射组，但两组照射组与对照组及假手术组相比，差异均无统计学意义，表明紫外线照射有效促进骨形成。进一步对骨密度改变程度进行比较，275 nm紫外线照射组大鼠照射后全身骨密度平均水平提升了近30 mg/cm3，而310 nm紫外线照射组大鼠照射后全身骨密度平均水平提升了超过70 mg/cm3。照射结束时，310 nm紫外线照射组大鼠全身骨密度平均水平高于275 nm紫外线照射组(P < 0.05)，而这两组大鼠在照射前全身骨密度水平差异并无统计学意义，说明310 nm紫外线对骨形成促进作用更大，可以更大程度改善骨质疏松大鼠骨质状况。
对照射前后腰椎及股骨部位骨密度进行比较，275 nm和310 nm紫外线照射组大鼠在接受紫外线照射后，腰椎及股骨部位骨密度均显著升高，310 nm紫外线照射组大鼠骨密度增加幅度更大；除腰椎和股骨外，310 nm紫外线照射组大鼠颈椎部位的骨密度在照射后也显著升高，而275 nm照射后骨质疏松大鼠颈椎部骨密度未发生变化，表明310 nm紫外线的骨质改善作用更大，不仅引起多部位骨质状况改善，且相同部位改善程度更大。
人体研究发现[13]，中老年女性骨量丢失的速率在身体各部的分布并不相同(三角区>腰椎>股骨颈>大转子)，目前临床上诊断骨质疏松的常用方法是通过DXA检测受试者腰椎前后位及股骨上端(股骨颈、Ward's三角区和大转子)的骨密度来反映骨质状况；流行病学研究显示人体髋部、股骨颈的骨折发生率较高[14]，表明在人体各部，股骨、腰椎部骨转换活跃，骨量易发生改变。本实验结果与上述研究结果一致，卵巢摘除大鼠由于雌二醇水平急剧下降，钙稳态失调，所以机体首先增强股骨部位的骨吸收作用，以维持钙稳态，最终导致股骨部位骨量显著降低；骨质疏松大鼠经过紫外照射后股骨部位骨形成增强，骨量上升，骨密度升高，表明股骨是SD大鼠骨转换最活跃的部位，易受其他因素的影响出现骨密度改变。除此之外，骨质疏松大鼠接受紫外线照射后腰椎部位骨密度显著升高，表明腰椎也是SD大鼠骨转换活跃部位。
3.3. 不同处理组血清骨代谢标志物含量比较
骨组织在骨重塑过程中会产生许多代谢产物，同时也有许多调节骨代谢的内分泌激素参与骨重塑，可被检测的生化标志物以及与骨代谢相关激素统称为骨代谢标志物。本实验测定了大鼠血清中三种骨代谢标志物[25(OH)D、PINP和OC]。
25(OH)D是维生素D在人体内的主要存在形式，血清25(OH)D含量可反映体内维生素D水平[15]。维生素D具有调节钙磷代谢的生理作用，缺乏可能导致骨质疏松[16]。本实验骨质疏松大鼠接受紫外线照射后，血清25(OH)D水平显著高于对照组大鼠，表明275 nm和310 nm均可促进大鼠皮肤合成维生素D。Holick[17]研究表明，不同波长下，维生素D合成速率不同，298 nm左右的中波紫外线作用下人体皮肤合成维生素D前体效率最高。但在本实验中，照射结束时275 nm和310 nm紫外线照射组大鼠血清维生素D水平并无差异，这可能是由于人和大鼠之间存在种属差异。Guo等[18]使用8周龄雌鼠进行中波紫外照射实验，实验组额外接受波峰315 nm的紫外光源进行照射，实验第一阶段照射12周，每日30 min，每次辐照强度为13~16 μW/cm2；第二阶段调高紫外光源辐照强度至25~30 μW/cm2，每日30 min，连续照射4周。第一阶段结束时，实验组大鼠体内25(OH)D水平没有升高，但是第二阶段结束时，大鼠血清25(OH)D有显著提升。与Guo等[18]的实验相比，本实验使用310 nm紫外光源进行照射，每日照射90 min，辐照强度15 μW/cm2，照射结束时大鼠血清25(OH)D的水平均显著高于对照组，这表明紫外线暴露剂量不足时可能无法促进皮肤维生素D合成。275 nm紫外线照射组与310 nm紫外线照射组大鼠骨密度增加幅度不一致，但血清25(OH)D含量无差别，这表明两种紫外线一方面可有效促进维生素D合成，另一方面可能通过影响其他通路变化间接调节骨代谢，因此在本研究中不同组大鼠骨质状况改善情况有所不同。
PINP是位于起点胶原氨基端的短胶原样因子，是Ⅰ型前胶原羧基端和氨基端伸展肽，是一种细胞外分解产物，能够生成并分解出前胶原纤维[19]。血清PINP的含量主要反映骨形成状态，当骨形成活跃时，血清PINP含量上升[20-22]，有研究表明紫外照射后大鼠血清PINP水平显著上升[18]。OC是一种由成骨细胞产生的非胶原蛋白，参与基质矿化和成骨细胞分化，主要反映骨形成状态和成骨细胞活性[23]，血清OC含量上升提示骨形成活跃[24]。邓琳等[25]发现，SD大鼠在双侧卵巢摘除术后3个月，其血清OC及PINP含量显著低于对照组大鼠，说明骨质疏松大鼠体内OC及PINP含量降低。本实验275 nm紫外线照射组大鼠血清OC含量高于对照组和假手术组，310 nm紫外线照射组大鼠血清OC和PINP水平高于对照组和假手术组，表明紫外线照射可升高大鼠血OC与PINP水平，两个照射组大鼠体内骨形成均很活跃。然而275 nm与310 nm紫外线照射组大鼠血清PINP和OC水平没有差别(P>0.05)，310 nm紫外线照射组大鼠骨质状况改善程度更大，一方面可能是由于两组大鼠骨吸收状态不同，另一方面可能由于310 nm紫外线照射组大鼠骨形成更为活跃，但是仅由PINP和OC不能充分反映骨形成状态，后续研究中应结合其他骨代谢标志物来深入了解骨重塑状态。
绝经后骨质疏松症在自然状态下不能自愈[1]。Bokhari等[26]发现骨质疏松SD大鼠不接受任何干预，16周后股骨骨密度显著降低。上述研究均表明双侧卵巢摘除后的骨质疏松SD大鼠在自然状态即不接受任何干预措施的状况下骨质状况不会发生好转。本研究结果显示骨质疏松大鼠在接受紫外线照射后，骨密度水平显著高于对照组大鼠，表明紫外线有显著的骨质改善作用。
本研究对大鼠多个部位的骨密度进行了测定，发现股骨和腰椎是大鼠体内骨转换较为活跃的两个部位；相较于其他同类研究，本研究明确了光源参数、紫外线照射剂量和辐照处理过程等；国内外有关紫外线照射对骨代谢影响的研究较少见，本研究结果可为相关领域的后续研究提供数据参考和科学依据。本研究照射实验中缺乏平行对照(骨质疏松未照射组)设计，需要在今后研究中进一步完善实验设计。
综上所述，275 nm和310 nm紫外线照射均能促进大鼠皮肤维生素D合成，并且均可以在一定程度上改善骨质疏松大鼠的骨质状况，310 nm紫外线照射对大鼠骨质状况的改善作用更大。大鼠体内股骨和腰椎部位骨转换活跃，与人体研究结果一致，这提示应更加关注股骨、腰椎部位的骨质状况，尤其在绝经后妇女群体中，这将有助于尽早发现骨质疏松，同时有针对性地预防骨折发生。由于人和大鼠存在种属差异，且个体之间存在差异，因此建议后续临床研究中照射剂量个体化。同时紫外线可能对眼和皮肤造成损伤，所以研究者还应注意对受试者眼和暴露部位皮肤的防护。照射前应进行必要的皮肤测试，同时在照射过程中密切观察暴露部位皮肤状况；使用有效防护措施保护除暴露皮肤外的其余部位，尤其注意眼和敏感部位防护。为了更加安全有效地使用紫外线造福人类，后续仍亟待大量研究进一步深入了解紫外线的生物学效应。
Funding Statement
国家重点研发计划项目(2017YFB0403104)和国家自然科学基金(61674005)
Supported by National Key Research and Development Program of China (2017YFB0403104) and the National Natural Science Foundation of China (61674005)
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