JAG1影响血管生成并促进三阴性乳腺癌细胞的迁移、侵袭和粘附

Abstract

Objective

To investigate the effect of JAG1 on the malignant phenotype of triple-negative breast cancer (TNBC) and its role in angiogenesis in breast cancer microenvironment.

Methods

The expressions of Notch molecules were detected in human TNBC 231 and 231B cells using RT-qPCR. Five female nude mice were inoculated with 231 cells and another 5 with 231B cells into the mammary fat pads, and 4-6 weeks later, the tumors were collected for immunohistochemical and immunofluorescence tests. 231 cells and 231B cells were treated with recombinant JAG (rJAG) protein and DAPT, respectively, and changes in their malignant phenotypes were assessed using CCK-8 assay, Hoechst 33258 staining, wound healing assay, Transwell chamber assay and endothelial cell adhesion assay. Western blotting was used to detect the changes in the expressions of proteins related with the malignant phenotypes of 231 and 231B cells. The effects of conditioned medium (CM) derived from untreated 231 and 231 B cells, rJAG1-treated 231 cells and DAPT-treated 231B cells on proliferation and tube formation ability of cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were evaluated using CCK-8 assay and tube-forming assay.

Results

The expression of JAG1 was higher in 231B cells than in 231 cells (P < 0.05). Tumor 231B showed higher expression of VEGFA and CD31. Compared with 231-Blank group, the migration, invasion and adhesion of 231 cells in 231-rJAG1 were significantly enhanced (P < 0.05). Protein levels of Twist1 and Snail increased (P < 0.01), anti-apoptotic protein Bcl-2 increased (P < 0.05), while DAPT inhibited the related phenomena and indicators of 231B. The 231-rJAG1-CM increased the cell number and tubule number of HUVEC (P < 0.05).

Conclusion

JAG1 may affect the malignant phenotype of TNBC and promote angiogenesis in the tumor microenvironment.

三阴性乳腺癌（TNBC）患者得益于早期筛查和联合治疗，5年生存率得到了显著提高^[1]，但由于TNBC与其他类型乳腺癌相比，其更容易发生侵袭、转移和复发^[2]，且不能从内分泌或分子靶向治疗中获益，四期TNBC患者的5年生存率仅为28%左右^{[3, 4]}。TNBC较高的血管密度为肿瘤生长提供大量的营养物质^{[5, 6]}，从而促进其恶性进展和侵袭转移^[7]，因此靶向血管生成可能是其治疗的突破口之一。目前TNBC抗血管治疗主要以血管内皮细胞生长因子（VEGF）信号通路为靶点，代表药物有贝伐单抗、阿帕替尼等，但临床试验^[8]显示，用药后TNBC患者的总生存期（OS）无明显改善，并且由于替代性促血管生成因子的上调^[9-11]，耐药也成为抗血管治疗的重要挑战。关于肿瘤血管生成，目前较为明确的是VEGF^[12]和DLL4/Notch1^{[13, 14]}信号通路。Notch信号在进化过程中较为保守，几乎在所有器官中表达，协调细胞增殖、分化和凋亡，决定细胞命运^[15]；其有4个受体（Notch1，Notch2，Notch3，Notch4）和5个配体（JAG1，JAG2，DLL1，DLL3，DLL4^[16]，与乳腺癌的发生发展关系已经得到证实，但不同配体和受体其的作用具有一定异质性，比如JAG1与乳腺癌的骨转移和不良预后相关^[17]；缺氧诱导的JAG2可以促进乳腺癌转移和干细胞的自我更新^[18]；DLL1通过影响细胞增殖和血管生成来促进管腔型乳腺癌的肿瘤生长和转移^[19]，并且DLL1与乳腺癌化疗耐药有关^[20]；DLL4在乳腺癌细胞中也过表达，并与淋巴结和远处转移有关^[21]。众所周知，Notch1在乳腺癌中主要作为癌基因发挥作用，而Notch2在乳腺癌中的具体作用仍然不明确^[22]。Notch 3通过抑制乳腺癌的EMT从而抑制肺转移^[23]，但是也有功能研究^[24-26]证明Notch 3可以促进基底乳腺癌的生长，表现出促癌作用；Notch 4可以触发与乳腺癌转移和复发相关的EMT过程^[27]。不同Notch分子发挥着不同的功能，因此需要系统研究Notch信号在乳腺癌中的作用。

现有的研究显示，DLL4-Notch1也参与了肿瘤血管生成^[28]，但Notch信号通路中的其他配体，比如JAG1等，在肿瘤血管生成中的研究较少^[29-31]，而JAG1与乳腺癌血管生成的关系尚未还未见报道。因此，本研究拟通过体内外实验明确JAG1对TNBC增殖、迁移、侵袭等生物学功能的影响，初步研究JAG1对TNBC微环境血管生成的影响，探讨其是否能成为TNBC的诊疗新靶点。

1. 材料和方法

1.1. 材料

人正常乳腺上皮细胞MCF-10a、TNBC细胞MDA-MB- 231（231）、侵袭性TNBC细胞MDA- MB-231- B（231B）以及人脐静脉内皮细胞（HUVEC）保存于重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室。JAG1重组蛋白（rJAG1）及DAPT（MedChemExpress）；胎牛血清（BS）、青霉素、链霉素（S110JV）和DMEM高糖培养基（上海源培生物）；MCF-10a细胞专用培养基（武汉普诺赛）；基质胶（matrilgel matrix 356234）及Transwell小室（康宁）；RNA快速提取试剂盒（ES-RN001）（上海奕杉生物科技）；RT-PCR及Q-PCR相关试剂（TaKaRa）；蛋白质提取与定量试剂、Western blot相关试剂、DAPI、Hoechst染色试剂盒及HE染色试剂盒均（上海碧云天）；ECL发光液（Millipore）；鼠抗人β-actin抗体（钟鼎生物）；兔抗人JAG1、Twist1、Snail、Cyclin-B1、Cyclin-E、Bcl-2、VEGFA、CD31抗体（沈阳万类生物科技）；兔抗人ERK及p-ERK抗体（Abcam）；小鼠SP试剂盒，兔SP试剂盒，二抗（山羊抗鼠IgG/HRP标记，山羊抗兔IgG/ HRP标记）（中杉金桥）；兔抗人FITC荧光二抗（protein-tech）；Q-PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2. 方法

1.2.1. 细胞培养

MCF-10a正常乳腺上皮细胞用专用培养基培养，231、231B和HUVEC用含1000 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素和100 mL/L FBS的DMEM培养基培养，并静置于37 ℃、50 mL/L CO₂的培养箱。细胞用2.5 g/L的胰蛋白酶消化传代。处于对数生长期的细胞用于实验。

1.2.2. 细胞处理及分组

231和231B细胞生长至对数生长期后，胰蛋白酶消化1 min，传代接种于20 cm²的培养皿内（1×10⁶），待细胞长至50%~60%的汇合度。弃去原培养基，每个培养皿加入2 mL新鲜培养基。rJAG1以50 ng/mL的量加入231细胞培养皿，DAPT以50 μmol/L的浓度处理231B细胞。TNBC实验细胞分为4组：（1）231空白对照组（231- Blank）；（2）rJAG1处理231组（231-rJAG1）；（3）231B空白对照组（231B-Blank）；（4）DAPT处理231B组（231B-DAPT）。轻轻晃动混匀后放孵箱培养24~48 h，用于细胞功能实验。收集上述各组乳腺癌细胞条件培养基（CM）用于后续血管实验。以CM：新鲜培养基=1∶1的比例处理HUVEC细胞24~48 h后，进行后续处理。血管生成实验细胞分为5组：（1）HUVEC细胞阴性对照组（NC）；（2）231空白条件培养基处理组（231-Blank-CM）；（3）rJAG1处理231的条件培养基处理组（231-rJAG1-CM）；（4）231B空白条件培养基处理组（231B-Blank-CM）；（5）DAPT处理231B的条件培养基处理组（231B-DAPT-CM）。

1.2.3. 实时荧光定量PCR检测MCF-10a正常乳腺上皮细胞和231、231B乳腺癌细胞中JAG1的表达

细胞中总RNA用RNA快提试剂盒提取，并用紫外分光光度计测其浓度和纯度。取1 μg RNA逆转成cDNA，利用实时荧光定量PCR检测并分析Notch1、Notch2、JAG1、JAG2、DLL1、DLL4、VEGFA和GAPDH的相对表达水平，其中GAPDH作为内参对照。引物序列见表 1。

表 1.

引物序列

Primer sequences for RT-PCR

Name	Forward primer (5'→3')	Reverse primer (5'→3')
JAG1	AACTGGTACCGGTGCGAA	TGATGCAAGATCTCCCTGAAAC
JAG2	AGGTGGAGACGGTTGTTACG	TTGCACTGGTAGAGCACGTC
Notch1	TCAGCGGGATCCACTGTGAG	ACACAGGCAGGTGAACGAGTTG
Notch2	AAAAATGGGGCCAACCGAGAC	AACTGGTACCGGTGCGAA
DLL1	GATGTGATGAGCAGCATGGA	CCATGGAGACAGCCTGGATA
DLL4	GCCAACTATGCTTGTGAATGTCC	CAGTAGGTGCCCGTGAATCC
VEGFA	GGGCAGAATCATCACGAAGT	TGGTGATGTTGGACTCCTCA
GAPDH	GATTTGGTCGTATTGGGCGC	TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC

1.2.4. Western blot法检测231、231B乳腺癌细胞Actin、JAG1、Twist1、Snail、Cyclin-B1、Cyclin-E及Bcl-2蛋白表达

231乳腺癌株用rJAG1处理24~48 h和231B侵袭性乳腺癌细胞株用DAPT处理24~48 h后，收集细胞，使用RIPA裂解后提取总蛋白，并使用BCA法测其浓度。取35 μg蛋白质经10%的SDS-PAGE分离（90 V 30 min，120 V 60 min），210 mA恒流冰浴条件下将蛋白质湿转到PVDF膜上，用50 g/L的牛血清白蛋白于37 ℃摇床上封闭2 h，4 ℃条件下一抗孵育过夜，Actin、JAG1、Twist1、Snail、Cyclin-B1、Cyclin-E及Bcl-2的抗体使用一抗稀释液以1∶1000稀释。TBST洗膜10 min×3次，分别加入HRP标记的1∶5000稀释的山羊抗兔IgG或HRP标记的1∶5000稀释的山羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，ECL发光液显影并统计。

1.2.5. CCK-8法检测JAG1和DAPT对TNBC细胞增殖的影响

将231和231B细胞传入96孔板培养（3000/ 孔），其中231-rJAG1组加入50 ng/mL的rJAG1，231BDAPT组加入50 μmol/L的DAPT，每组设置5个孔，37 ℃孵箱培养0、24、48、72 h后，每孔加入10 μLCCK-8试剂，37 ℃孵育1h后酶标仪测其的光密度（A₄₅₀ nm）。Hoechst染色实验检测JAG1和DAPT对TNBC细胞凋亡的影响。24孔板每孔3×10⁴个231和231B细胞，接受处理24 h后，加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3 min× 2次。加入500 μL/孔Hoechst 33258染色液，染色5 min，PBS洗3 min×2次。荧光显微镜检测呈蓝色的细胞核。

1.2.6. Wound healing实验检测JAG1和DAPT对TNBC细胞迁移的影响

将231和231B细胞传至6孔板（3.0× 10⁵/孔），待细胞长满孔板，使用10 μL的枪头垂直于孔板对细胞划一条直线，PBS洗去漂浮细胞。每孔加入2 mL不含血清的DMEM培养基，其中231-rJAG1组加入50 ng/mL的rJAG1，231B-DAPT组加入50 μmol/L的DAPT。显微镜下拍摄0、24和48 h同一位置的划痕图片。平均划痕愈合率的计算采用以下公式：（0 h划痕宽度-24 h划痕宽度）/0 h划痕宽度和（0 h划痕宽度-48 h划痕宽度）/0 h划痕宽度，其中划痕宽度利用AI软件分析得到。

1.2.7. Transwell小室实验检测JAG1和DAPT对TNBC细胞侵袭的影响

为了检测231和231B乳腺癌细胞的侵袭性，将Transwell小室放入24孔板，上室加入1∶10无血清培养基稀释的基质胶50 μL，随后将24孔板置于37 ℃孵箱1 h。胰蛋白酶消化细胞后用双无培养基重悬，上室加入200 μL含3×10⁴细胞的悬液，下室加入500 μL含10%血清的培养基，37 ℃孵箱培养24 h后，取出上室，4%多聚甲醛固定15 min，0.05%结晶紫染色或DAPI染色10 min，棉签轻轻擦拭掉小室上方细胞，干燥后在倒置显微镜（结晶紫染色）和荧光显微镜（DAPI染色）下观察侵袭到小室下方的细胞数量。

1.2.8. 内皮细胞粘附实验检测JAG1对231细胞粘附的影响

各组231和231B细胞使用GFP病毒转染，24 h后细胞90%以上细胞被转染上GFP绿色荧光蛋白，添加rJAG1/DAPT条件处理24 h。胰蛋白酶消化HUVEC细胞至24孔板，待HUVEC长至满视野后，消化各组乳腺癌细胞，加入3×10⁴/孔231和231B细胞至上述24孔板，随后将24孔板置于37 ℃孵箱1 h。PBS洗去未贴壁细胞，荧光显微镜下观察贴在HUVEC表面的231和231B乳腺癌细胞数量，贴壁细胞使用Image J软件计数。

1.2.9. 基质胶血管形成实验检测TNBC微环境对血管生成的影响

96孔板加入基质胶50 μL/孔，随后将96孔板置于37 ℃孵箱45 min。胰蛋白酶消化HUVEC后，使用231和231B的条件培养基重悬细胞，加入50 μL 3×10⁴细胞至上述96孔板内，放入37 ℃孵箱，4~6 h后倒置显微镜下观察血管形成情况，并对血管节点数进行统计量化。

1.2.10. 免疫组化和免疫荧光实验检测肿瘤VEGFA和CD31表达

雌性裸鼠分为231组（5只，乳腺脂肪垫注射231细胞1×10⁶/只）和231B组（5只，乳腺脂肪垫注射231B细胞1×10⁶/只）。4~6周后取出肿瘤保存于4%多聚甲醛溶液。对肿瘤组织行石蜡切片后，进行免疫组化染色，VEGFA和CD31使用一抗稀释液以1∶200稀释，更多步骤参考中杉金桥小鼠SP试剂盒说明书，倒置显微镜观察VEGFA和CD31表达并拍照。免疫荧光实验中，对组织行冰冻切片，4%多聚甲醛固定15 min，50g/L山羊血清室温封闭1 h，PBS洗3 min×2次，1∶200稀释的VEGFA一抗4 ℃冰箱孵育过夜。荧光二抗室温孵育1 h，PBS洗3 min×2次，DAPI染色10 min，激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光表达强度并拍照。HE染色检测TNBC肝脏转移灶，具体实验步骤参考碧云天HE染色试剂盒说明书，普通光学显微镜观察并拍照。所有涉及动物的实验操作均按照《实验动物护理和使用指南》进行，并经重庆医科大学伦理委员会（2021-023）批准。

1.3. 统计分析

各实验均独立重复3次后，用GraphPad Prism 6进行数据分析。实验数据用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组内差异采用Tukey检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2. 结果

2.1. JAG1与TNBC的恶性程度和不良预后相关

通过Q-PCR实验筛查Notch信号通路相关分子（Notch1、Notch2、JAG1、JAG2、DLL1、DLL4）发现，231细胞的JAG1表达低于MCF-10a正常乳腺上皮细胞（P < 0.05），同时，231B细胞的JAG1表达高于231（P < 0.05）和MCF-10a（P < 0.05）（图 1A），DLL1的表达情况和JAG1一致。PrognoScan数据库分析JAG1对乳腺癌患者无远处转移生存率（DMFS）和无复发生存率（RFS）。发现JAG1高表达的乳腺癌患者有相对较差的DMFS（图 1B）和RFS（图 1C）。

图 1.

JAG1在231B细胞中高表达，并与不良预后相关

JAG1 is highly expressed in 231B cells and is associated with a poor prognosis of breast cancer pa-tients. A: RT-qPCR results. B, C: PrognoScan database analysis of the effect of JAG1 expression on DMFS (GSE2034) and RFS (GSE6532- GPL570). Ns: Not significant. ^*P < 0.05, ^**P < 0.01, ^***P < 0.001, ^****P < 0.0001 (MCF-10a vs 231, MCF-10a vs 231B).

2.2. 动物实验证明高表达JAG1的231侵袭细胞株表达更高的VEGFA和CD31

HE染色裸鼠肝脏组织，接种231B细胞的裸鼠较231表现出更强的肝脏转移（图 2A），肝脏转移常常伴随着大量新生血管的形成，为肿瘤细胞的定植提供营养^[32-34]。免疫组化实验结果显示231B肿瘤比231肿瘤表达更高的VEGFA，且CD31标记的血管数量也更多（红色箭头所示）（图 2B）。免疫荧光染色实验同样表明231B肿瘤较231肿瘤表达更高的VEGFA（图 2C）。

图 2.

TNBC肿瘤中的VEGFA和CD31表达

Protein expression of VEGFA and CD31 in TNBC tumors. A: HE staining of liver metastases(Original magnification: × 400). B: Immunohistochemistry (× 200). Arrow: Expression of CD31. C: Immunofluorescence and laser confocal microscopy (×200).

2.3. JAG1通过抑制凋亡影响TNBC的数量

WB实验结果显示，JAG1重组蛋白可以促进231的JAG1蛋白水平（P < 0.01），而DAPT可以抑制231B的JAG1蛋白表达（P < 0.001，图 3A）。Q-PCR实验结果表明DAPT可以抑制JAG1的基因表达水平（P < 0.01，图 3B）。CCK-8实验结果显示，JAG1对231乳腺癌细胞的增殖没有显著影响（P>0.05），而DAPT处理231B细胞72 h后，其活力明显受到了抑制（P < 0.05，图 3C）。Western Blot实验检测231和231B增殖相关蛋白显示，JAG1不影响231的Cyclin-B1和Cyclin-E表达，而DAPT可以显著抑制231B的Cyclin- B1（P < 0.0001）和Cyclin-E（P < 0.05）的蛋白表达（图 3D）。Hoechst染色结果显示（图 3E），231细胞经过rJAG1处理后，细胞凋亡出现了明显的减弱，231空白对照组细胞凋亡数为8.0±0.9个/ 视野，rJAG1处理组细胞凋亡数为4.5±0.6个/视野，rJAG1处理组较空白组凋亡数显著降低（P < 0.05）。同样，DAPT-231B组的细胞凋亡数为10.5±1.0个/视野，231B空白对照组的细胞凋亡数为4.0±0.9个/视野，DAPT处理组较空白组凋亡数显著升高（P < 0.01）。Western blot结果同样显示，233细胞经过rJAG1处理后，可上调231细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的水平（P < 0.05），相反，DAPT处理231B细胞则会下调其抗凋亡蛋白Bcl-2的表达（P < 0.05，图 3F）。

图 3.

JAG1抑制TNBC的凋亡

JAG1 inhibits apoptosis of TNBC cells. A: Western blotting. B: RT- qPCR results. C: CCK8 assay. D: Western blot assay. E: Hoechst staining (×200). F: Western blot assay. ^*P < 0.05, ^**P < 0.01, ^***P < 0.001, ^****P < 0.0001 (231B-Blank vs 231B-DAPT, 231-Blank vs 231-rJAG1).

2.4. JAG1促进TNBC的迁移、侵袭及黏附能力

划痕愈合实验结果显示（图 4A），在rJAG1处理48 h后，231乳腺癌细胞的迁移受到了明显的促进（P < 0.05），愈合率为85.95%，而与231空白对照组相比，48 h后231空白对照组的愈合率仅为58.52%。DAPT处理231B乳腺癌细胞后，231B细胞的迁移能力受到了明显的抑制（P < 0.05），48 h愈合率为36.62%。未加DAPT的231B空白对照组的迁移率为53.31%。使用Transwell小室实验检测rJAG1和DAPT对TNBC细胞侵袭性的影响，在处理24 h后，rJAG1处理组231乳腺癌细胞穿透小室的数量为629个，而231空白对照组穿过了270个细胞；同样使用DAPT处理231B细胞后，其穿过的细胞数（154个）远低于231B对照组穿过的细胞数（397个）（图 4B）。Western blot实验检测231和231B迁移侵袭相关蛋白显示，JAG1促进了231的Twist1和Snail的蛋白表达，而DAPT可以显著抑制231B的Twist1和Snail的蛋白表达（图 4C）。内皮细胞粘附实验表明，DAPT显著（P < 0.01）抑制了231B细胞对血管内皮细胞的粘附性，而rJAG1显著增加了231乳腺癌细胞的粘附性。

图 4.

JAG1促进TNBC的迁移、侵袭和黏附性

JAG1 promotes migration, invasion and adhesion of TNBC. A: Wound healing experiments (×200). B: Transwell assay with crystal violet staining (upper) and DAPI staining (lower, ×200). C: Western blotting. D: Adhesion test (×200). ^*P < 0.05, ^**P < 0.01, *^**P < 0.001, ^****P < 0.0001 (231B-Blank vs 231B-DAPT, 231-Blank vs 231-rJAG1).

2.5. TNBC的JAG1过表达促进血管生成

GEPIA数据库分析JAG1与血管生成因子VEGFA的相关性，发现二者成正相关，差异具有显著统计学意义（P=8.9e-16，图 5A）。在乳腺癌细胞条件培养基处理24~48 h后，231B-DAPT-CM组的HUVEC的VEGFA表达较231B-Blank-CM组明显受到了抑制（P < 0.0001），而231-rJAG1-CM组的HUVEC的VEGFA表达较231-Blank-CM组的VEGFA表达明显升高（P < 0.05，图 5B）。CCK-8的实验证明，乳腺癌的JAG1过表达可促进HUVEC血管内皮细胞的增殖，DAPT可以抑制这一现象（图 5C）。231B条件培养基的促血管生成能力明显强于231的条件培养基（P < 0.05），并且可以被DAPT抑制（图 5D）。

图 5.

TNBC的JAG1过表达促进血管生成

JAG1 overexpression in breast cancer microenvironment promotes angiogenesis. A: GEPIA online database analysis for verification of the correlation between JAG1 and VEGFA. B: RT-qPCR. C: CCK-8 assay. D: Matrix gel angiogenesis assay (×200). ^*P < 0.05, ^**P < 0.01, ^****P < 0.0001 (231B-Blank-CM vs 231B-DAPT-CM, 231-Blank-CM vs 231-rJAG1-CM).

3. 讨论

研究显示，乳腺癌已取代肺癌成为全球肿瘤发病率最高的肿瘤^[32]，占新发肿瘤的11.7%。虽然针对乳腺癌治疗的方法有了长足的进步，包括手术治疗、放疗、化疗和以免疫检查点抑制剂为代表的免疫治疗^{[33, 34]}，但乳腺癌导致的死亡仍占女性癌症患者死亡原因的1/6，尤其是TNBC。由于TNBC的雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2（HER2）为阴性，因此患者不能从内分泌^[35]或分子靶向治疗^[36]中获益；另一方面，研究发现TNBC血管密度高^[37]，患者或许能从抗血管治疗中获益，研究显示现有的抗血管生成药物（靶向VEGFVEGFR）的疗效并未达到预期^[38]，提示关于TNBC的肿瘤血管生成机制研究至关重要。

本研究首先通过实验室研究发现侵袭性强的TNBC细胞株231B中JAG1表达明显增加；JAG1是乳腺癌的预后不良因子之一，与DMFS和RFS显著相关，这一结果与Xue和刘野的临床研究结论一致^{[39, 40]}。进一步裸鼠成瘤实验发现JAG1高表达的231B肿瘤表现出更强的肝脏转移能力，肿瘤组织中血管内皮生长因子VEGFA和血管内皮标志物CD31表达增强。通过生物学功能实验，我们证实JAG1能明显增强231的迁移、侵袭能力，还可通过抑制凋亡促进肿瘤生长，这与Yihong chen等在宫颈癌中的研究一致^[41]。内皮细胞粘附实验表明，DAPT显著（P < 0.01）抑制了231B细胞对血管内皮细胞的粘附性，而rJAG1显著增加了231乳腺癌细胞的粘附性，同样，可以发现侵袭性更强的231B乳腺癌细胞株比普通231细胞株具有更强的黏附性。DAPT可以抑制Notch1、JAG1信号通路的分子表达^[42-44]，本研究中DAPT抑制了231B的生物学功能，由于Notch1在231B中表达低于正常乳腺上皮细胞（P < 0.05），并且231和231B的Notch1表达没有差异，因此JAG1发挥了促进TNBC侵袭性的功能。

那么JAG1对TNBC肿瘤血管生成有什么影响呢？我们通过基因共表达分析发现JAG1与血管内皮生长因子VEGFA成正相关，提示JAG1与VEGFA可能协同促进血管内皮细胞生成。我们利用高表达JAG1的231B条件培养基处理血管内皮细胞，Q-PCR实验和CCK-8实验结果表明其能显著促进血管内皮细胞的增殖能力，而基质胶成管实验表明JAG1高表达的TNBC能明显促进血管内皮细胞的成管能力，这些结果与Tsung-hoying等关于VEGFA对血管生成的影响相一致^{[45, 46]}，支持我们关于JAG1与VEGFA功能相似，协同促进血管内皮细胞的成管能力的猜想。

综上所述，本研究通过一系列体内外功能实验进一步揭示了JAG1对TNBC恶性表型的影响，初步证实JAG1能促进乳腺癌血管生成，可能与VEGFA协同促进血管生成。这一研究结果提示JAG1可以作为TNBC抗血管治疗的潜在靶点，但JAG1是否与DLL4等其他Notch配体相互配合调控肿瘤血管生成，尚需进一步实验证实。

Biography

刘俊平，在读硕士研究生，E-mail: jp666@stu.cqmu.edu.cn