靶向CD33抗原三特异性T细胞衔接器的制备及对白血病细胞的作用研究

Abstract

Objective

To investigate the effect of CD33-targeted bi-specific and tri-specific T-cell engagers on T-cell proliferation and explore their cytotoxicity on leukemia cells.

Methods

The CD33-targeted bi-specific T-cell engager（CD33-BiTE）and tri-specific T-cell engager（CD33-TriTE）expression vectors were successfully constructed and expressed through a eukaryotic cell expression system. CD33-BiTE and CD33-TriTE were purified by affinity chromatography. The effects of CD33-BiTE and CD33-TriTE on T cells were analyzed through in vitro experiments.

Results

① CD33-BiTE and CD33-TriTE were successfully constructed and purified and could compete with flow cytometry antibodies for binding to the target cells. ② After 12 days of co-culture with CD33-BiTE and CD33-TriTE, the number of human T cells were expanded to 33.89±19.46 and 81.56±23.62 folds, respectively. CD33-TriTE induced a stronger proliferation of T cells than CD33-BiTE（P<0.05）. ③ Both CD33-BiTE and CD33-TriTE induced specific dose-dependent cytotoxicity on CD33⁺ leukemia cells. ④ Compared to CD33-TriTE, leukemia cells were prone to express PD-L1 when co-cultured with T cells and CD33-BiTE. CD33-TriTE induced powerful cytotoxicity on leukemia cells with high PD-L1 expression.

Conclusion

CD33-BiTE and CD33-TriTE expression vectors were constructed, and fusion proteins were expressed in eukaryotic cells. Our results support the proliferative and activating effects of BiTE and TriTE on T cells. Compared to that of CD33-BiTE, CD33-TriTE induced a stronger proliferative effect on T cells and a more powerful cytotoxicity on leukemia cells with high PD-L1 expression.

急性髓系白血病（AML）治疗方案由基于柔红霉素或去甲氧柔红霉素及阿糖胞苷为基础的“7+3”化疗方案及后续巩固治疗及造血干细胞移植组成，60％～80％年轻患者和40％～60％的老年患者能得到缓解[1]，但仍有部分患者出现难治或复发[2]。近年来，免疫治疗如嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）被应用于AML的治疗中[3]；针对白血病细胞上CD33的高表达，靶向CD33的抗体偶联药物已被应用于临床一线治疗[4]；同时，各种靶向CD33的双特异性T细胞衔接器（BiTE）也正在进行相关临床前及临床研究[5]–[8]。本研究中，我们开发了一种靶向CD33的BiTE，并在BiTE的基础上加入CD80胞外段，构成三特异性T细胞衔接器（TriTE），对BiTE及TriTE功能活性进行了比较。

材料与方法

一、主要材料、试剂

ExpiCHO-S细胞、ExpiCHO瞬时转染试剂购于美国Thermo Fisher公司；His Tag蛋白纯化柱购于美国GE公司；蛋白脱盐及浓缩柱购于美国Milllipore公司；蛋白定量His-ELISA检测试剂盒购于南京金斯瑞生物科技股份有限公司；淋巴细胞培养液购于美国Corning公司；RPMI 1640培养基购于美国Gibco公司；胎牛血清购于法国Biowest公司；重组人IL-2因子购于美国R&D公司；EndoFree Plasmid Maxi质粒抽提试剂盒购自美国Invitrogen公司；ONE-Glo Luciferase活性检测试剂盒购自美国Promega公司。所有流式一抗均购于美国Biolegend公司；RossetteSep T细胞富集试剂购于美国Stem Cell公司。

二、细胞株培养

人AML细胞系Molm13细胞、过表达Luciferase基因的Molm13-luc2细胞、Jurkat细胞、Namalwa细胞培养于含10％胎牛血清RPMI 1640培养液；人T细胞用Ficoll淋巴细胞分离液及RossetteSep T细胞富集试剂富集后，培养于含10％胎牛血清、100 IU/ml重组人IL-2因子培养液中。

三、载体构建及蛋白表达

CD33单链可变区片段（scFv）及CD3 scFv为本实验室前期构建的知识产权序列[9]–[10]。CD80胞外段表达区序列从NCBI查询获取。将CD33 scFv-CD3 scFv或CD33 scFv-CD80-CD3 scFv克隆到pcDNA3.4质粒，并送测序鉴定。参照ExpiCHO瞬时转染表达系统手册转染ExpiCHO细胞，转染第14天收取细胞培养基，1 962×g离心30 min取上清液。Western blot验证蛋白表达后，用0.45 mm滤膜过滤后进行标签为His tag的镍柱纯化，使用不同浓度的咪唑进行漂洗和洗脱。纯化后蛋白使用Millipore超滤浓缩柱进行脱盐及浓缩，使用His-ELISA试剂盒定量。

四、竞争结合活性检测

将等浓度CD33-BiTE与CD33-TriTE分别加入表达CD33的Molm13细胞系及表达CD3的Jurkat细胞系共孵育30 min，而后加入CD33或CD3流式抗体竞争结合共孵育30 min，流式细胞术检测靶抗原荧光强度下降情况。

五、对人T细胞活化增殖作用

1. T细胞增殖绝对值计数：用0.1 nmol/L的CD33-BiTE或CD33-TriTE蛋白与T细胞共孵育，加入50 U 人IL-2，对照组加入等体积PBS。在37 °C，5％CO₂孵箱中培养，从第4天起每隔1天使用细胞计数仪计数，计算T细胞增殖情况。

2. T细胞活化及分群检测：以上条件培养T细胞时，取第4天细胞上流式细胞仪检测CD8⁺ T细胞CD25表达代表活化情况。取第8天细胞上流式细胞仪检测CD8⁺T细胞比例。

六、介导人T细胞对白血病细胞的杀伤作用

1. 流式细胞术检测AML细胞系及患者原代AML细胞中CD33的表达情况：用FITC标记的抗CD33单抗标记Molm13细胞、Namalwa细胞，检测CD33的表达水平。

2. 流式细胞术检测BiTE及TriTE细胞的体外杀伤活性：在0.1 nmol/L的BiTE或TriTE培养基体系里，人T细胞与Molm13细胞、Namalwa细胞按效靶比2∶1共培养24、60 h，标记CD33或CD22、CD3流式抗体并检测CD33⁺靶细胞及CD3⁺ T细胞比例，记录剩余靶细胞比例为不同时间CD33⁺靶细胞与0 h起始CD33⁺靶细胞比例。

3. 萤火虫萤光素酶化学发光发检测BiTE及TriTE细胞的体外杀伤活性：在不同浓度的BiTE或TriTE培养基体系里，人T细胞与实验室建立的携带萤火虫Molm13-luc2细胞系按效靶比2∶1共培养72 h后，加入100 ml ONE-Glo Luciferase活性检测试剂，室温孵育10 min后使用酶标仪检测并计算杀伤活性。

杀伤活性＝（杀伤率_样品孔−杀伤率_基线孔）/（1−杀伤率_基线孔）×100％

4. 脱颗粒实验分析T细胞被BiTE及TriTE激活：在0.1 nmol/L的BiTE或TriTE培养基体系里，人T细胞与Molm13细胞、Namalwa细胞按效靶比2∶1共培养5 h后（同时加入莫能霉素抑制蛋白转运），流式细胞仪检测CD8⁺ T细胞CD107a表达比例，反映细胞激活比例。

七、构建过表达PD-L1的Molm13细胞系

PD-L1序列来源于NCBI查询获取，将合成的PD-L1序列克隆至慢病毒载体中。应用Lipo3000脂质体转染法分别将PD-L1慢病毒载体质粒、Gag-pol质粒、VSV-G质粒共同转入293T包装细胞系，培养24～72 h收集病毒上清。慢病毒上清经离心沉淀后加入Molm13细胞系，同时添加Polybrene 6 µg/ml，706×g 31 °C离心1.5 h促进转染。转染6 h后换液，流式抗体标记PD-L1并测定表达。

八、统计学处理

采用GraphPad Prism 8.0.2软件进行统计学分析。实验重复3次，连续型变量以均值±标准差表示，组间差异分析采用单因素方差分析，组内两两比较采用SNK检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1. BiTE及TriTE结构设计及亲和力结合特异性鉴定：将CD33scFv-CD80胞外表达区-CD3scFv基因序列依次串联连接，重组蛋白中的不同基因序列用柔性连接肽相连，成功构建pcDNA3.4-TriTE表达载体。将CD33scFv-CD3scFv基因序列以柔性连接肽相连，成功构建pcDNA3.4-BiTE表达载体（图1A），Linker1为（G4S）₃，Linker2为（G4S）₄。经过真核细胞表达、纯化后获得与His抗体结合的条带，CD33-BiTE与CD33-TriTE在60×10³及110×10³附近有主条带，与预期相符（图1B）。

图1. CD33-BiTE及CD33-TriTE结构设计及表达鉴定.

BiTE：双特异性T细胞衔接器；TriTE：三特异性T细胞衔接器；A：CD33-BiTE及CD33-TriTE结构示意图；B：考马斯亮蓝及Western Blot鉴定CD33-BiTE及CD33-TriTE蛋白表达（1：CD33-BiTE/Western Blot；2：CD33-BiTE/考马斯亮蓝；3：CD33-TriTE/Western Blot；4：CD33-TriTE/考马斯亮蓝）

将CD33-BiTE与CD33-TriTE分别加入表达CD33的Molm13细胞系及表达CD3的Jurkat细胞共孵育，而后加入CD33或CD3流式抗体竞争结合，可见CD33-BiTE与CD33-TriTE均能封闭CD33或CD3的抗原抗体结合位点（图2A）。表明CD33-BiTE与CD33-TriTE均有与CD33和CD3的抗体亲和结合能力。将CD33-BiTE、CD33-TriTE或PBS与Molm13或T细胞共孵育后，CD33-TriTE组CD80阳性细胞比例增加，考虑为CD33-TriTE结合于Molm13及T细胞表面的CD80胞外段（图2B）。

图2. CD33-BiTE与CD33-TriTE竞争结合活性鉴定（A）及CD80表达鉴定（B）.

BiTE：双特异性T细胞衔接器；TriTE：三特异性T细胞衔接器

2. BiTE及TriTE对T细胞增殖与活化影响：将人T细胞与CD33-BiTE及CD33-TriTE共培养后，对T细胞进行绝对值计数。与PBS组相比，BiTE与TriTE组从第4天起细胞数量明显增加，至第12天细胞计数增至基线值的（33.89±19.46）倍和（81.54±23.62）倍，CD33-TriTE促T细胞增殖能力明显高于CD33-BiTE（P<0.05）（图3A）。培养第4天检测CD8⁺ T细胞CD25表达情况，PBS组、BiTE组、TriTE组中CD8⁺ T细胞中CD25⁺细胞比例分别为（5.04±2.39）％、（68.94±11.36）％和（74.47±16.37）％，BiTE组及TriTE组均明显高于PBS组（P值均<0.01），而BiTE组及TriTE组之间差异无统计学意义（图3B），表明CD33-BiTE及CD33-TriTE组均可刺激T细胞活化。培养第8天检测CD8⁺细胞表达比例，PBS组、BiTE组、TriTE组CD8⁺ T细胞比例分别为（32.74±4.19）％、（74.32±5.12）％及（80.35±3.79）％，BiTE组及TriTE组均明显高于PBS组（P值均<0.01），而BiTE组及TriTE组之间差异无统计学意义（图3C），表明CD33-BiTE及CD33-TriTE可使T细胞向CD8⁺ T细胞转化。

图3. CD33-BiTE及CD33-TriTE对T细胞增殖（A）、活化（B）及分群（C）的影响（^a P<0.05、^b P<0.01）.

BiTE：双特异性T细胞衔接器；TriTE：三特异性T细胞衔接器

3. BiTE及TriTE对T细胞杀伤功能影响：将T细胞与表达CD33的Molm13细胞系按2∶1效靶比共培养，同时加入0.1 nmol/L CD33-BiTE及CD33-TriTE进行T细胞脱颗粒实验。CD33-BiTE及CD33-TriTE在表达CD33的Molm-13细胞中，PBS组、BiTE组及TriTE组CD8⁺ T细胞中CD107a表达比例分别为（10.73±4.85）％、（32.68±9.85）％及（34.96±11.95）％（图4A），其中PBS组明显低于BiTE组和TriTE组（P值均<0.01），而BiTE组与TriTE组差异无统计学意义。将不同浓度（0.001、0.01、0.1、1 nmol/L）BiTE及TriTE加入T细胞及Molm13-Luc2的共培养体系（效靶比为2∶1）中，共培养72 h，根据特异性杀伤比例计算浓度杀伤曲线，两组特异性杀伤均与浓度相关，且两组促杀伤效果无明显差异（图4B）。根据浓度梯度杀伤曲线，BiTE和TriTE均在0.1 nmol/L时达到杀伤峰值，故选用0.1 nmol/L 进行后续实验。将0.1 nmol/L CD33-BiTE及CD33-TriTE分别与表达CD33的Molm13细胞系及不表达CD33的Namalwa细胞系共培养，检测24 h及60 h的剩余靶细胞比例。在Molm13细胞系中，BiTE组与TriTE组均较PBS组杀伤明显（P值均<0.05），而Namalwa细胞系中，BiTE组杀伤作用较PBS组明显（P<0.05），而TriTE组与PBS组差异无统计学意义。

图4. CD33-BiTE及CD33-TriTE介导T细胞与靶细胞共培养脱颗粒实验及杀伤实验（^aP<0.05，^bP<0.01，^cP<0.0001）.

BiTE：双特异性T细胞衔接器；TriTE：三特异性T细胞衔接器；A：脱颗粒实验；B：浓度梯度杀伤曲线；C：对Molm13细胞杀伤曲线；D：对Namalwa细胞杀伤曲线

4. BiTE及TriTE对T细胞免疫检查点的影响：将CD33-BiTE与CD33-TriTE加入Molm13细胞系与T细胞共培养24 h后，检测剩余靶细胞中PD-L1的表达情况。结果显示PBS组、BiTE组及TriTE组靶细胞PD-L1阳性率分别为（13.33±3.34）％、（46.32±9.77）％及（18.87±5.74）％，其中BiTE组明显高于PBS组及TriTE组（P值均<0.05），而TriTE组与PBS组差异无统计学意义（图5A）。表明与CD33-TriTE相比，CD33-BiTE在杀伤的同时更容易诱导肿瘤细胞系表达PD-L1。共培养36 h后，PBS组、BiTE组及TriTE组CD8⁺ T细胞PD-1阳性率分别为（0.10±0.09）％、（17.80±3.80）％及（11.26±2.87）％，BiTE组和TriTE组较PBS组均明显升高（图5B）。构建过表达PD-L1的Molm13细胞系与T细胞共培养72 h，在0.1 nmol/L浓度下，TriTE组的T细胞对过表达PD-L1的Molm13细胞系杀伤能力更强（P<0.05）（图5C），提示可能在肿瘤细胞出现PD-L1表达的免疫抑制状态下，CD33-TriTE对肿瘤细胞的杀伤较CD33-BiTE更好。

图5. CD33-BiTE及CD33-TriTE诱导共培养的Molm13细胞系PD-L1表达（A）、T细胞PD-1表达（B）及对Molm13-PDL1细胞系杀伤实验（C）.

BiTE：双特异性T细胞衔接器；TriTE：三特异性T细胞衔接器

讨论

AML的传统化疗及造血干细胞移植后，仍有部分对化疗不敏感的难治性患者及复发患者，这部分患者预后较差。大多数AML肿瘤细胞表达CD33，而且在肿瘤干细胞上仍有表达[9]，因此提供了靶向CD33的各种免疫治疗的可能。目前靶向CD33治疗急性髓系白血病的免疫治疗多种多样，如嵌合抗原受体T细胞疗法[10]–[11]及抗体偶联药物[12]–[13]等。

特异性T细胞衔接器的理论基础在于一端为CD3抗体连接并活化T细胞，而另一端为肿瘤靶细胞抗体连接肿瘤细胞，将肿瘤细胞与T细胞连接后可增加T细胞对肿瘤细胞的杀伤[14]。我们研究开发了一种靶向CD33的BiTE，并在BiTE的基础上加入CD80胞外段，构成TriTE。蛋白在体内的半衰期的长短与蛋白分子量大小有关[15]，当蛋白分子量小于70×10³时，直接从正常的肾小球中滤过，半衰期较短，而加入了CD80胞外段的TriTE的分子量大于70×10³，因此相对于BiTE而言，TriTE不会直接从肾小球滤过，因此可能会延长药物在体内的半衰期。同时CD80胞外段提供了共刺激信号，增加了T细胞增殖的活性。本实验室前期构建CD19的三特异性抗体可使T细胞增殖活化及促进其杀伤功能[16]。

有研究发现在进行BiTE治疗过程中，肿瘤细胞的PD-L1表达呈现升高趋势[17]，而PD-L1与肿瘤免疫逃逸相关[18]。在AML患者中，PD-L1表达增高与不良预后有关[19]。有研究报道，同样是靶向CD33-BiTE的AMG 330，在添加到原代AML细胞中引起PD-L1的上调。PD-L1的上调与细胞因子相关，其中IFN-γ和TNF-α诱导了PD-L1的表达[20]。与本实验CD33-BiTE能增加PD-L1的表达一致，而增加了CD80胞外段的CD33-TriTE却较少诱导肿瘤细胞PD-L1的表达。

目前研究发现，抗原提呈细胞上大量表达CD80时，PD-L1不能与PD-1结合，从而抑制T细胞激活。在蛋白水平上，也观察到了PD-1和CD80之间对PD-L1结合的竞争。因此，该研究团队认为可以使用可溶性CD80作为提高T细胞对肿瘤杀伤的药物[21]。另一方面，研究者发现在AMG 330的基础上加入PD-L1/PD-1阻滞剂能增强AMG 330对PD-L1升高的原代AML细胞的杀伤作用[20]。在此基础上，研究人员使用PD-L1胞外段连接靶向CD33-BiTE构建的CiTE，通过阻断PD-L1/PD-1结合，对高表达PD-L1的靶细胞具有更好的杀伤作用[6]。基于这些前期研究基础，我们使用CD80胞外段作为另一种阻断PD-1/PD-L1轴的方式，同样获得了对高表达PD-L1靶细胞的杀伤效果。因此我们推测CD33-TriTE可能对于PD-L1表达升高的AML患者更有效。

本实验研究BiTE和TriTE介导的特异性杀伤作用时，使用的T细胞为供者来源的，而靶细胞是细胞系，可能存在HLA不相合的情况，最好应使用同一患者来源的T细胞及肿瘤细胞重复杀伤实验。另外，BiTE与TriTE在体内对T细胞增殖和杀伤作用仍需进一步实验研究。综上，本研究中我们成功构建了双特异性及三特异性T细胞衔接器，验证了其对T细胞的增殖活化及促杀伤功能。通过比较发现，CD33-TriTE较CD33-BiTE增殖效果更强，且对PD-L1高表达的细胞杀伤作用更好。

Funding Statement

基金项目：国家重点研发计划（2021YFC2500300）；国家自然科学基金（81830005）；中国医学科学院创新工程项目（2021-1-I2M-041）

Fund program: National Key R&D Program of China（2021YFC2500300）; National Natural Science Foundation of China（81830005）; CAMS Initiative Fund for Medical Sciences（2021-I2M-1-041）