Abstract
目的
探讨mibefradil对肥胖小鼠骨骼肌质量、功能及结构的影响。
方法
将15只6周龄C57BL/6小鼠随机分为普通饮食组(Con组，n=5)、高脂饮食组(HFD组，n=5)和高脂饮食+mibefradil干预组(HFD+Mibe组，n=5)。电子抓力仪测量小鼠前肢抓力，DXA分析小鼠后肢肌肉含量，GPO-PAP法测定甘油三酯和总胆固醇，HE染色观察小鼠腓肠肌肌纤维横截面积，Western blot和免疫荧光技术检测自噬水平变化，Western blot检测Akt/mTOR信号通路的激活情况。
结果
与Con组相比，HFD组体质量增加，相对抓力、后肢肌肉比率降低(P < 0.05)，给予mibefradil干预后体质量减轻，相对抓力升高、后肢肌肉比率升高(P < 0.05)；HE染色结果显示，与Con组相比，HFD组平均肌纤维横截面积降低，给予mibefradil干预后平均肌纤维横截面积得到改善(P < 0.05)；免疫荧光结果显示，HFD组和HFD+Mibe组的LC3多均匀分布于细胞浆，呈浅淡红色荧光；而在HFD组检测到不同程度的明亮斑点状红色荧光；Western blot结果显示，与Con组相比，HFD组LC3Ⅱ蛋白表达水平升高，P62蛋白表达水平降低，AKT和mTOR的磷酸化表达降低，给予mibefradil干预后LC3Ⅱ蛋白表达水平降低，P62蛋白表达水平升高，AKT和mTOR的磷酸化表达升高(P < 0.05)。
结论
给予mibefradil干预可以抵抗高脂诱导的体质量增加，改善肥胖小鼠的肌肉质量和功能，这可能与其改善脂代谢和通过激活AKT/mTOR信号通路来抑制肥胖诱导的过度自噬有关。
Keywords: mibefradil, T型钙通道, 肥胖, 骨骼肌, 自噬
Abstract
Objective
To observe the effect of mibefradil on skeletal muscle mass, function and structure in obese mice.
Methods
Fifteen 6-week-old C57BL/6 mice were randomized equally into normal diet group (control group), high-fat diet (HFD) group and high-fat diet +mibefradil intervention group (HFD +Mibe group). The grip strength of the mice was measured using an electronic grip strength meter, and the muscle content of the hindlimb was analyzed by X-ray absorptiometry (DXA). Triglyceride (TG) and total cholesterol (TC) levels of the mice were measured with GPO-PAP method. The cross-sectional area of the muscle fibers was observed with HE staining. The changes in the level of autophagy in the muscles were detected by Western blotting and immunofluorescence assay, and the activation of the Akt/mTOR signaling pathway was detected with Western blotting.
Results
Compared with those in the control group, the mice in HFD group had a significantly greater body weight, lower relative grip strength, smaller average cross sectional area of the muscle fibers, and a lower hindlimb muscle ratio (P < 0.05). Immunofluorescence assay revealed a homogenous distribution of LC3 emitting light red fluorescence in the cytoplasm in the muscle cells in HFD group and HFD+Mibe group, while bright spots of red fluorescence were detected in HFD group. In HFD group, the muscular tissues of the mice showed an increased expression level of LC3 II protein with lowered expressions of p62 protein and phosphorylated AKT and mTOR (P < 0.05). Mibefradil treatment significantly reduced body weight of the mice, lowered the expression level of p62 protein, and increased forelimb grip strength, hindlimb muscle ratio, cross-sectional area of the muscle fibers, and the expression levels of LC3 II protein and phosphorylated AKT and mTOR (P < 0.05).
Conclusion
Mibefradil treatment can moderate high-fat diet-induced weight gain and improve muscle mass and function in obese mice possibly by activating AKT/mTOR signal pathway to improve lipid metabolism and inhibit obesityinduced autophagy.
Keywords: mibefradil, T-type calcium channel, obesity, skeletal muscles, autophagy
肌少症以骨骼肌力量及质量下降为特征[1]。除年龄因素外，骨骼肌细胞去神经支配、线粒体功能障碍、炎症反应、营养障碍、废用、肥胖以及内分泌改变等多种原因均可导致肌少症的发生[2]。肥胖引起的异位脂肪沉积会导致骨骼肌生物功能改变，包括胰岛素抵抗、线粒体功能障碍、氧化应激和炎症等[3]。这些改变进一步加剧了骨骼肌的丢失和身体功能障碍[4]。患有肌肉减少症的老年人更容易发生跌倒、骨折等不良事件，生活质量随之下降，死亡风险显著增高[5]。肥胖引起的脂肪沉积会增加代谢性疾病、心血管疾病、阿尔茨海默病、抑郁症和癌症的患病风险[6]。研究发现，老年肌少性肥胖人群与单纯少肌症或肥胖患者比较，患代谢综合征的风险明显增加[7]。临床研究发现肌少性肥胖患者的疾病负担比只患有肥胖症或肌少症患者更加严重[8]。目前关于肌少性肥胖发生机制的探究也引起学界的广泛关注。
Mibefradil是一种选择性T型钙通道拮抗剂。T型钙通道是一种激活电位低、失活快的电压门控通道[9]，参与受精、神经元放电、激素分泌和肌纤维发育等多种生理过程[10-13]。研究发现T型钙通道在融合前表达于成肌细胞，在终末分化成肌细胞的钙离子流动中起重要作用[14]。高脂饮食会引起肌肉内脂肪过度沉积，引起肌肉结构发生改变[4]。有研究发现，抑制T型钙通道可以抵抗高脂饮食诱导的体质量增加[15]。也有研究显示mibefradil可以改善糖尿病小鼠的糖代谢[16]；mibefradil可以抑制饥饿诱导的心肌细胞自噬[17]。但目前关于mibefradil对肥胖小鼠骨骼肌的影响尚未见报道，因此，本研究目的在于探讨mibefradil对肥胖小鼠骨骼肌的影响及其可能的机制。
1. 材料和方法
1.1. 实验试剂及仪器
Mibefradil (MCE)，P62抗体(Abways)，LC3 B抗体(Bimake)，GAPDH抗体(武汉三鹰公司)，山羊抗兔Ig G-HRP(北京中杉金桥公司)山羊抗小鼠Ig G-HRP (北京中杉金桥公司)，电子抓力仪(cat.47200, Ugo Basil)，双能X线吸光测定仪器(Discovey A，HOLOGIC)，甘油三酯试剂盒(南京建成)，总胆固醇试剂盒(南京建成)，苏木素伊红(HE)染色试剂盒(武汉赛维尔生物公司)。
1.2. 实验动物及分组
15只SPF级C57BL/6雄性小鼠(浙江维通利华实验动物技术有限公司)，将小鼠随机分成3组(5只/组)：普通饮食组(Control组，普通饮食，能量比为10%脂肪、20%蛋白质和70%碳水化合物)，高脂饮食组(HFD组，高脂饮食，能量比为60%脂肪、20%蛋白质和20%碳水化合物)，高脂饮食加mibefradil干预组(HFD+Mibe组)。所有动物实验均按照标准动物护理规程进行。实验过程中小鼠分笼饲养，5只/笼，自由饮水、饮食，饲养在恒温22±2 ℃、相对湿度为60%的环境中，每周定时清理鼠笼、更换垫料，添加饲料，12 h明暗周期。本研究动物实验过程已通过重庆医科大学附属第一医院伦理委员会审查。
1.3. 给药方法
HFD+Mibe组给予mibefradil 30 mg/ (kg·d)(用生理盐水溶解)干预2周，普通饮食组及高脂饮食组给予等体积生理盐水，给药方式均为腹腔注射，分早晚两次给药。
1.4. 小鼠前肢抓力的测量
将小鼠前肢放置在电子抓力仪的感应杆上，待小鼠紧紧抓住感应杆后，拉住小鼠尾巴并向后拉，直到松开为止，记录小鼠的抓力。重复测量3次，取最大值为小鼠的绝对抓力，测量1次/周。同时使用电子体重称测量小鼠体质量。
1.5. 双能X射线吸收测定(DXA)试验
小鼠用4%水合氯醛(0.1 mL/100 g)联合戊巴比妥钠麻醉后俯卧在扫描仪床上。扫描结束后，记录小鼠体质量和瘦质量，并计算出小鼠后肢肌肉比率。
1.6. 组织制备和组织学分析
喂养13周后，所有小鼠经水合氯醛联合戊巴比妥钠进行深度麻醉，通过摘眼球取血。然后，所有样品进行离心保留血清(4 ℃，3000 g，10 min)。用酶标仪通过GPO-PAP法测定甘油三酯和总胆固醇水平。处死小鼠，取出腓肠肌放入40 g/L多聚甲醛中性溶液中固定24 h。然后用石蜡包埋后，切成4~6 μm厚的切片。切片用进行荧光以及苏木精伊红染色，然后在显微镜下观察记录。用Image J软件进行分析。
1.7. Western blot
提取各组肌肉组织总蛋白，使用BCA法测定蛋白浓度。等量上样至SDS-PAGE凝胶中，电泳电压设置为60 V出孔后转120 V，100 min。蛋白经湿转法转至PVDF膜上，快速封闭液室温封闭1 h，将膜分别置于溶有LC3 B、P62和GAPDH的一抗稀释液中4 ℃过夜。第2天用TBST洗膜3次，10 min/次，将膜转入已稀释的二抗中室温1 h，再次用TBST洗膜3次，10 min/次。ECL显影，调节Bio-1D软件(VilberLourmat，法国)凝胶成像仪的参数进行曝光，采图。Image J软件分析，测定并计算出LC3 Ⅱ、P62和GAPDH条带灰度值比值，进行统计学分析。
1.8. 统计分析
实验数据由GraphPad Prism 8、Image J和SPSS 26.0统计软件处理。计量资料均采用均数±标准差表示，用重复测量方差分析比较小鼠体质量及抓力的变化。多组间均数比较采用单因素方差分析，组间比较采用最小显著差异法(LSD法)，P < 0.05为差异有统计学意义。所有实验均独立重复3次。
2. 结果
2.1. Mibefradil对肥胖小鼠体质量、肌肉质量、相对抓力和脂代谢指标的影响
与Control组小鼠相比，HFD组小鼠体质量增加明显(图 1)，HFD组小鼠肥胖度均超过20%，平均36.1%，高脂诱导肥胖小鼠模型成功。HFD+Mibe组与HFD组的体质量差异有统计学意义，mibefradil干预能降低肥胖小鼠的体质量增加(P < 0.05，表 1)。
图 1.
Mibefradil对高脂喂养小鼠的体质量、相对抓力、后肢肌肉比率、总胆固醇和甘油三酯的影响
Effects of mibefradil on body weight, relative grip strength, hindlimb muscle ratio, TC and TG in HFD-fed mice. A, B: Changes of body weight in HFD group and mibefradil intervention group. C: Relative grip strength in each group. D: Hindlimb muscle ratio in each group. E: TC in each group. F: TG in each group. G: Body shape changes in each group.*P < 0.05 vs Con; #P < 0.05 vs HFD group.
表 1.
各组小鼠体质量、相对抓力、后肢肌肉比率和血脂比较
Comparison of body weight, relative grip strength, hindlimb muscle ratio and blood lipids among the groups (Mean±SD)
| Group | Body mass (g) | Relative grip strength (gf/g) | Mean hindlimb muscle mass (%) | TC (mmol/L) | TG (mmol/L) |
| *P < 0.05 vs control; #P < 0.05 vs HFD. | |||||
| Control | 30.80±0.76 | 10.22±0.93 | 6.56±1.05 | 5.76±0.06 | 3.84±0.10 |
| HFD | 44.20±3.87* | 7.11±0.63* | 2.87±0.11* | 7.69±0.06* | 4.91±0.12* |
| HFD+Mibe | 36.90±1.19*# | 8.65±0.68*# | 4.7±1.66*# | 6.50±0.19*# | 3.75±0.13# |
通过相对抓力及抓力/体质量评估肌肉的力量，结果显示，与Con组相比，HFD组相对抓力下降，与HFD组相比，HFD+Mibe组小鼠相对抓力以及后肢肌肉比率明显升高(P < 0.05)。脂代谢指标检测显示，与Con组相比，HFD组甘油三酯和总胆固醇升高，与HFD组相比，HFD+ Mibe组小鼠甘油三酯和总胆固醇明显下降(P < 0.05，表 1)
2.2. Mibefradil对肥胖小鼠骨骼肌肌纤维横截面积的影响
HE染色的腓肠肌横切面显示，Control组和HFD+ Mibe组小鼠肌纤维呈不同形状的块状，排列紧密；而高脂组肌纤维排列疏松。HFD组平均肌纤维横截面积低于Control组(P < 0.05)，而HFD+Mibe组平均肌纤维横截面积较HFD组升高(P < 0.05，图 2)。
图 2.
Mibefradil对肥胖小鼠肌纤维横截面积的影响
Effect of mibefradil on cross-sectional area of the muscle fibers in obese mice (HE staining, original magnification: ×200). *P < 0.05 vs Con, #P < 0.05 vs HFD.
2.3. 各组小鼠肌肉组织LC3免疫荧光
通过间接免疫荧光技术在荧光显微镜下进行观察，LC3Ⅰ主要分布在细胞浆，自噬激活后LC3Ⅰ共价结合磷脂酰乙醇胺变为LC3Ⅱ，在免疫荧光中表现为弥散分布的LC3变为点状聚集分布。细胞核显蓝色荧光，LC3显红色荧光(图 3)。HFD组和HFD+Mibe组的LC3均匀分布于细胞浆，呈浅淡红色荧光，即主要以LC3Ⅰ的形式存在；而在HFD组检测到不同程度的明亮斑点状红色荧光。HFD组与Control组、HFD+Mibe组与HFD组荧光强度差异有统计学意义(P < 0.05，图 3)。
图 3.
小鼠肌肉组织LC3免疫荧光
Representative immunostaining of LC3 (scale bars=50 μm). *P < 0.05 vs Con, #P < 0.05 vs HFD.
2.4. Mibefradil对肥胖小鼠P62、LC3 Ⅱ蛋白表达水平以及AKT/mTOR信号通路的影响
HFD组中P62蛋白表达水平低于Control组和HFD+Mibe组(P < 0.05)；HFD组中LC3 Ⅱ蛋白表达水平高于Control组和HFD+Mibe组(P < 0.05，图 4)。与Control组相比，HFD组信号通路蛋白p-AKT和pmTOR表达下降；给与mibefradil干预后p-AKT和pmTOR表达升高(P < 0.05，图 5)。
图 4.
Western blot检测LC3 Ⅱ、P62蛋白表达水平
Western blotting of LC3II and P62 proteins in different groups. GAPDH was used as the loading control. *P < 0.05 vs Con, #P < 0.05 vs HFD.
图 5.
各组AKT/mTOR信号通路蛋白表达水平
Western blotting of AKT, p-AKT, mTOR and pmTOR proteins in different groups. GAPDH was used as the loading control. *P < 0.05 vs Con, #P < 0.05 vs HFD.
3. 讨论
研究表明，肥胖引起血液游离脂肪酸浓度升高，此时骨骼肌的脂肪酸摄入增加而氧化能力下降，因此脂肪在骨骼肌中大量沉积，造成线粒体脂质负荷增加，骨骼肌的胰岛素敏感性改变，出现胰岛素抵抗，进而引起肌肉结构改变[18]。甘油三酯、总胆固醇、血糖、体质量指数等代谢危险因素均与肌少症相关[19]。本研究显示，给予高脂喂养的小鼠体质量增加明显，相对抓力降低，后肢肌肉比率下降，通过HE染色检测进一步发现骨骼肌肌纤维平均横截面积减小。表明高脂喂养的小鼠会出现肥胖并伴有肌肉质量减少和功能障碍。对肥胖小鼠进行mibefradil干预后，结果显示小鼠体质量减轻，相对抓力、后肢肌肉比率及肌纤维横截面积升高，同时对各组小鼠的脂代谢指标进行检测发现，高脂喂养的小鼠甘油三酯和总胆固醇浓度较普通饮食小鼠增高，而HFD+ Mibe组甘油三酯和总胆固醇浓度较HFD组低，表明mibefradil干预可以减轻肥胖引起的肌肉损失和功能障碍，可能与抵抗高脂诱导的肥胖和改善脂代谢有关。有研究报道，mibefradil可以抑制饥饿诱导的心肌细胞自噬[17]，结合课题组前期发现高脂喂养的小鼠肌肉中LC3 Ⅱ蛋白表达水平升高[20]，我们推测自噬可能在该过程中发挥重要作用。
肌肉质量和肌纤维大小由肌纤维内蛋白质合成与分解之间的平衡调节，蛋白质过度分解会造成蛋白质平衡失调，引起肌肉萎缩[21]。自噬在机体的生理和病理过程中都能见到，基础水平的自噬能清除受损细胞器和异常蛋白，对细胞是一种保护性作用，但也有研究发现，血管平滑肌细胞过度自噬，会导致急性心血管事件的发生[22, 23]。间歇性低氧干预小鼠会导致自噬被过度激活，最终导致膈肌萎缩[24]，表明自噬的过度激活也会引起自噬性细胞死亡甚至加速疾病发展。LC3和P62是常用的自噬检测标志物，LC3蛋白有两种存在形式LC3Ⅰ和LC3 Ⅱ，LC3Ⅰ主要在胞浆分布，自噬激活过程中，LC3Ⅰ与磷脂酰乙醇胺共价结合成为LC3 Ⅱ[25]，而后者是自噬小体的主要成分，LC3 Ⅱ的表达量与自噬体的数量成正相关，LC3 Ⅱ表达水平升高提示自噬激活，P62分子参与连接自噬体膜与靶分子或细胞器，并随自噬体降解而降解，P62表达水平升高提示自噬活动降低。因此本研究首先通过免疫荧光技术检测各组小鼠骨骼肌细胞中LC3的变化，结果显示：HFD组和HFD+Mibe组的LC3均匀分布于细胞浆，呈浅淡红色荧光，表明主要以LC3Ⅰ的形式存在，自噬未被激活；而在HFD组检测到不同程度的明亮斑点状红色荧光，表明LC3Ⅰ转变为LC3Ⅱ，自噬被激活。我们进一步检测LC3 Ⅱ和P62蛋白在各组中的表达水平，评价高脂饮食和mibefradil对骨骼肌自噬的影响，结果显示：肥胖小鼠肌肉组织中LC3 Ⅱ蛋白的表达水平较普通饮食组小鼠升高，P62蛋白表达水平较普通饮食组小鼠降低，表明肥胖小鼠肌肉组织中自噬活动增强，因此我们推测高脂诱导的肥胖小鼠会出现过度自噬，引起肌细胞蛋白质分解加剧，造成蛋白质稳态失衡，进而出现肌肉萎缩，抓力降低。给予mibefradil干预后，观察到肥胖小鼠的抓力增强，肥胖小鼠肌肉组织中LC3 Ⅱ蛋白表达水平降低，P62蛋白表达水平升高。自噬的调控有多种信号通路参与，AKT/mTOR信号通路是其中之一，AKT作为mTOR的上游分子，能正向调节mTOR的表达，mTOR是自噬主要的负向调节蛋白，失活后可导致自噬水平升高[26]。但mibefradil介导的自噬是否与AKT/mTOR信号通路有关未见报道，本研究通过Western blot检测AKT/mTOR信号通路的变化，结果发现与Con组小鼠相比，HFD组小鼠肌肉中p-AKT和p-mTOR表达降低；肥胖小鼠进行mibefradil干预后，p-AKT和p-mTOR的表达升高，表明mibefradil可能通过激活AKT/mTOR信号通路抑制过度自噬从而改善肥胖小鼠的肌肉功能障碍。
综上所述，mibefradil可抵抗高脂饮食诱导的体质量增加，改善肥胖小鼠肌肉质量与功能，其作用机制可能与改善脂代谢和抑制AKT/mTOR信号通路介导的自噬有关，但mibefradil对肌肉产生的作用及相关机制十分复杂，仍有待进一步研究。
Biography
吴江豪，硕士，E-mail: 13883675314@163.com
Funding Statement
国家自然科学基金(81901424)
Supported by National Natural Science Foundation of China (81901424)
Contributor Information
吴 江豪 (Jianghao WU), Email: 13883675314@163.com.
肖 谦 (Qian XIAO), Email: xiaoqian1956@126.com.
References
- 1.Liu D, Fan YB, Tao XH, et al. Mitochondrial quality control in sarcopenia: updated overview of mechanisms and interventions. Aging Dis. 2021;12(8):2016–30. doi: 10.14336/AD.2021.0427. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 2.Han A, Bokshan SL, Marcaccio SE, et al. Diagnostic criteria and clinical outcomes in sarcopenia research: a literature review. J Clin Med. 2018;7(4):70–7. doi: 10.3390/jcm7040070. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 3.Wu HZ, Ballantyne CM. Skeletal muscle inflammation and insulin resistance in obesity. J Clin Invest. 2017;127(1):43–54. doi: 10.1172/JCI88880. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 4.Lipina C, Hundal HS. Lipid modulation of skeletal muscle mass and function. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 2017;8(2):190–201. doi: 10.1002/jcsm.12144. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 5.Malafarina V, Uriz-Otano F, Iniesta R, et al. Sarcopenia in the elderly: diagnosis, physiopathology and treatment. Maturitas. 2012;71(2):109–14. doi: 10.1016/j.maturitas.2011.11.012. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 6.Blüher M. Obesity: global epidemiology and pathogenesis. Nat Rev Endocrinol. 2019;15(5):288–98. doi: 10.1038/s41574-019-0176-8. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 7.Hamrick MW. Role of the cytokine-like hormone leptin in musclebone crosstalk with aging. J Bone Metab. 2017;24(1):1–8. doi: 10.11005/jbm.2017.24.1.1. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 8.Batsis JA, Villareal DT. Sarcopenic obesity in older adults: aetiology, epidemiology and treatment strategies. Nat Rev Endocrinol. 2018;14(9):513–37. doi: 10.1038/s41574-018-0062-9. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 9.Fukunaga K, Izumi H, Yabuki Y, et al. Alzheimer's disease therapeutic candidate SAK3 is an enhancer of T-type calcium channels. J Pharmacol Sci. 2019;139(2):51–8. doi: 10.1016/j.jphs.2018.11.014. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 10.Bernhardt ML, Zhang YP, Erxleben CF, et al. CaV3.2 T-type channels mediate Ca2+ entry during oocyte maturation and following fertilization. J Cell Sci. 2015;128(23):4442–52. doi: 10.1242/jcs.180026. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 11.Vastagh C, Solymosi N, Farkas I, et al. Proestrus differentially regulates expression of ion channel and calcium homeostasis genes in GnRH neurons of mice. Front Mol Neurosci. 2019;12:137–45. doi: 10.3389/fnmol.2019.00137. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 12.Cain SM, Tyson JR, Choi HB, et al. Ca V3.2 drives sustained burstfiring, which is critical for absence seizure propagation in reticular thalamic neurons. Epilepsia. 2018;59(4):778–91. doi: 10.1111/epi.14018. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 13.Carter MT, McMillan HJ, Tomin A, et al. Compound heterozygous CACNA1H mutations associated with severe congenital amyotrophy. Channels (Austin) 2019;13(1):153–61. doi: 10.1080/19336950.2019.1614415. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 14.Li ST, Hao ML, Li BS, et al. CACNA1H downregulation induces skeletal muscle atrophy involving endoplasmic Reticulum stress activation and autophagy flux blockade. Cell Death Dis. 2020;11(4):279–85. doi: 10.1038/s41419-020-2484-2. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 15.Rosenstand K, Andersen K, Terp R, et al. Deficiency of T-type voltage-gated calcium channels results in attenuated weight gain and improved endothelium-dependent dilatation of resistance vessels induced by a high-fat diet in mice. J Physiol Biochem. 2020;76(1):135–45. doi: 10.1007/s13105-020-00728-2. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 16.Lu YJ, Long M, Zhou SW, et al. Mibefradil reduces blood glucose concentration in db/db mice. Clinics (Sao Paulo) 2014;69(1):61–7. doi: 10.6061/clinics/2014(01)09. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 17.Pushparaj C, Das A, Purroy R, et al. Voltage-gated calcium channel blockers deregulate macroautophagy in cardiomyocytes. Int J Biochem Cell Biol. 2015;68:166–75. doi: 10.1016/j.biocel.2015.09.010. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 18.Du Y, Oh C, No J. Associations between sarcopenia and metabolic risk factors: a systematic review and meta-analysis. J Obes Metab Syndr. 2018;27(3):175–85. doi: 10.7570/jomes.2018.27.3.175. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 19.Gilbert M. Role of skeletal muscle lipids in the pathogenesis of insulin resistance of obesity and type 2 diabetes. J Diabetes Investig. 2021;12(11):1934–41. doi: 10.1111/jdi.13614. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 20.Fan Z, Xiao Q. Impaired autophagic flux contributes to muscle atrophy in obesity by affecting muscle degradation and regeneration. Biochem Biophys Res Commun. 2020;525(2):462–8. doi: 10.1016/j.bbrc.2020.02.110. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 21.Sandri M. Protein breakdown in muscle wasting: role of autophagylysosome and ubiquitin-proteasome. Int J Biochem Cell Biol. 2013;45(10):2121–9. doi: 10.1016/j.biocel.2013.04.023. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 22.Kim KH, Lee MS. Autophagy: a key player in cellular and body metabolism. Nat Rev Endocrinol. 2014;10(6):322–37. doi: 10.1038/nrendo.2014.35. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 23.Marunouchi T, Tanonaka K. Cell death in the cardiac myocyte. Biol Pharm Bull. 2015;38(8):1094–7. doi: 10.1248/bpb.b15-00288. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 24.Giordano C, Lemaire C, Li T, et al. Autophagy-associated atrophy and metabolic remodeling of the mouse diaphragm after short-term intermittent hypoxia. PLoS One. 2015;10(6):e0131068–77. doi: 10.1371/journal.pone.0131068. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 25.Beals JW, Sukiennik RA, Nallabelli J, et al. Anabolic sensitivity of postprandial muscle protein synthesis to the ingestion of a proteindense food is reduced in overweight and obese young adults. Am J Clin Nutr. 2016;104(4):1014–22. doi: 10.3945/ajcn.116.130385. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 26.Yadav A, Singh A, Phogat J, et al. Magnoflorine prevent the skeletal muscle atrophy via Akt/mTOR/FoxO signal pathway and increase slow-MyHC production in streptozotocin-induced diabetic rats. J Ethnopharmacol. 2021;267:113510–9. doi: 10.1016/j.jep.2020.113510. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]