清肺口服液在特发性肺纤维化中的治疗作用及网络药理学研究

Abstract

Objective:

To investigate the therapeutic effect and mechanism of Qingfei oral liquid in idiopathic pulmonary fibrosis.

Methods:

Seventy-two male SD rats were divided into control group, model group, pirofenidone group and Qingfei group with 18 animals in each group. The idiopathic pulmonary fibrosis was induced in last three groups by intratracheal injection of 3 mg/kg bleomycin; pirofenidone group was given oral administration of 50 mg/kg pirofenidone b.i.d for 21 d, and Qingfei group was given Qingfei oral liquid 3.6 mL/kg q.d for 21 d. Lung tissues were obtained for HE staining, Masson staining and transforming growth factor (TGF)-β immunohistochemical staining. Superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) and glutathione (GSH) were detected in tissue homogenates. The BATMAN-TCM database was used to retrieve the chemical components and their corresponding targets of Qingfei oral solution by network pharmacology method, and then the component-target-disease network diagram was constructed. Finally, the pathway enrichment analysis was carried out to explore the molecular mechanism of Qingfei oral liquid against idiopathic fibrosis.

Results:

Histopathology results showed that Qingfei oral liquid had a similar relieving effect on pulmonary fibrosis as the positive drug pirfenidone; TGF-β secretion had a significant reduction in lung tissues of Qingfei group; and Qingfei oral liquid had better regulatory effect on SOD, MDA and GSH than pirfenidone. The results of component-target-disease network and pathway enrichment analysis showed that the related molecular pathways were concentrated in inflammation, extracellular matrix and cytokines.

Conclusion:

Qingfei oral liquid has a good therapeutic effect on idiopathic pulmonary fibrosis in rats via regulation of inflammation, extracellular matrix and cytokines.

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）;超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）;丙二醛（malondialdehyde，MDA）;谷胱苷肽（glutathione，GSH）;转化生长因子（transforming growth factor，TGF）;酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA）;基因表达数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）;中药分子作用机制的网络药理学在线分析工具（Bioinformatics Analysis Tool of Molecular mechanism of Traditional Chinese Medicine，BATMAN-TCM）;蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）;基因本体（Gene ontology，GO）;信号转导及转录激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）;低氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）;肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）;肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）;基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）;

IPF是一种慢性、进行性、纤维化性间质性肺疾病，可导致患者的肺功能逐渐丧失，最终死亡 ^{[ 1- 2]} 。IPF患者平均存活期约2.8年，短于大多数肿瘤患者 ^{[ 3- 4]} 。目前，临床常用于治疗IPF的药物主要包括美国食品药品监督管理局于2014年10月批准上市的吡非尼酮和尼达尼布 ^[5] 。其中，吡非尼酮可通过影响胶原合成沉积、减缓细胞外基质生成缓解肺纤维化进程 ^[6] ，而酪氨酸激酶抑制剂尼达尼布则具有抑制血管内皮生长因子受体等靶点的作用，可有效降低肺组织血管密度进而改善肺纤维化程度 ^{[ 7- 8]} 。此外，临床用于改善黏痰阻塞的药物 N-乙酰半胱氨酸也具有缓解肺纤维化的作用，其机制与增加肺组织中谷胱甘肽含量进而抑制细胞外基质的关键调节因子赖氨酸氧化酶的活性相关 ^[9] 。然而，上述几种药物虽可在一定程度上缓解IPF进程，但并未延长患者的存活时间，且部分药物存在不良反应较大、患者耐受性差等问题。因此，深入研究IPF的发病机制，寻找有效的治疗药物具有重要的临床意义。

IPF属于中医学“肺痿”、“肺痹”等范畴，其病机为“正气内虚，痰瘀并存”，是本虚标实之证 ^[10] 。肺、脾、肾三脏虚损，导致痰、瘀、热毒互结为标 ^[11] ，采用清热解毒、养阴润肺、活血化瘀等方法治疗可取得较好的疗效 ^{[ 12- 14]} 。基于上述理论，结合明代《景岳全书》中治则，以“肺虚络瘀”为切入点，设计清肺口服液组方，以浙贝、白花蛇舌草为君药，龙葵、重楼、半枝莲为臣药，北沙参、夏枯草、百合为佐药，炙黄精为使，可能可以为治疗IPF提供新的策略。

本文通过动物模型研究清肺口服液对IPF的治疗作用，进一步采用网络药理学方法构建成分-靶点-疾病网络，以期明确清肺口服液防治IPF的作用机制。

清肺口服液配制：称取浙贝12 g、白花蛇舌草15 g、龙葵15 g、重楼5 g、半枝莲15 g、北沙参12 g、夏枯草8 g、百合15 g、炙黄精15 g，置于蒸馏瓶中，加入8倍量（896 mL）的水，浸泡1 h，180 ℃恒温回流提取1.5 h，过滤得滤液，药渣加入8倍量的水第二次180 ℃恒温回流1.5 h，过滤得滤液，合并两次滤液旋转蒸发至896 mL，即得清肺口服液。

博来霉素（货号HY-17565A）为美国Med Chem Express公司产品；重组抗TGF beta 1抗体（批号ab215715）为美国Abcam公司产品；SOD试剂盒（货号A001-3）、MDA试剂盒（货号A003-1）和GSH试剂盒（货号A006-2）为南京建成海浩生物科技有限公司产品。

显微镜（型号DM1000）、全自动真空组织自动脱水机（型号ASP300S）、石蜡切片机（型号RM2235）、石蜡包埋机（型号EG1150H）和低温离心机（型号ASP300S）均为德国Leica公司产品。

无特定病原体级雄性SD大鼠72只（北京维通利华有限公司，动物合格证号11400700359419），按体重随机分为正常对照组、模型对照组、吡非尼酮组、清肺口服液组，每组18只。除正常对照组外，其余各组经戊巴比妥静脉注射麻醉后，仰卧固定于鼠板，颈部切口逐层分离至暴露出气管，采用1 mL注射器穿刺两软骨环间，一次性快速注射博来霉素3 mg/kg（体积不超过0.2 mL），快速竖立鼠板，保持大鼠身体直立，左右来回旋转1 min左右，使得药液尽可能均匀到达两侧肺部，缝合皮肤。术后第2天，吡非尼酮组灌胃给予吡非尼酮50 mg·kg ^–1·次 ^–1，每天2次，持续给药21 d；清肺口服液组灌胃给予清肺口服液3.6 mL/kg（相当于原药材4.5 g/kg），每天1次，持续给药21 d。实验第7、14、21天各组随机抽取6只大鼠处死，观察肺组织纤维化程度。实验期间各组均自由饮水、摄食，饲养环境温度控制在20~26 ℃，湿度控制在40%~70%，光照控制为12 h昼夜交替 ^[8] 。实验经浙江大学实验动物福利伦理委员会审批（IACUC-18-276），符合动物福利及保护要求。

取材后采用10%甲醛溶液固定，修剪后放入包埋盒，流水冲洗，采用不同浓度的乙醇梯度脱水，溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明。随后将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，浸蜡包埋。将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片贴至载玻片上烘干。采用乙醇梯度脱去石蜡，依次采用苏木素、伊红染色后脱水封片，镜下观察肺泡形态以及肺泡病变和炎症细胞浸润程度。

标本处理同1.3。苏木素染色，流水冲至返蓝。丽春红酸性品红液染色，流水冲洗。磷钼酸水溶液处理后采用苯胺蓝染色，胶原蛋白呈蓝色。乙酸处理1 min后，脱水封片。显微镜观察并采集图像。由浙江大学药物安全评价中心病理学专家读片后根据染色范围进行大鼠肺组织胶原蛋白沉积程度分级。其中染色范围0记为–，染色范围小于1%记为±，染色范围1%~25%记为+，染色范围大于25%记为++及以上 ^[15] 。

标本处理同1.3。根据抗体说明书推荐采用煮沸热修复法进行抗原修复，室温自然冷却，冲洗。滴加山羊血清封闭液，室温封闭20 min。加入TGF-β一抗，4 ℃过夜。用磷酸盐缓冲液洗涤，加二抗，室温静置1 h。磷酸盐缓冲液洗涤后用辣根过氧化物酶溶液显色，TGF-β蛋白阳性表达区域呈棕色。充分冲洗、复染、脱水、透明，静置干燥后封片，显微镜下观察。

取各组大鼠剩余肺组织，称重后剪碎，进行组织匀浆，分别按照SOD、MDA和GSH试剂盒说明书操作，酶标仪检测各组吸光度值，计算SOD、MDA和GSH的相对含量。MDA和GSH含量通过外标法测定，SOD含量计算公式如下：组织匀浆中SOD活性（U/mg蛋白）=[（对照管吸光度值–测定管吸光度值）/对照组吸光度值]/50%+[反应液总体积/取样量（mL）]/组织中蛋白含量（mg/mL）

在GEO数据库中检索IPF相关数据，得到数据集GSE110147，其中包含22个IPF组织标本，11个正常肺组织标本。利用GEO2R在线工具（ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）进行IPF与正常肺的差异基因分析，筛选标准为调整后的 P值小于0.05，logFC绝对值不低于1，获得显著差异基因结合用于成分-靶点-疾病网络构建。

在BATMAN-TCM数据库（ http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm）中检索清肺口服液组成药物的化学成分及其对应靶点，潜在靶点筛选阈值为20。所获靶点与上述差异基因取交集，采用String数据库（ https://string-db.org/）进行PPI分析。利用Cytoscape 3.6.1软件将药物、化学成分及对应IPF相关靶点进行网络可视化，构建成分-靶点-疾病网络图，寻找清肺口服液治疗肺纤维化的关键靶点。

采用R4.0.3软件，以clusterProfiler包对清肺口服液的IPF相关靶点进行GO功能注释分析，将IPF相关靶点基因分别导入DAVID数据库（ https://david.ncifcrf.gov/）中进行GO生物功能富集分析，并利用ggplot2包将 P值显著性排名前十的功能及通路进行可视化。

采用GraphPad Prism 7.0软件和SPSS 7.0软件对实验数据进行统计分析。计量数据用均数±标准差（ $\overline{x}\pm s$ ）表示，组间比较采用单因素方差分析；肺组织胶原蛋白沉积程度分布用例数（ n）表示，组间比较采用 χ ² 检验。 P<0.05为差异有统计学意义。

正常对照组肺组织结构及纤毛结构均正常，肺内细支气管上皮完整，排列整齐，气管和血管周围无明显炎症反应，未见纤维化（ 图1A）。造模第21天可见模型对照组肺内细支气管上皮增生，管壁增厚，管腔狭窄，伴有炎症细胞浸润，肺泡间隔明显增宽，大鼠肺组织均见不同程度的纤维化（ 图1B）。吡非尼酮可明显缓解肺纤维化程度，使病变程度减轻（ 图1C）。清肺口服液组肺纤维化程度与吡非尼酮组相近（ 图1D）。上述结果表明，清肺口服液可有效缓解肺纤维化症状。

图 1 .

造模第21天各组肺组织形态及纤维化表现（苏木精–伊红染色）A： 正常对照组肺组织结构及纤毛结构正常，肺内细支气管上皮完整，排列整齐，气管和血管周围无明显炎症反应，未见纤维化； B： 模型对照组肺内细支气管上皮增生，管壁增厚，管腔狭窄，伴有炎症细胞浸润，肺泡间隔明显增宽，肺组织均见不同程度的纤维化； C： 吡非尼酮组肺纤维化程度明显缓解，病变程度减轻； D： 清肺口服液组肺纤维化程度与吡非尼酮组相近. 标尺=50 μm.

造模第21天，模型对照组胶原蛋白沉积较正常对照组增加，而吡非尼酮组和清肺口服液组胶原蛋白沉积均比模型对照组减少（均 P<0.05），后两组差异无统计学意义（ P>0.05），见 图2、 表1。结果提示，清肺口服液与吡非尼酮均可减少肺组织胶原蛋白沉积。

图 2 .

造模第21天各组大鼠肺组织中胶原沉积情况（马森染色）A： 正常对照组肺组织中较少蓝色的胶原蛋白沉积； B： 模型对照组肺组织中胶原蛋白沉积增加； C：吡非尼酮组肺组织中胶原蛋白沉积较模型对照组减少； D： 清肺口服液组肺组织中胶原蛋白沉积情况与吡非尼酮组相近. 标尺=10 μm.

表 1 各组肺组织胶原蛋白沉积程度分级分布比较

Table 1 Severity of lung fibrosis in each group

（ n）

组别	第一周		第二周		第三周
–	±	+	++及以上		–	±	+	++及以上		–	±	+	++及以上
正常对照组	6	0	0	0		6	0	0	0		6	0	0	0
模型对照组	1	1	3	1		0	0	2	4		0	0	1	5
吡非尼酮组	3	1	2	0		0	0	5	1		2	0	3	1
清肺口服液组	1	3	1	1		1	0	0	5		0	0	6	0
P值	>0.05		>0.05		<0.01

相较于正常对照组，模型对照组肺组织中TGF-β表达增加，而吡非尼酮组和清肺口服液组肺组织中TGF-β 表达均较模型对照组减少（ 图3），提示清肺口服液可以减少IPF大鼠肺组织TGF-β表达。

图 3 .

各组肺组织中转化生长因子-β（TGF-β）表达A：正常对照组肺组织中TGF-β（棕色） 几乎不表达； B： 模型对照组肺组织中TGF-β表达增加； C： 吡非尼酮组肺组织中TGF-β表达较模型对照组减少； D： 清肺口服液组肺组织中TGF-β表达与吡非尼酮组相近. 标尺=50 μm.

与正常对照组比较，模型对照组肺组织中GSH和SOD含量减少，MDA含量增加（均 P< 0.05），而清肺口服液和吡非尼酮可以逆转上述现象，其中清肺口服液减少GSH的效果优于吡非尼酮（ 图4）。结果提示，清肺口服液可逆转IPF大鼠肺组织氧化/抗氧化失衡。

图 4 .

各组肺组织中GSH、SOD和MDA含量比较<0.05，<0.01. GSH：谷胱苷肽；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛.

通过数据库检索，共获得96个药代动力学效果较好的活性成分。进一步构建的“成分-靶点-疾病”网络表明，白花蛇舌草、龙葵、半枝莲、仙鹤草、夏枯草等共有68个节点（其中47个活性成分节点，21个靶点），形成87个关系对，活性成分平均节点度为1.85，靶点平均节点度为3.95，见 图5。结果提示，清肺口服液缓解IPF可能与这些成分及其对应的靶点有关。

图 5 .

清肺口服液抗特发性肺纤维化的成分–靶点–疾病网络

PPI结果显示，21个靶点共形成74条互作关系（置信度≥0.7），其中度中心性前十的基因分别为 TNF、 EGFR、 STAT3、 CCL2、 PTGS2、 IL-10、 TGF-β1、 MMP2、 HGF和 SERPINE1（ 图6）。

图 6 .

清肺口服液抗特发性肺纤维化潜在靶点的蛋白–蛋白相互作用网络

基因功能注释结果表明，清肺口服液的作用靶点主要富集于炎症响应、细胞增殖和凋亡的调节以及细胞损伤调节等方面（ 图7A），提示肺纤维化进程中上述生物学过程具有关键意义；在“细胞组成”分析中，上述靶点主要富集于细胞外空间、细胞外基质（ 图7B），这与肺纤维化胶原沉积改变细胞外基质等特点相吻合；“分子功能”富集结果表明，清肺口服液的作用靶点主要富集于细胞因子、蛋白酶活性调控（ 图7C）。上述结果提示，清肺口服液抗IPF作用靶点可能通过调控细胞炎症响应、增殖及胞外基质等生物学功能发挥作用。

图 7 .

清肺口服液抗特发性肺纤维化的作用靶点基因功能注释A： GO富集分析结果排序前十位生物学过程的气泡图； B： GO富集分析结果排序前十位细胞组成的气泡图； C： GO富集分析结果排序前十位分子功能的气泡图.GO：基因本体.

IPF作为一种进行性呼吸困难和肺功能进行性恶化的肺部疾病，严重威胁患者生命。目前，针对这一疾病暂无有效治疗手段，因此本研究运用中医辨证方法，创新性地建立了治疗IPF清肺口服液组方，并采用网络药理学手段探索其治疗IPF的作用机制。动物实验结果表明，清肺口服液使IPF大鼠肺组织纤维化发生程度减轻，与阳性药物吡非尼酮治疗效果相近，且减少肺组织中氧化代谢物含量和肺纤维化的经典标志物TGF-β表达。上述结果均提示，清肺口服液具有治疗IPF的作用。

本研究进一步采用网络药理学方法探索清肺口服液治疗IPF的分子机制。结果显示，清肺口服液作用于IPF靶点的生物学功能主要富集于炎症响应及细胞增殖和凋亡。IPF发生发展的过程中，肺泡细胞损伤产生大量的活性氧蓄积，导致氧化-还原失衡，进而发生氧化应激 ^[16] 。蓄积的氧化物不仅会损伤正常细胞，还可激发炎症并诱导成纤维细胞的活化和增殖，进一步加重肺纤维化程度、损伤肺功能 ^{[ 17- 19]} 。γ干扰素和趋化因子CXC亚家族配体2等炎症因子具有加重炎症、刺激成纤维细胞增殖的作用，这与清肺口服液干预肺纤维化的靶点一致 ^{[ 20- 21]} 。TGF-β异常活化是成纤维细胞活化的常见原因，在博来霉素诱导的肺纤维化中，γ干扰素可以减少TGF-β诱导的α-平滑肌肌动蛋白表达，并进一步缓解肺纤维化，同时γ干扰素可抑制成纤维细胞-肌成纤维细胞的转化 ^[20] 。肺纤维化过程中，对氧化-还原平衡敏感的转录因子及相关信号也可被激活 ^{[ 22- 23]} ，这与本研究网络药理学分析得出HIF1A、TNF及STAT3为此过程中的关键网络节点相一致。据报道，HIF1A可能是百草枯中毒引起肺纤维化的治疗靶点，HIF1A通过Snail和β-连环素途径调控上皮间质转化参与肺纤维化的进展 ^[24] 。此外，HIF1A对IPF的炎症和纤维化过程同样起着重要作用。在博来霉素诱导的IPF晚期，通过抑制HIF1A可抑制细胞分化和促纤维化介质的产生，从而减弱肺纤维化的发展 ^[25] 。这些研究均支持HIF1A在IPF治疗中的潜在作用。一项研究通过对人类和鼠类标本进行分子、免疫组织化学和流式细胞术分析发现，肺纤维化标本中STAT3表达上调；抑制STAT3的表达，胶原蛋白会减少。STAT3的小分子抑制剂Stattic可显著下调肺纤维化的生物学标志物，包括纤连蛋白、Ⅰ型胶原蛋白和α平滑肌肌动蛋白 ^[26] 。STAT3过表达促进了TGF-β诱导的人肺成纤维细胞模型中纤维化生物标志物的表达 ^[26] 。网络药理学结果显示清肺口服液也可干预直接刺激成纤维细胞生长的HGF，提示清肺口服液对刺激成纤维细胞增殖的多条信号通路均有抑制作用。

由胶原蛋白等成分构成的细胞外基质沉积也是肺纤维化的重要病机之一 ^[27] 。在成分-靶点-疾病多维度网络中，调节细胞外基质的关键蛋白MMP2是清肺口服液活性成分作用的关键靶点之一。MMP2特异性底物Ⅳ型胶原蛋白是肺泡基底膜的重要组成，肺泡基底膜破坏后肺间质成纤维细胞侵入肺泡腔加剧肺纤维化程度 ^[28] ，提示抑制成纤维细胞浸润可能是清肺口服液减缓肺纤维化进程的机制之一。

综上所述，本研究在动物水平明确清肺口服液对IPF的治疗作用，并通过网络药理学分析显示清肺口服液作用于肺纤维化靶点的生物学功能主要富集于炎症响应及细胞增殖和凋亡。相关机制有待实验研究进一步证实。

COMPETING INTERESTS

所有作者均声明不存在利益冲突

Funding Statement

浙江省医药卫生科技计划（2018ZZ006，2021ZZ001）