Abstract
目的
探讨高迁移率族蛋白1（HMGB1）在大鼠脑出血后对神经元细胞自噬和凋亡的作用机制。
方法
将20只Wistar大鼠随机分为4组（5只/组）：假手术组（Sham组）、脑出血组、HMGB1中和抗体治疗（anti-HMGB1）组、control IgG组。模型组选择颅内纹状体注射0.2 U/mL胶原酶Ⅳ建立脑出血大鼠模型。Sham组颅内注射2 μL生理盐水，术后尾静脉注射PBS，6 h后再次注入等量PBS；anti-HMGB1组术后尾静脉注射1 mg/kg anti-HMGB1单克隆抗体，6 h后再次注入等量抗体；control IgG组术后尾静脉1 mg/kg anti-IgG单克隆抗体，6 h后再次注入等量抗体。采用改良神经损害程度（mNSS）评分评估大鼠神经功能和损伤程度。TUNEL染色检测纹状体神经元凋亡。Western blot检测血肿周围脑组织神经元细胞HMGB1、自噬蛋白（Beclin-1、LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ）和凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3）的表达。免疫组化检测纹状体组织中HMGB1阳性表达。ELISA检测血清HMGB1含量变化。
结果
造模成功后，脑出血组中mNSS评分增加（P < 0.05），给予anti-HMGB1单克隆抗体后，mNSS评分减少（P < 0.05）。与Sham组相比，脑出血组大鼠纹状体神经元凋亡率增加（P < 0.001），Beclin-1、LC3-Ⅱ、Bax和cleaved caspase-3的表达增加（P < 0.05），而LC3-Ⅰ和Bcl-2的表达减少（P < 0.05），HMGB1含量增加（P < 0.05）。给予anti-HMGB1单克隆抗体后，大鼠纹状体神经元凋亡率减少（P < 0.05），Beclin-1、LC3-Ⅱ、Bax和cleaved caspase-3的表达减少（P < 0.05），而LC3-Ⅰ和Bcl-2的表达增加（P < 0.05），HMGB1含量减少（P < 0.05）。
结论
anti-HMGB1单克隆抗体下调HMGB1水平改善大鼠脑出血后的神经功能，其机制可能是抑制大鼠脑出血后的神经元细胞自噬和凋亡。
Keywords: 高迁移率族蛋白1, 脑出血, 神经元细胞, 自噬, 凋亡
Abstract
Objective
To investigate the effect of suppressing high-mobility group box 1 (HMGB1) on neuronal autophagy and apoptosis in rats after intracerebral hemorrhage (ICH) in rats.
Methods
Rat models of ICH induced by intracerebral striatum injection of 0.2 U/mL collagenase Ⅳ were treated with 1 mg/kg anti-HMGB1 mAb or a control anti-IgG mAb injected via the tail immediately and at 6 h after the operation (n=5). The rats in the sham-operated group (with intracranial injection of 2 μL normal saline) and ICH model group (n=5) were treated with PBS in the same manner after the operation. The neurological deficits of the rats were evaluated using modified neurological severity score (mNSS). TUNEL staining was used to detect apoptosis of the striatal neurons, and the expressions of HMGB1, autophagy-related proteins (Beclin-1, LC3-Ⅱ and LC3-Ⅰ) and apoptosis-related proteins (Bcl-2, Bax and cleaved caspase-3) in the brain tissues surrounding the hematoma were detected using Western blotting. The expression of HMGB1 in the striatum was detected by immunohistochemistry, and serum level of HMGB1 was detected with ELISA.
Results
The rat models of ICH showed significantly increased mNSS (P < 0.05), which was markedly lowered after treatment with anti- HMGB1 mAb (P < 0.05). ICH caused a significant increase of apoptosis of the striatal neurons (P < 0.05), enhanced the expressions of beclin-1, LC3-Ⅱ, Bax and cleaved caspase-3 (P < 0.05), lowered the expressions of LC3-Ⅰ and Bcl-2 (P < 0.05), and increased the content of HMGB1 (P < 0.05). Treatment with anti-HMGB1 mAb obviously lowered the apoptosis rate of the striatal neurons (P < 0.05), decreased the expressions of Beclin-1, LC3-Ⅱ, Bax and cleaved caspase-3 (P < 0.05), increased the expressions of LC3-Ⅰ and Bcl-2 (P < 0.05), and reduced the content of HMGB1 in ICH rats (P < 0.05).
Conclusion
Down- regulation of HMGB1 by anti-HMGB1 improves neurological functions of rats after ICH possibly by inhibiting autophagy and apoptosis of the neurons.
Keywords: high-mobility group box1, intracerebral hemorrhage, neuronal cells, autophagy, apoptosis
脑出血为神经外科急症，其特点是高死亡率和高发病率[1]。虽然近年来在脑出血的诊断和外科手术治疗等方面取得了很大的进步，但是其预后仍较差，其致死率在过去的20年里没有明显降低[2]。因此，了解脑出血的潜在作用机制和识别新的治疗靶点来提高脑出血患者生存率刻不容缓。脑出血后的脑损伤机制与神经炎症反应、细胞凋亡激活和氧化应激密切有关[3]，这些会导致不可逆的神经元死亡[4]。近年来，对脑出血模型的研究表明，自噬途径在脑出血后损伤中也起着重要作用，自噬的调节可能成为脑出血治疗的新靶点[5]。高迁移率族蛋白1（HMGB1）是损伤相关分子模式的一部分，其广泛表达于大多数真核细胞，包括神经细胞[6]。研究表明，HMGB1与细胞自噬、凋亡有关[7-9]。缺血肝研究证实，抑制HMGBI释放可同时抑制细胞凋亡和自噬[10]。HMGB1也能通过与Beclin 1相互作用以增强自噬，导致急性胰腺炎恶化[11]。然而，HMGB1与脑出血后神经元自噬和凋亡相关的机制目前仍没有相关报道。本研究探讨了HMGB1对脑出血大鼠纹状体神经元细胞自噬和凋亡的作用机制。
1. 材料和方法
1.1. 动物
SPF级Wistar大鼠（四川成都达硕生物有限公司），20只，体质量250~300 g，动物许可证号SYXK（川）2019-189。所有实验程序均经伦理委员会批准，并参照《实验动物护理和使用指南》执行。
1.2. 试剂与仪器
RIPA裂解缓冲液、Bradford蛋白浓度测定试剂盒、胶原酶Ⅳ、RapidStepTM ECL试剂（中国成都里来生物科技有限公司）；Anti-Beclin 1 antibody（1∶1000）、Anti-Bcl-2 antibody（中国成都睿琪生物科技有限公司，1∶1000）；Anti-HMGB1 antibody（1∶2000）、Anti-Bax antibody（1∶2000）、Anti-Cleaved Caspase-3 antibody（中国成都旭海润东生物科技有限公司，1∶5000）；AntiLC3-Ⅰ/Ⅱ Antibody（1∶1000）、HMGB1酶联免疫ELISA试剂盒（中国成都妍恩生物科技有限公司）。
1.3. 方法
1.3.1. 造模
根据文献[12]，建立胶原酶Ⅳ诱导的脑出血大鼠模型。用1%戊巴比妥钠（60 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，将其置于俯卧位，固定头部。根据无菌操作的原理，沿经度切开皮肤，露出颅骨，钝性剥离骨膜，暴露前囟，选择前囟前0.2 mm，矢状缝右3.0 mm，颅骨下纹状体处6.0 mm为注射点。用牙科钻穿透该部位的颅骨，30号针头顺着颅骨孔进入纹状体部位约6 mm，将0.2 U/mL胶原酶Ⅳ用微量注射泵以0.5 μL/min的速度给药，注射时间为4 min，注射完毕后，留针2 min防止药物沿针道逆流，退针后用骨蜡封闭颅骨钻孔，缝合皮肤。20只大鼠作为研究对象，腹腔注射20 g/L的戊巴比妥麻醉大鼠后处死，取纹状体组织和血肿周围脑组织样本保存于-80 ℃以待后续实验。根据Zea Longa评分法对造模进行评估，1~3分为造模成功，选取造模成功的大鼠进行后续实验。
1.3.2. 分组
实验将20只Wistar大鼠随机分为4组，假手术组（Sham组）、脑出血组、HMGB1中和抗体治疗（anti-HMGB1）组、control IgG组，5只/组。
1.3.3. 给药
Sham组颅内注射2 µL生理盐水，术后尾静脉注射PBS，6 h后再次注入等量PBS；脑出血组颅内注射0.2 U/mL胶原酶Ⅳ，术后尾静脉注射PBS，6 h后再次注入等量PBS；anti-HMGB1组颅内注射0.2 U/mL胶原酶Ⅳ，术后尾静脉注射1 mg/kg anti-HMGB1单克隆抗体，6 h后再次注入等量抗体；control IgG组颅内注射0.2 U/mL胶原酶Ⅳ，尾静脉注射1 mg/kg anti-IgG单克隆抗体，6 h后再次注入等量抗体。
1.4. 检测指标
1.4.1. 脑出血大鼠神经功能损伤评价
脑出血损伤后1、3、5、7 d和15 d，采用改良神经损害程度评分（mNSS）用于评估神经功能和损伤程度。mNSS评分是对动物的运动，感觉和反射能力的全面评估，包括运动、感觉、反射、平衡共4部分外加肌张力检查。mNSS总分0~18分，主要包括运动测试6分，感觉测试2分，衡量平衡测试6分，反射缺失和异常运动4分，能够正常完成任务不计分，不能完成累计积分，0分为正常，1~6分为轻度损伤，7~12分为中度损伤，13~18分为重度损伤。
1.4.2. TUNNEL法检测纹状体神经元凋亡
给药干预15 d后，处死大鼠，解剖取纹状体，制作成石蜡切片，再将脱蜡、水化、Proteinase K工作液处理。洗片，将TUNNEL反应混合液滴于玻片上孵育后洗片，加DAPI，脱水、透明、封片，采用imageJ软件计算各组凋亡细胞率。
1.4.3. Western blot检测血肿周围脑组织神经元细胞自噬和凋亡相关蛋白表达
给药干预15 d后，处死大鼠，取血肿周围脑组织样本，低温快速研磨成匀浆，通过使用RIPA裂解缓冲液提取蛋白，并通过Bradford蛋白浓度测定试剂盒进行定量检测。提取的蛋白通过SDSPAGE电泳分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，再用Tris-buffer稀释的5%的脱脂奶粉封闭2 h，随后，滴加50 μL的一抗，4 ℃孵育过夜，PBS洗膜，滴加二抗山羊抗兔IgG（HRP）抗体，室温下与膜孵育1 h。最后，采用RapidStepTM ECL试剂显影目的条带。β-肌动蛋白被用作内参。采用image J软件计算各组灰度值。
1.4.4. ELISA检测血清HMGB1含量
给药干预15 d后，取血清，在3000 g，4 ℃下离心4 min，采用酶联免疫吸附测定法分析HMGB1含量。
1.4.5. 免疫组化检测纹状体组织中HMGB1阳性表达
给药干预15 d后，处死大鼠，解剖取纹状体，在10%多聚甲醛中固定24 h，石蜡包埋，切片后进行免疫组化染色分析。纹状体组织在5 μm处连续切片，脱蜡水化，抗原修复，内源性过氧化氢酶阻断，非特异性抗原（山羊血清）封闭，吸去封闭液，与anti-HMGB1抗体（1∶1000）在4 ℃下孵育过夜。然后用含有1%BSA的PBS缓冲液清洗切片，并与二抗（HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体）在37 ℃孵育30 min，含有1%BSA的PBS缓冲液清洗切片，滴加2% DAB溶液显色5 min，流水冲洗。再用苏木精对细胞核进行复染，流水冲洗，返蓝处理10 min，流水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明处理，滴加树脂封片，室温风干。免疫染色结果由两名对实验不知情的独立研究人员进行评估。从每张载玻片中随机选择五个区域，并在400倍放大镜下评估HMGB1阳性表达。
1.5. 统计学处理
实验数据用SPSS 17.0统计软件和GraphPad Prism 5软件进行统计分析。所有的数据都以均数±标准差表示。多组间的比较采用单因素方差分析（Oneway ANOVA）；方差齐时，多重比较采用LSD-t检验；方差不齐时，多重比较采用Dunnett's-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. 脑出血大鼠mNSS神经功能评分
脑出血损伤后1、3、5、7 d和15 d，mNSS评分结果显示，与Sham组相比，脑出血组mNSS评分增加，神经功能下降（P < 0.001，表 1）。给予anti-HMGB1单克隆抗体后5 d，mNSS评分下降，大鼠神经功能损伤缓解（P < 0.05），到15 d后mNSS评分下降至4.21±2.01。对照control IgG组中大鼠神经功能损伤变化与脑出血组一致。
表 1.
各组大鼠mNSS神经功能评分
Changes of modified neurological severity score (mNSS) of the rats in each group following the operation (Mean±SD)
| Group | 1d | 3d | 5d | 7d | 15d |
| ***P < 0.001 vs Sham; #P < 0.05 vs ICH; @P < 0.05 vs anti-HMGB1. | |||||
| Sham | 0.19±0.02 | 0.18±0.02 | 0.16±0.11 | 0.15±0.01 | 0.17±0.01 |
| ICH | 11.06±1.77*** | 13.56±0.85*** | 14.23±0.78*** | 10.23±1.10*** | 9.44±1.13*** |
| Anti-HMGB1 | 11.77±0.87 | 12.45±0.80 | 8.23±1.31# | 6.53±1.12# | 4.21±2.01# |
| Control IgG | 10.89±1.52@ | 12.67±0.98 | 13.75±1.2@ | 11.35±1.16@ | 10.11±1.11@ |
2.2. 检测脑出血大鼠HMGB1的水平变化和蛋白表达情况
Western blot检测脑出血大鼠血肿周围脑组织HMGB1蛋白表达情况，结果显示（图 1A），与Sham组相比，脑出血组中HMGB1蛋白表达增加（P < 0.001）。给予anti-HMGB1单克隆抗体后，HMGB1蛋白表达减少（P < 0.01）。Control IgG组中HMGB1蛋白表达情况与脑出血组一致。ELISA检测脑出血大鼠血清HMGB1含量变化，结果显示（图 1B），与Sham组相比，脑出血组中HMGB1含量增加（P < 0.001）。给予antiHMGB1单克隆抗体后，HMGB1含量减少（P < 0.01）。Control IgG组中HMGB1水平变化与脑出血组一致。免疫组化脑出血大鼠纹状体中HMGB1阳性表达，结果显示（图 1C），与Sham组相比，脑出血组中HMGB1阳性表达增加（P < 0.001）。给予anti-HMGB1单克隆抗体后，HMGB1阳性表达减少（P < 0.05）。Control IgG组中HMGB1阳性表达情况与脑出血组一致。
图 1.
脑出血大鼠HMGB1的水平变化和蛋白表达情况
Changes of HMGB1 expression in the brain tissues and its serum level in ICH rats (scale bar=50 μm). A: Western blot of HMGB1 protein expression. B: Serum HMGB1 levels detected by ELISA. C: Immunohistochemistry for HMGB1 in the striatum. *P < 0.05, ***P < 0.001 vs Sham; ##P < 0.01, ###P < 0.001 vs ICH; @P < 0.05, @@P < 0.01, @@@P < 0.001 vs anti-HMGB1.
2.3. HMGB1对脑出血大鼠纹状体神经元凋亡的影响
TUNEL染色检测纹状体神经元凋亡情况结果显示（图 2），与Sham组相比，脑出血组大鼠纹状体神经元凋亡率增加（P < 0.001）。给予anti-HMGB1单克隆抗体后，大鼠纹状体神经元凋亡率减少（P < 0.001）。对照control IgG组中大鼠纹状体神经元凋亡变化与脑出血组一致。
图 2.
HMGB1对脑出血大鼠纹状体神经元凋亡的影响
Effect of anti-HMGB1 mAb on neuronal apoptosis in the striatum of ICH rats (TUNEL staining, original magnification: × 400). *P < 0.05, ***P < 0.001 vs Sham; ###P < 0.05 vs ICH; @@@P < 0.05 vs anti-HMGB1.
2.4. HMGB1对脑出血大鼠血肿周围脑组织神经元细胞自噬蛋白表达的影响
通过Western blot方法检测Beclin1、LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ的表达，结果显示（图 3），与Sham组相比，脑出血组Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达增加，而LC3-Ⅰ的表达减少（P < 0.001）。给予anti-HMGB1单克隆抗体后，Beclin-1（P < 0.001）和LC3-Ⅱ（P < 0.01）的表达减少，而LC3-Ⅰ的表达增加（P < 0.01）。Control IgG组中自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ的表达变化与脑出血组一致。
图 3.
HMGB1对脑出血大鼠血肿周围脑组织神经元细胞自噬蛋白表达的影响
Effect of anti-HMGB1 mAb on expressions of autophagy proteins in the neurons around the hematoma in ICH rats. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs Sham; ##P < 0.01, ###P < 0.001 vs ICH; @@P < 0.01, @@@P < 0.001 vs anti-HMGB1.
2.5. HMGB1对脑出血大鼠血肿周围脑组织神经元细胞凋亡相关蛋白表达的影响
Western blot方法检测Bax和cleaved caspase-3和Bcl-2的表达结果显示（图 4），与Sham组相比，脑出血组中促凋亡基因Bax和cleaved caspase-3的表达水平增加（P < 0.01），而抗凋亡基因Bcl- 2的表达水平减少（P < 0.001）。给予anti-HMGB1单克隆抗体后，Bax（P < 0.001）和cleaved caspase-3（P < 0.05）的表达减少，而Bcl-2的的表达增加（P < 0.001）。对照control IgG组中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3表达变化与脑出血组一致。
图 4.
HMGB1对脑出血大鼠血肿周围脑组织神经元细胞凋亡相关蛋白表达的影响
Effects of anti-HMGB1 mAb on expressions of neuron apoptosis-related proteins in the brain tissue around hematoma in ICH rats. *P < 0.05, ***P < 0.001 vs Sham; ###P < 0.001 vs ICH; @P < 0.05, @@@P < 0.001 vs anti-HMGB1.
3. 讨论
随着对脑出血损伤机制研究的深入，提高神经细胞存活率、保持神经细胞功能成为探究脑出血治疗方案的重要突破点[13]。向纹状体内注射凝血酶可诱导神经元急性坏死和凋亡[14, 15]。本研究通过注射胶原酶Ⅳ诱导脑出血大鼠模型后，大鼠神经功能减弱，mNSS评分增加，神经元凋亡蛋白和自噬蛋白表达增加，但是在脑出血期间给予anti-HMGB1后，脑出血炎性反应和神经元凋亡和自噬被抑制，最终缓解脑损伤。
HMGB1是神经血管单位内的一种早期促炎细胞因子，在包括神经元和小胶质细胞在内的各种细胞中表达[16]。脑出血后血肿周围神经细胞受损，HMGB1可由坏死或凋亡细胞被动释放，也可由免疫或非免疫细胞主动分泌，成为重要的损伤相关分子模式。研究显示，脑出血患者血清HMGB1水平显著高于正常对照者[17]，同时在脑出血小鼠模型亦观察到同样的结果，即血肿周围组织HMGB1水平显著升高，并于出血后72 h达峰值，出血后5 d表达水平逐渐下降。本研究也发现脑出血组大鼠HMGB1水平和蛋白表达和阳性表达水平显著高于Sham组，说明有大量细胞坏死或凋亡。在脑出血晚期，HMGB1有利于神经血管再生和组织重塑，进而促进神经功能恢复[18]。HMGB1中和抗体已被证明可改善缺血性脑损伤[19]。有学者利用脑出血小鼠模型进行的研究显示，给予anti-HMGBI抗体干预可抑制HMGB1进入血肿周围区细胞外间隙，通过保护血脑屏障完整性，降低血清HMGB1水平，减轻脑水肿抑制小胶质细胞活化，从而改善预后[20]。本研究也证明了给予anti-HMGB1单克隆抗体后，HMGB1水平和蛋白表达明显降低，神经功能损伤显著改善，细胞凋亡情况减少，脑出血损伤有所缓解。
自噬是维持细胞内环境稳定的重要细胞内自我降解过程[21]。目前已经明确自噬在实验性脑出血、缺血性卒中、蛛网膜下腔出血的神经元胶质细胞中被激活[22]。有研究利用透射电镜在线粒体内观察到大量双层膜的自噬小体结构，证实了在脑出血发生后自噬的激活[23]。本研究发现，脑出血大鼠血肿周围脑组织中自噬相关蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达显著增加，而LC3-Ⅰ的表达减少，表明自噬的激活。自噬与细胞凋亡之间存在着复杂的关系。一些研究表明，自噬和凋亡是相互拮抗的，自噬的激活减少了与凋亡相关的细胞死亡，但也其他研究表明，自噬导致细胞凋亡并加重细胞死亡[24]。有学者发现在脑出血后，凝血酶能促进LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转换，并推测凝血酶可能参与脑出血后的自噬过程；同时也发现在体外培养的星形胶质细胞中，给予自噬抑制剂3-MA加剧了细胞死亡[25]。有研究在胶原酶Ⅳ诱导的脑出血小鼠模型中发现给与自噬的抑制剂3-MA或激活剂雷帕霉素后，抑制自噬减轻了脑出血引起的脑损伤，而上调自噬加重了脑出血后的脑损伤程度，并且自噬可以通过激活细胞凋亡通路调节脑出血引起的神经细胞损伤[26]。研究发现伴随着脑损伤的加重，神经元凋亡的增多，Bax呈过表达状态，而Bcl-2的表达被抑制[12]。而本研究发现，脑出血大鼠血肿周围脑组织中凋亡相关蛋白Bax和cleaved caspase-3的表达水平明显增加，Bcl-2的表达水平明显减少，表明脑出血后自噬促进凋亡的发生。此外，有研究指出HMGB1能够通过调节细胞自噬的发生，从而影响细胞的凋亡过程[27]。细胞浆内的HMGB1主要是通过与自噬因子Beclin1结合，推动Beclin1与凋亡抑制因子Bcl-2的分离而促进Beclin1和Ⅲ型磷酸肌醇3激酶/Vsp34结合，从而激活自噬。另外还有研究表明HMGB1可激活信号通路MAPK还促使Bcl-2发生磷酸化，使得Bcl-2与Beclin1发生分离，调节自噬的发生[28]。此外，HMGB1还通过影响Bcl-2和Bcl 2的相互作用，促进上皮细胞的自噬作用，抑制1，3-β-葡聚糖诱导的小鼠肺部炎症反应[29, 30]。在本研究中，给予anti-HMGB1干预，显著减少Beclin1、LC3-Ⅱ、Bax和cleaved caspase-3的表达和显著增加LC3-Ⅰ和Bcl-2的表达，这表明anti-HMGB1可以抑制脑出血大鼠血肿周围脑组织神经元细胞自噬和凋亡过程。
综上所述，HMGB1可能通过调节脑神经细胞自噬途径调控脑出血后神经元的凋亡过程，从而发挥组织损伤和修复的双重调节作用，因此HMGB1可能是脑出血后神经损伤的一个重要治疗靶点。
Biography
张列，硕士，E-mail: 591136139@qq.com
Funding Statement
成都医学院四川养老与老年健康协同创新中心资助项目（YLZBZ2014）
Contributor Information
张 列 (Lie ZHANG), Email: 591136139@qq.com.
夏 勋 (Xun XIA), Email: xxsjwk6600@126.com.
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