蛋白激酶D抑制剂CRT0066101对唾液腺腺样囊性癌细胞迁移能力的影响

Abstract

Objective

This study aimed to study the effect of the protein kinase D (PKD) inhibitor CRT0066101 on the cell migration of salivary adenoid cystic carcinoma (SACC) cells in vitro and explore its related mechanisms to provide new strategies into the clinical treatment of SACC cells.

Methods

SACC-LM cells were treated with different concentrations of CRT0066101, and the effect of active phospho-PKD was detected through Western blot and cell immunofluorescence staining. Transwell assay was performed to test cell migration. The effect of CRT0066101 on the protein expression related to the epithelial mesenchymal transition (EMT) was detected through Western blot, cell immunofluorescence staining, and quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). The cells were treated with the proteasome inhibitor after CRT0066101 administration, and the expression of Snail protein was detected by Western blot.

Results

CRT0066101 inhibited PKD activity and reduced the number of invaded cells in SACC-LM cells. CRT0066101 decreased the expression of N-cadherin and Snail and increased the expression of E-cadherin in SACC-LM cells. The regulation of snail protein degradation by CRT0066101 was dependent on the proteasome pathway.

Conclusion

CRT0066101 can inhibit the migration of SACC-LM cells in SACC and regulate the expression of proteins and genes related to EMT. The mechanism may be associated with the proteasome-dependent degradation of Snail.

唾液腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是口腔颌面部最常见的涎腺上皮来源性恶性肿瘤之一，具有生长缓慢但侵袭性强，早期沿神经、血管束向远处扩展等特征；并伴有易复发、高转移的生物学特性（5年肺转移率高达50%）[1]–[3]。

细胞生物学和蛋白质功能主要受蛋白激酶和蛋白磷酸酶的磷酸化和去磷酸化调节[4]。蛋白激酶D（protein kinase D，PKD）是一类新的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，由于其结构域与钙离子/钙调蛋白依赖性激酶（Ca/calmodulin-dependent protein kinases or CaM kinases，CaMK）家族的同源性高于蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）家族，目前PKD家族已经被定义为CaMK家族[5]。PKD包含PKD1、PKD2和PKD3三个亚型。PKC能特异性的诱导丝氨酸位点Ser744和Ser748的磷酸化。PKD Ser744/748位点磷酸化后常伴随Ser916的磷酸化，该位点的磷酸化被认为是PKD激酶完全活化的标志[6]–[7]。PKD主要介导细胞外刺激信号至胞内传递过程，近年来，其在肿瘤发生、发展中的作用受到广泛关注。

癌症的治疗一直以来是世界性难题，抗肿瘤药物的研发也在不停的进展之中。近年来，小分子抑制剂靶向癌症作为一种新的治疗手段正在成为肿瘤治疗药物研发与研究的一个热点[8]–[9]。CRT0066101作为新近研发靶向PKD的小分子抑制剂，已被证实在胰腺癌、结直肠癌和转移性乳腺癌的异种移植模型中具有治疗效果，但目前在SACC中的作用研究报道甚少[10]–[12]。本研究旨在观察CRT0066101对SACC细胞迁移能力的影响，并探讨其相关机制。

1. 材料和方法

1.1. 实验材料

p-PKD/PKC mu（Ser916）抗体、E-钙黏着蛋白（E-cadherin，E-cad）抗体、锌指转录因子（Snail）抗体、β-actin抗体（CST公司，美国），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（PAN-Biotech GmbH公司，德国），DMEM/high培养基（Gibco公司，美国），CRT0066101、MG132（APExBio公司，美国），佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）（北京索莱宝科技有限公司），结晶紫染液（上海碧云天生物技术有限公司），BCA蛋白含量测定试剂盒（Thermo公司，美国），电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）试剂（Bio-Rad公司，美国）。

1.2. 方法

1.2.1. 细胞培养

SACC-LM细胞由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供。SACC-LM细胞用含10%FBS、1%双抗（青霉素/链霉素）的DMEM高糖培养基，置于37 °C，5%CO₂培养箱中恒温培养。待细胞长至95%以上时，弃去培养基，加入预热的PBS洗涤2次，吸干PBS，加入0.25%胰酶200~1 000 µL（具体量视细胞而定），放入37 °C培养箱消化2~5 min（因细胞而定），显微镜下观察细胞变圆，目测呈泥沙样流动时，再加入2 mL完全培养基终止，轻轻吹打混匀，取一定量至培养瓶或培养皿中，补充完全培养基。

1.2.2. 药物处理

将CRT0066101用二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）溶解稀释成10 mmol·L⁻¹母液，再用无血清DMEM-H培养基稀释，使用浓度为0、1、3、5 µmol·L⁻¹，处理1 h；MG132粉末用DMSO稀释成40 µmol·L⁻¹母液，再用无血清DMEM-H培养基稀释，使用浓度为10 µmol·L⁻¹，分别处理0、0.5、3 h后，提取细胞总蛋白。

1.2.3. 激光共聚焦检测磷酸化PKD、E-cad和N-钙黏着蛋白（N-cadherin，N-cad）表达

1）细胞处理：取对数期生长的细胞胰酶消化，调整细胞浓度为每毫升3×10⁵个，取100 µL悬空滴到盖玻片上，在培养箱静置2 h后，沿孔壁缓缓加入600 µL培养基，过夜培养使细胞密度达到70%~80%。2）固定：第2天用镊子小心取出盖玻片放入1孔板（注意区分细胞面与非细胞面），用预热的PBS轻轻洗涤2次，加入4%多聚甲醛避光固定20 min。3）封闭：弃去多聚甲醛，加入PBS清洗3×5 min，用含1%Triton-100的5%BSA（用PBS溶解）溶液室温封闭30 min。4）一抗孵育：弃去封闭液，取载玻片加入用含1%Triton X-100的1%BSA（用PBS溶解）溶液稀释的一抗，放入湿盒4 °C过夜。5）二抗孵育：取载玻片用PBS清洗3×5 min，加入用1%BSA（含1%Triton X-100）溶液稀释的荧光二抗，避光37 °C孵育1 h。6）细胞骨架染色：取载玻片避光条件下用PBS清洗3×5 min。取载玻片加入30 µL已稀释的细胞骨架（肌动蛋白），放入湿盒室温孵育30 min。7）4, 6-二氨基-2-苯基吲哚[2-（4-amidinophenyl）-6-indolecarbamidine dihydrochloride，DAPI]染色：取载玻片避光条件下用PBS清洗3×5 min。取30 µL的DAPI于干净载玻片上，取载玻片吸干四周水分倒置于载玻片上，避光室温静置15 min。8）封片：在盖玻片四周刷一层指甲油封片。用激光共聚焦观察染色结果。

1.2.4. Transwell实验

将SACC-LM细胞用5 µmol·L⁻¹ CRT0066101处理1 h作为实验组，将SACC-LM细胞用DMSO处理1 h作为对照组。取实验组和对照组细胞，分别胰酶消化，离心去上清，细胞沉淀用无血清DMEM高糖培养基重悬，细胞计数，调整细胞浓度为每毫升5×10⁵个，取200 µL加到小室上层，小室下层加入600 µL完全DMEM培养基，放置培养箱培养。24 h后，取出小室，在12孔板上层和下层中分别加入预热PBS 200、800 µL，轻柔润洗2次。吸尽PBS后，在小室上层和下层分别加入200、800 µL，4%多聚甲醛固定20 min，吸去上下层多聚甲醛，用棉签轻轻擦去小室上层未穿过的细胞。上下层加入PBS洗3次，倒置小室晾干。小室放置12孔板中，其上层、下层加入200、800 µL的0.1%结晶紫溶液，染色15 min，用PBS洗3次，显微镜下采图，计数显微镜下每个视野中迁移细胞数，数据以平均数±标准差表示，用Graph Pad Prism 6.0绘制柱状图。

1.2.5. 实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测CDH1和Snail基因的表达

将SACC-LM细胞用5 µmol·L⁻¹ CRT0066101处理1 h作为实验组，将SACC-LM细胞用DMSO处理1 h作为对照组。取实验组和对照组细胞，采用Trizol法提取样本总RNA，使用分光光度计（Implen公司，德国）检测总RNA纯度。使用逆转录试剂盒（TaKaRa）对总RNA进行逆转录合成cDNA，取cDNA为模版，应用TSINGKE Master Mix（SYBR greenⅠ）试剂进行qRT-PCR检测。引物序列由北京擎科生物科技有限公司设计合成。引物序列如下。Snail上游引物序列：5′-GCTGCAGGACTCTAATCCAGA-3′，下游引物序列：3′-ATCTCCGGAGGTGGGATG-5′；CDH1上游引物序列：5′-CGGACGATGATGTGAACACC-3′，下游引物序列：3′-TTGCTGTTGTGCTTAACCCC-5′；磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GA-PDH）上游引物序列：5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，下游引物序列：3′-ACTGGTGATGTACCAGATGT-5′。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）条件：95 °C 30 s，95 °C 5 s，60 °C 32 s，循环45次；95 °C 15 s，60 °C 50 s，95 °C 20 s，循环1次。相对表达量用2^−ΔΔCT表示。

1.2.6. 蛋白质印迹（Western blot）法

收集不同处理的SACC细胞，加入提前配置好细胞裂解混合液[含0.1%的蛋白酶抑制剂，0.5%苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF），1%磷酸酶抑制剂]放置于冰上充分裂解，然后4 °C下12 000 r·min⁻¹离心10 min，小心吸取上清至新的EP管中，使用BCA试剂盒测定蛋白浓度并处理蛋白制备样本。配置十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）电泳，聚偏氟乙烯（polyvinylidenefluoride，PVDF）膜转膜，5%的脱脂牛奶（TBST溶解）室温封闭1 h。封闭结束后取出膜，用TBST洗3×5 min（90 r·min⁻¹）分别加入p-PKD/PKC mu（Ser916）、E-cad、N-cad、Snail、β-actin抗体，4 °C摇床过夜孵育（90 r·min⁻¹）。取出孵育过夜的膜，TBST清洗3×10 min（90 r·min⁻¹）后，加入5%的脱脂牛奶稀释的山羊抗兔二抗（1∶2 000）、羊抗鼠二抗（1∶2 000），室温孵育2 h。孵育结束后，取出膜用TBST清洗3×10 min（90 r·min⁻¹）。用ECL发光显影液显色，Chemidoc XRS采集图像。用Image G软件分析条带灰度值，用Graph Pad Prism 6.0绘制蛋白相对含量柱状图。

1.3. 统计学分析

采用Graph Pad Prism 6.0软件对数据进行统计学分析，所有数据用均数±标准差表示。多组间的数值比较采用one-way ANOVA，两两比较用t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2. 结果

2.1. 不同浓度CRT0066101可抑制细胞PKD活化

PKD1可被PMA、G蛋白偶联受体（G protein coupled receptor，GPCR）等多种细胞因子激活，本研究将SACC-LM细胞先用200 nmol·L⁻¹ PMA作用40 min，再用0、1、3、5 µmol·L⁻¹ CRT0066101处理1 h，Western blot实验结果表示，CRT0066101能以剂量依赖性方式抑制SACC-LM细胞中PMA诱导的PKD Ser916自磷酸化（图1）。接着，将SACC-LM细胞用0、3、5 µmol·L⁻¹ CRT0066101处理1 h，结果可见，CRT0066101明显抑制PKD Ser916自磷酸化，且呈剂量依赖性降低，在5 µmol·L⁻¹达到最强抑制效果（图2）。免疫荧光显示CRT0066101抑制SACC-LM细胞PKD Ser916自磷酸化（图3）。以上结果提示CRT0066101能有效抑制SACC-LM细胞中的PKD磷酸化活化。

图 1. CRT006101对SACC细胞PKD活性的影响.

Fig 1 Effect of CRT006101 on PKD activity of SACC cell line

1：SACC-LM细胞；2~5：分别为SACC-LM细胞经200 nmol·L⁻¹ PMA作用40 min，再用0、1、3、5 µmol·L⁻¹ CRT0066101处理1 h。

图 2. Western blot检测不同浓度CRT006101作用后SACC细胞PKD磷酸化活化蛋白的表达.

Fig 2 Expression of p-Ser916 treated with different doses of CRT006101 was detected by Western blot

图 3. 免疫荧光检测CRT006101作用后SACC细胞PKD磷酸化活化蛋白的表达.

Fig 3 Immunofluorescence detection of p-Ser916 protein expression treated with CRT006101 in SACC cells

绿色区域为相关蛋白在细胞内的定位，蓝色代表细胞核。

2.2. CRT0066101对SACC-LM细胞迁移能力的影响

Transwell实验表明，培养18 h后，CRT00661-01处理组和对照组细胞迁移数分别为43.25±5.977、510.00±22.290，2组间差异具有统计学意义（t=20.23，P<0.000 1）（图4）。该结果表明CRT0066-101能明显抑制SACC-LM细胞的迁移能力。

图 4. CRT006101对SACC-LM细胞迁移能力的影响 倒置显微镜 × 200.

Fig 4 Effect of CRT006101 on migration ability of SACC-LM cell line inverted microscope × 200

左：对照组；右：实验组。

2.3. CRT0066101对SACC-LM上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相关蛋白的影响

将SACC-LM细胞用0、1、3、5 µmol·L⁻¹ CRT0066101处理1 h，Western blot实验结果显示，实验组较对照组N-cad和Snail蛋白表达量降低，E-cad表达量升高（图5）。免疫荧光显示CRT0066101处理后，SACC-LM细胞N-cad表达降低，E-cad表达升高（图6）。以上结果说明CRT0066101能降低N-cad和Snail蛋白表达量，增加E-cad表达。

图 5. Western blot检测N-cad、E-cad、Snail蛋白表达.

Fig 5 Expression of N-cad, E-cad, Snail detected by Western blot

图 6. 免疫荧光检测CRT006101作用后SACC细胞N-cad和E-cad蛋白的表达.

Fig 6 Immunofluorescence detection of N-cad and E-cad protein expression treated with CRT006101 in SACC cells

绿色区域为肌动蛋白，红色区域为相关蛋白在细胞内的定位，蓝色代表细胞核。

2.4. CRT0066101对SACC-LM细胞CDH1和Snail mRNA表达的影响

qRT-PCR结果显示，5 µmol·L⁻¹ CRT0066101处理组的CDH1表达量（1.279±0.254）高于对照组的表达量（1.000±0.166）（P<0.05），Snail表达量（0.986±0.242）与对照组的表达量（1.000±0.275）差异无统计学意义（图7）。说明CRT0066101能增加CDH1基因的表达，CRT0066101处理细胞的Snail基因的mRNA表达量无明显差异，而蛋白量减少，表明CRT0066101不影响Snail基因的转录。

图 7. qRT-PCR检测SACC-LM细胞中CDH1 和Snail mRNA的表达.

Fig 7 qRT-PCR analysis of CDH1 and Snail mRNA expression in SACC-LM cells

a：对照组；b：5 µmol·L⁻¹ CRT0066101处理组。*为P<0.05。

2.5. CRT0066101对SACC-LM细胞Snail蛋白降解的调节机制

将5 µmol·L⁻¹ CRT0066101处理组和对照组细胞分别用蛋白酶体抑制剂MG132（10 µmol·L⁻¹）处理0、0.5、3 h。Western blot实验结果显示，对照组细胞在MG132的作用下，Snail蛋白的表达逐渐升高，而CRT0066101处理组Snail蛋白表达逐渐恢复正常水平（图8）。结果提示CRT0066101能调控蛋白酶体介导的Snail蛋白降解。

图 8. Western blot检测Snail蛋白表达.

Fig 8 Expression of Snail detected by Western blot

3. 讨论

SACC约占唾液腺恶性肿瘤的24%，是口腔颌面部最具特征的恶性肿瘤，具有较强的浸润性和远处转移力[1]–[3]。虽然近年来国内外学者[13]–[14]在SACC治疗领域取得了较大的进展，但仍有相当一部分患者会出现复发和转移。究其原因与缺乏有效治疗手段、常规化疗药物疗效不理想有密切关系。因此，探究与SACC发生及进展机制相关的生物学标志物，探索新的药物作用靶点，提高SACC患者对化疗药物的敏感性，改善患者长期存活率和生活质量，对SACC临床诊断和治疗具有重要的价值。

研究[15]–[16]证实，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）在SACC中的表达高于正常涎腺组织，提示其在SACC的发生发展中起着重要的作用。另外，EFGR在SACC血管床的生成中可能发挥着重要的作用，并有利于肿瘤沿着血管侵袭生成和发生远处转移，同时是化学治疗药物抗性的重要基础[17]。PKD作为EGFR下游信号传导蛋白，如果从基因水平抑制PKD表达和磷酸化活化，阻断表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）信号传导通路，抑制肿瘤的生长，为临床开发使用PKD抑制剂提供了理论基础[18]。新近开发了几种新的靶向PKD1的小分子抑制剂，包括CRT0066101、CRT5、CID755673和kb-NB-142-70[10],[19]。这些化合物在体外细胞实验中均显示出抑制PKD活性的作用，而在体内实验中，目前只有CRT0066101在动物模型中给药成功，且没有脱靶效应。此外，用CRT0066101处理的小鼠在胰腺癌、结直肠癌和转移性乳腺癌的异种移植模型中没有显示出任何痛苦迹象（说明没有不良反应），且没有发现对正常组织结构功能有不良反应（即对导管功能的影响）[20]–[21]，为本研究使用CRT-0066101靶向SACC治疗提供强有力的支持。本研究发现CRT0066101能有效抑制SACC-LM细胞中PKD的活性，且呈浓度依赖性。本研究探讨了PKD磷酸化对SACC细胞迁移能力的影响，研究发现CRT0066101在肿瘤细胞迁移中起到抑制细胞迁移的作用。

肿瘤的发生发展是一个长期的多因素参与的多步骤过程。在这一过程中，EMT在肿瘤进展中具有重要意义[22]。近年来研究[14]证实，EMT能促进SACC的发生发展、侵袭和转移，增加肿瘤对化疗药物的抗性，并且与SACC预后不良密切相关。EMT发生的主要分子特征为上皮细胞标志物E-cad丢失的同时间质细胞标志物N-cad等表达水平的上调，其中，E-cad是细胞紧密连接的中心复合物，其表达的降低或缺失与肿瘤的分化、分期、侵袭、转移以及预后密切相关[23]–[24]。因此，E-cad是一种典型的肿瘤侵袭抑制分子，是EMT最主要的标志物之一。E-cad失调的重要机制之一是其编码基因CDH1在转录水平受到Snail、ZEB1、ZEB2、Twist、Slug等转录因子的影响，它们和CDH1基因的启动子结合，抑制E-cad转录[23],[25]。Snail为EMT调控，属于转录抑制子中的Snail超家族，通过与近E-cad编码基因启动子区域的E-boxes结合抑制E-cad表达，诱发EMT[25]–[26]。本研究发现，用CRT0066101抑制SACC细胞中PKD磷酸化活化，发现SACC细胞E-cad表达上调，N-cad表达下调。与对照组细胞相比，CRT0066101处理细胞的Snail基因的mRNA表达量无明显差异，而蛋白量减少，表明CRT0066101不影响Sanil基因的转录。Snail在细胞内是一种高度不稳定性蛋白，主要由泛素蛋白酶体系统调节其泛素化降解。用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞，发现对照组细胞Snail蛋白的表达逐渐升高，实验组细胞的Snail蛋白表达逐渐恢复至正常水平，表明CRT0066101对Snail蛋白的降解调节是依赖于蛋白酶体途径的。提示CRT0066101可能调节Snail蛋白酶体降解，促进E-cad表达，有效抑制SACC进展中EMT的发生。

综上所述，CRT0066101作为新近开发的靶向PKD的特异性小分子抑制剂，可有效抑制SACC细胞迁移能力，其机制可能与调节Snail蛋白酶体降解，促进E-cad表达有关。提示靶向PKD的小分子抑制剂可以有效治疗转移性SACC，为SACC治疗提供了新的策略。

Funding Statement

[基金项目] 国家自然科学基金（81802717）；四川省科技厅项目（2020YJ0290）

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81802717); The Sichuan Science and Technology Project (2020YJ0290).