Abstract
目的
研究低频脉冲电磁场（PEMFs）促进成骨细胞矿化成熟作用是否与初级纤毛及定位于初级纤毛的多囊蛋白2（PC2）和sAC/PKA/CREB信号通路有关。
方法
检测新生大鼠颅骨成骨细胞（ROBs）经50 Hz 0.6 mT PEMFs分别处理0、5、15、30、60、90、120 min后PC2、sAC、PKA、CREB及其磷酸化蛋白的表达水平；用盐酸阿米洛利阻断PC2功能，检测sAC/PKA/CREB信号通路活性变化及ROBs矿化成熟是否受到影响；用RNA干扰法敲低PC2表达水平后做同上检查；用免疫荧光染色法观察PC2、sAC、PKA、CREB及其磷酸化蛋白与初级纤毛的共定位情况；用RNA干扰法抑制初级纤毛发生后检测PC2和sAC/PKA/CREB信号途径相关蛋白的表达情况。
结果
ROBs经PEMFs处理0、5、15、30、60、90、120 min后，PC2、sAC、p-PKA和p-CREB表达水平均增加（P < 0.01）。阻断PC2功能或敲低PC2表达水平后，sAC/PKA/CREB信号通路未被激活，成骨细胞的矿化成熟受阻（P < 0.01）。PC2、sAC、p-PKA和p-CREB可被定位于整根初级纤毛或其根部，但PKA和CREB在初级纤毛内没有分布。干扰初级纤毛后，PEMFs处理未提高PC2表达量（P < 0.01），未激活sAC/PKA/CREB信号通路，也不再能促进成骨细胞矿化成熟。
结论
存在于ROBs初级纤毛表面的PC2可感知并传递PEMFs发出的物理信号，通过激活PC2/sAC/PKA/CREB信号途径促进成骨细胞的矿化成熟。
Keywords: 多囊蛋白2, 成骨细胞, 低频脉冲电磁场, sAC/PKA/CREB信号通路
Abstract
Objective
To explore whether the effect of low-frequency pulsed electromagnetic fields (PEMFs) in promoting osteoblast mineralization and maturation is related to the primary cilia, polycystin2 (PC2) and sAC/PKA/CREB signaling pathway.
Methods
We detected the expression levels of PC2, sAC, PKA, CREB and their phosphorylated proteins in primary rat calvarial osteoblasts exposed to 50 Hz 0.6 mT PEMFs for 0, 5, 15, 30, 60, 90, and 120 min. We blocked PC2 function with amiloride hydrochloride and detected the changes in the activity of sAC/PKA/CREB signal pathway and the mineralization and maturation of the osteoblasts. These examinations were repeated in the osteoblasts after specific knockdown of PC2 via RNA interference and were the co-localization of PC2, sAC, PKA, CREB and their phosphorylated proteins with the primary cilia were using immunofluorescence staining. The expressions of PC2 and the signaling proteins of sAC/PKA/CREB pathway were detected after inhibition of primary ciliation by RNA interference.
Results
The expression levels of PC2, sAC, p-PKA and p- CREB were significantly increased in the osteoblasts after exposure to PEMFs for different time lengths (P < 0.01). Blocking PC2 function or PC2 knockdown in the osteoblasts resulted in failure of sAC/PKA/CREB signaling pathway activation and arrest of osteoblast mineralization and maturation. PC2, sAC, p-PKA and p-CREB were localized to the entire primary cilia or its roots, but PKA and CREB were not detected in the primary cilia. After interference of the primary cilia, PEMFs exposure no longer caused increase of PC2 expression and failed to activate the sAC/PKA/CREB signaling pathway or promote osteoblast mineralization and maturation.
Conclusion
PC2, located on the surface of the primary cilia of osteoblasts, can perceive and transmit the physical signals from PEMFs and promote the mineralization and maturation of osteoblasts by activating the PC2/ sAC/PKA/CREB signaling pathway.
Keywords: polycystin2, osteoblasts, low-frequency pulsed electromagnetic field, sAC/PKA/CREB signaling pathway
骨质疏松症是一种慢性骨骼代谢性骨病，随着人口结构日趋老龄化，该病发病率正快速升高[1, 2]。脉冲电磁场（PEMFs）是一种较为安全有效的骨质疏松症治疗手段[3]，但对其发挥疗效的机制至今不明。有研究报道PEMFs可通过激活IGF-1R/NO、PI3K-AKT、BMP-2/ Smad和经典Wnt信号途径促进骨形成[4-7]，但上述研究均未阐明最先感知PEMFs受体及其作用机制是什么。早在1999年有研究报道电磁场可以增加大鼠成骨细胞的PKA活性[8]。现有研究发现，50 Hz 0.6 mT的PEMFs可激活sAC/PKA/CREB信号通路，从而保持大鼠颅骨成骨细胞（ROBs）活性，抑制尾吊大鼠发生骨流失[9, 10]，但ROBs感知PEMFs发出的物理信号并通过该信号途径促进成骨细胞矿化成熟的具体机制仍有待探究。
多囊蛋白2（PC2）由Pkd2基因编码[11]，是瞬时受体电位家族成员之一，主要分布于内质网、质膜和初级纤毛上，具有阳离子渗透性且对Ca2+敏感[12]。初级纤毛是一种存在于大多数哺乳动物细胞表面的“天线”样突起结构，介导多种细胞信号通路的转导[13, 14]。多囊蛋白1（PC1）和PC2形成的二聚体已被定位于包括成骨细胞在内的多种细胞的初级纤毛上[15, 16]，sAC/PKA/CREB信号途径的多种重要信号蛋白也定位于初级纤毛上[17]。我们前期已发现PEMFs可激活sAC/PKA/CREB信号途径促进成骨细胞的矿化成熟[10]，相关研究报道PC1能与TAZ因子相互作用刺激骨形成[18]，成骨细胞中Pkd2的特异性敲低则导致成骨性分化受损[19]。那么PC1/ PC2是否参与了PEMFs激活sAC/PKA/CREB信号途径的过程并促进成骨细胞的矿化成熟呢？对此本文首先研究了PC2的参与情况及其作用机制，以进一步探讨电磁场促进骨形成的详细机制。
1. 材料和方法
1.1. 实验装置与材料
低频脉冲电磁场细胞处理仪同文献[20]，是基于我们专利（No. ZL 20112 0528654.3）的研究设备。产磁螺线管长27 cm，直径14 cm，管腔中央可产生均匀的PEMFs信号，能确保较大范围内的细胞受到相同强度的PEMFs处理。设备由中国科学院近代物理研究所磁场组校准。
其他设备：CO2恒温培养箱（Thermo Fisher Scientific），高速冷冻离心机（Heraeus），Epoch酶标仪（BioTek），电泳仪（Bio-Rad），倒置相差显微镜（Olympus），紫外分光光度计（Thermo Fisher Scientific），ChemiDoc-It凝胶成像系统（UPV），ViiA™ 7 Dx实时荧光定量PCR仪（Applied Biosystems），活细胞成像工作站（GE）。
主要试剂：α-MEM培养基、Opti-MEMTM减血清培养基、Trypsin-EDTA（0.25%）（Gibco）; 胎牛血清（Biological Industries）; ALP检测试剂盒（南京建成）; β-actin、sAC、p-PKA、PKA、p-CREB、CREB、Runx-2、BMP-2、Collagen-1蛋白一抗、山羊抗兔IgG H & L (HRP)、兔抗小鼠IgG H & L（HRP）、山羊抗兔IgG（Alexa Fluor® 488）、山羊抗小鼠IgG H & L（Alexa Fluor® 594）（abcam）; PC2抗体（Santa Cruz）; Acetyl-α-Tubulin抗体（CST）; Osx蛋白一抗、ECL超灵敏发光液（Affinity Biosciences）; 盐酸阿米洛利（MCE）; 维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠（Sigma）; Ⅱ型胶原酶、青链霉素混合液（100×）、二甲基亚砜（dimethy lsulfoxide，DMSO）、高效RIPA组织/细胞裂解液、BCA蛋白质浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、4×蛋白质上样缓冲液、彩虹180广谱蛋白Marker（11 000-180 000）、RNA酶清除剂、抗荧光衰减封片剂、4', 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、1%茜素红染液、0.2%茜素红染液（北京索莱宝科技有限公司）; 免疫染色封闭液（上海碧云天生物技术有限公司）; Lipofectamine 2000（Invitrogen）、Halt ™ Phosphatase Inhibitor Cocktail（Thermo Fisher Scientific）; RNAiso plus（TaKaRa）; Evo M-MLV反转录试剂盒、SYBR® Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）; 通用型组织固定液、PBS powder、SDS-PAGE running buffer powder和SDS-PAGE transfer buffer powder（武汉塞维尔生物科技有限公司）。
1.2. ROBs的分离和培养
ROBs的提取同文献[21]，取出生48 h以内的SPF级SD大鼠乳鼠（联勤保障部队第九四〇医院动物实验科，合格证号：SCXK甘20150002，伦理委员会批准号为2021KYLL185）。处死后在无菌条件下取出其颅骨，剔除骨膜及黏附软组织后，剪成合适大小的骨片，37 ℃水浴条件下使用0.25%胰蛋白酶消化10 min，弃消化液。再使用0.1%的Ⅱ型胶原酶37 ℃水浴消化12 min，连续消化5次，弃第1次消化液，收集后4次消化液，1500 r/min离心10 min，弃上清。用完全培养基（胎牛血清：α-MEM培养液=1∶9）悬浮细胞沉淀。以1×104/mL的浓度接种于100 mm培养皿中，置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养，1次/3 d换液，待细胞生长融合至80%时进行传代。
1.3. RNA干扰
对于初级纤毛的干扰，采用RNAi法敲低ROBs初级纤毛的IFT88基因表达水平以抑制初级纤毛的发生，方法同文献[17]。将靶向IFT88的siRNA（5'-GGAUAU GGGUCCAAGACAUCC-3'）寡核苷酸和阴性对照siRNA克隆到pENTRTM/U6表达载体中，利用lipofectamine 2000转染到ROBs中，转染效率用红色荧光表示。对于PC2的干扰，委托南京晶百生物科技有限公司设计3种siRNA序列，分别为（5'- GCAGAGAT CGAGGAAGCTAAC-3'）、（5'- TCAGGACCTGAGAG ATGAAAT- 3'）、（5'- GCATCTTGACCTATGGCATGA-3'），需进行干扰质粒的筛选。将P1代ROBs接种于60 mm培养皿中，随机分为CON组、shRNA1组、shRNA2组和shRNA3组，CON组转入阴性对照乱序shRNA，shRNA1组、shRNA2组和shRNA3组转入公司设计的3种shRNA。转染后24 h后分析Pkd2的mRNA表达水平，转染48 h后分析PC2的蛋白表达水平，以确定最佳干扰序列，转染效率用载体所带绿色荧光显示。
1.4. Western blot分析
将P2代以内的ROBs均匀接种于60 mm培养皿中，待生长融合至70%左右时采用不同条件处理：50 Hz 0.6 mT PEMFs处理ROBs 0、5、15、30、60、90、120 min/d，连续处理3 d，第3天处理后即刻提取蛋白，检测PC2和sAC/PKA/CREB信号途径各蛋白的表达量; 随机分为CON组、PEMFs组、AMI组、AMI+PEMFs组，分别予以不同条件处理，CON组加入与AMI组等量的DMSO，PEMFs组加入与AMI组等量的DMSO的同时使用50 Hz 0.6 mT PEMFs处理90 min/d，AMI组使用10- 6 mol/L AMI处理，AMI+PEMFs组使用10-6 mol/L AMI处理的同时采用50 Hz 0.6 mT PEMFs处理90 min/d，连续处理3 d后检测sAC/PKA/CREB信号途径各蛋白和成骨性相关蛋白表达量; 随机分为CON组、PEMFs组、shRNA组、shRNA+PEMFs组和CON组、PEMFs组、siRNA组、siRNA+PEMFs组，CON组和PEMFs组转入阴性对照乱序shRNA/siRNA，shRNA/siRNA组和shRNA/ siRNA + PEMFs组转入靶向Pkd2/IFT88的shRNA/ siRNA，PEMFs组和shRNA/siRNA + PEMFs组采用50 Hz 0.6 mT PEMFs处理90 min/d，连续处理3 d后检测PC2、sAC/PKA/CREB信号途径各蛋白表达量。
弃完全培养基，PBS漂洗3遍，加入含0.1% PMSF的高效RIPA组织/细胞蛋白裂解液200 μL，冰上裂解20 min，使ROBs充分裂解，收集裂解液于离心管中，12 000 g/min离心20 min，取上清，BCA法测定上清蛋白浓度。98 ℃变性15 min，8%~15% SDS-PAGE分离后，电转至PVDF膜，脱脂奶粉封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜。次日复温后，TBST清洗一抗，加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温摇床孵育1.5 h，TBST清洗后加入ECL超灵敏发光液使用ChemiDoc-It凝胶成像系统进行曝光。
1.5. 碱性磷酸酶活性的测定
将P1代ROBs均匀接种于35 mm培养皿中，随机分为CON组、PEMFs组、AMI组、AMI + PEMFs组，CON组加入与AMI组等量的DMSO，PEMFs组加入与AMI组等量的DMSO的同时使用50 Hz 0.6 mT PEMFs处理90 min/d，AMI组使用10-6 mol/L AMI处理，AMI+ PEMFs组使用10- 6 mol/L AMI处理的同时采用50 Hz 0.6 mT PEMFs处理90 min/d，连续处理3 d和5 d后测定ALP活性。
ROBs内ALP活性按南京建成试剂盒说明书进行测定，弃完全培养基，PBS洗3次，加入基质液和缓冲液250 μL，混匀后37 ℃孵育15 min，加入显色液750 μL，充分混匀，在520 nm处测吸光度A520 nm，根据公式计算ALP活性。
1.6. RT-PCR分析
将P2代以内的ROBs均匀接种于60 mm培养皿中，随机分为CON组、PEMFs组、AMI组、AMI+PEMFs组，CON组加入与AMI组等量的DMSO，PEMFs组加入与AMI组等量的DMSO的同时使用50 Hz 0.6 mT PEMFs处理90 min/d，AMI组使用10- 6 mol/L AMI处理，AMI+PEMFs组使用10-6 mol/L AMI处理的同时采用50 Hz 0.6 mT PEMFs处理90 min/d，连续处理5 d后进行Real time RT-PCR分析。
弃培养基，PBS漂洗3次，800 μL RNAiso Plus裂解细胞10 min，收集裂解液至Ep管中加入200 μL三氯甲烷，震荡混匀后静置15 min，12 000 g/min 4 ℃离心20 min，收集上清，加入半体积异丙醇，轻微混匀后静置15 min，12 000 g/min 4 ℃离心20 min。弃上清，再用75%乙醇清洗沉淀两次，适量的DEPC水溶解沉淀，紫外分光光度计测其浓度和纯度。根据试剂盒说明书进行去基因组和反转录反应，而后按照试剂盒说明书使用进行实时荧光定量PCR反应，反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火31 s，重复40个循环，2-△△Ct法进行结果分析。实验所用引物由TaKaRa公司设计合成，引物序列见表 1。
表 1.
引物序列
Primer sequence
| Gene | Forward primer (5'-3') | Reverse primer (5'-3') |
| GAPDH | GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG | ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA' |
| Runx-2 | CATGGCCGGGAATGATGAG | TGTGAAGACCGTTATGGTCAAAGTG |
| BMP-2 | ACCGTGCTCAGCTTCCATCAC | TGTGAAGACCGTTATGGTCAAAGTG |
| Osx | CATCCATGCAGGCATCTCA | CTGCCCACCACCTAACCAA |
| Collagen-1 | TTCCCGGTGAATTCGGTCTC | ACCTCGGATTCCAATAGGACCAG |
| Pkd2 | GAGAATCCTGGGCTTAGTGCTGTC | AGCAGTTAGCTGGAGGTTTGCTATG |
| IFT88 | TCAGGCTATTGAGTGGCT | TCTCGCAGAACTGGGTAT |
1.7. 钙化结节染色
将P0代ROBs接种于35 mm培养皿中，随机分为CON组、PEMFs组、AMI组、AMI+PEMFs组和CON组、PEMFs组、shRNA组、shRNA+PEMFs组。待ROBs待生长融合至60%~70%时，进行预处理，CON组和PEMFs组分别加入与AMI组等量的DMSO和转入阴性对照乱序shRNA，AMI组和AMI+PEMFs组使用10-6 mol/L AMI处理，shRNA组和shRNA+PEMFs组转入靶向PKD2的shRNA，预处理后待ROBs生长融合至90%时，进行成骨诱导剂诱导，PEMFs组、AMI+PEMFs组和shRNA+PEMFs组采用50 Hz 0.6 mT PEMFs处理90 min，期间每天显微镜观察钙化结节形成情况，连续处理12 d后进行茜素红钙化结节染色。弃培养基，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，弃固定液，PBS漂洗3次。加入1%茜素红染液或0.2%茜素红染液，37 ℃条件下避光染色至被染色的结节数量不再增加时停止染色，弃茜素红染液，PBS漂洗至无浮色，照相记录结果。
1.8. 免疫荧光染色
将P3代以内的ROBs进行爬片培养，待生长至70%~80%时取出，弃培养基，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗; 0.1% Triton-100透膜3 min，PBS清洗; 免疫染色封闭液封闭1 h，滴加PC2、sAC、PKA、p-PKA、CREB、p-CREB蛋白一抗没过盖玻片，4 ℃孵育过夜后，PBS清洗3次，5 min/次; 加入荧光素标记的免疫荧光二抗，37 ℃中避光孵育1 h，PBS清洗二抗，抗荧光衰减封片剂封片，晾干后活细胞成像工作站观察结果。
1.9. 统计学分析
用SPSS 20.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析方法，组间两两比较选用LSD法，P < 0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1. PEMFs处理激活sAC/PKA/CREB信号途径且提高PC2蛋白表达量
PEMFs处理ROBs 5 min后，PC2的表达高于0 min（P < 0.01），之后持续升高，30 min达到峰值（P < 0.01），60 min后回落（P < 0.01），90 min后又上升，120 min后再次回落，但仍高于0 min（P < 0.01，图 1）。sAC/PKA/ CREB信号途径中的PKA和CREB无明显变化，但sAC、p-PKA和p-CREB表达量均先升高后下降。综合PC2和sAC/PKA/CREB信号途径相关蛋白的表达变化情况，选择90 min/d为后续实验PEMFs处理时间。
图 1.
PEMFs处理不同时间后对ROBs的PC2和sAC/PKA/CREB信号途径相关蛋白表达量的影响
Effects of low-frequency pulsed electromagnetic fields (PEMFs) treatment on the expression of PC2 and the signaling proteins of the sAC/PKA/CREB pathway in rat calvarial osteoblasts. A: Western blot banding; B-E: Quantitative analysis of the gray value of PC2, sAC, PKA, p-PKA, CREB and p-CREB proteins (Mean±SD, n=3). **P < 0.01 vs 0 min/d.
2.2. AMI阻断PC2功能后PEMFs未激活sAC/PKA/ CREB信号途径且未促进ROBs的矿化成熟
结果显示，与CON组相比，PEMFs组的sAC、p-PKA、p-CREB的表达量均升高（P < 0.01，图 2）; 而与PEMFs组相比，AMI+PEMFs组均下降（P < 0.01），PC2功能受到抑制后，PEMFs不再能激活sAC/PKA/CREB信号途径。
图 2.
PC2阻断剂对PEMFs处理后ROBs内sAC/PKA/CREB信号通路相关蛋白的影响
Effect of PC2 inhibitor on signaling proteins of the sAC/PKA/CREB pathway in rat calvarial osteoblasts after PEMFs treatment. A: Western blot banding; B-D: Quantitative analysis of the gray values of sAC/PKA/CREB signaling proteins (Mean ± SD, n=3), **P < 0.01 vs the CON group, &&P < 0. 01 vs the PEMFs group.
分析阻断PC2功能后成骨细胞分化成熟受到的影响，结果显示：PEMFs处理ROBs 3 d、5 d后的ALP活性均升高（P < 0.01，图 3），但经AMI预处理后（AMI + PEMFs组）提高作用被抵消（P < 0.01，图 3A）。分析成骨相关基因（Runx-2、Bmp-2、Osx、Collagen-1）的表达情况，结果显示：与CON组相比，PEMFs组成骨相关基因mRNA表达量均升高（P < 0.01或P < 0.05），但在AMI+ PEMFs组均下降（P < 0.01或P < 0.05，图 3B），蛋白表达量的变化与mRNA相一致（图 3C、D）。12 d后形成钙化结节的情况显示，PEMFs组形成的钙化结节面积最大，高于其它各组（P < 0.01），但AMI+PEMFs组的钙化结节面积低于PEMFs组（P < 0.01，图 3E）。PC2功能被抑制后，PEMFs不再能促进ROBs的矿化成熟。
图 3.
PC2阻断剂对PEMFs促进ROBs成骨分化和矿化的影响
Effect of PC2 inhibitor on PEMFs induced osteogentic diffrentiation and mineralization in rat calvarial osteoblasts. A: Effect of AMI on ALP activity. B: Effect of AMI on expressions of osteogenic genes. C: Effect of AMI on expressions of osteogenic proteins. D: Quantitative analysis of the gray value of the osteogenic proteins. E: Effect of AMI on the formation of calcified nodules; F: Quantification of calcified nodule area (Mean±SD, n=3), *P < 0.05, **P < 0.01 vs the CON group; &P < 0.0, &&P < 0.01 vs the PEMFs group.
2.3. 敲低PC2表达后PEMFs未促进激活sAC/PKA/ CREB信号途径及ROBs的矿化成熟
筛选实验结果显示，3种针对PC2的shRNA中，以shRNA2的抑制效果最好（图 4A~C），因此选择将shRNA2用于后续实验。干扰PC2后，PEMFs不再能激活sAC/PKA/CREB信号途径，结果与阻断PC2功能相似。分析干扰PC2后对PEMFs促进ROBs成熟矿化的影响，结果显示，与CON组相比，PEMFs组形成的钙化结节面积升高（P < 0.01，图 4D），shRNA组与CON组差异无统计学意义，但shRNA+PEMFs组的钙化结节面积低于PEMFs（P < 0.01），敲低PC2的表达后，PEMFs不再能促进ROBs的矿化成熟。
图 4.
干扰PC2表达对PEMFs激活sAC/PKA/CREB信号途径及促进ROBs矿化成熟的影响
Effects of interference of PC2 expression on PEMFs activating sAC/PKA/CREB signaling pathway and promoting mineralization and maturation in rat calvarial osteoblasts. A: PKD2 gene expression results. B: PC2 protein expression results. C: Quantitative analysis of the gray value of PC2. D: Effect of interference of PC2 on formation of calcified nodules. E: Quantification of calcified nodule area (Mean±SD, n=3), *P < 0. 05, **P < 0. 01 vs the CON group; &&P < 0. 01 vs the PEMFs group.
2.4. PC2和sAC/PKA/CREB信号途径均被定位于初级纤毛
采用免疫荧光染色法研究PC2和sAC/PKA/CREB信号途径与初级纤毛的关系，结果显示：PC2定位于整根初级纤毛之中，sAC与PC2相似，也是位于整根纤毛之中。PKA和CREB在初级纤毛内均不着色（图 5）。但p-PKA位于初级纤毛根部，p-CREB位于整根初级纤毛，虽然PKA和CREB均不在初级纤毛内，但被活化（磷酸化）后却能进入初级纤毛之中，发挥其相应功能。
图 5.
ROBs中PC2、sAC、PKA、p-PKA、CREB和p-CREB与初级纤毛的共定位结果
Immunostaining localization of PC2, sAC, PKA, p-PKA, CREB and p-CREB in primary cilia of rat calvarial osteoblasts. Acetylated α-tubulin are stained red, the target protein are stained green and nuclei are stained blue (with DAPI).
2.5. 抑制初级纤毛发生后PEMFs未激活PC2/sAC/ PKA/CREB信号途径
用针对IFT88的siRNA转染ROBs 48 h后，IFT88的mRNA和蛋白表达水平明显降低（图 6A~C），干扰成功。再用50 Hz 0.6 mT的PEMFs处理ROBs 3 d，结果显示，与CON组相比，PEMFs组的PC2、sAC、p-PKA、p-CREB的表达量均升高（P < 0.01，图 6D），siRNA组降低（P < 0.01），但与PEMFs组相比，siRNA+PEMFs组均降低（P < 0.01）。
图 6.
干扰初级纤毛后对PEMFs激活ROBs内PC2/sAC/PKA/CREB信号途径的影响
Effect of interference of the primary cilia on PEMFs-induced activation of the PC2/sAC/PKA/CREB signaling pathway in ROBs. A: IFT88 gene expression. B: IFT88 protein expression. C: Quantitative analysis of the gray value of IFT88. D: Changes of PC2/sAC/PKA/CREB signaling proteins. E-H: Quantitative analysis of the gray value of PC2/sAC/PKA/CREB signaling proteins (Mean±SD, n=3), **P < 0.01 vs the CON group, &&P < 0.01 vs the PEMFs group.
3. 讨论
PEMFs可以调节骨代谢，改善骨痛症状，增加骨密度[22, 23]，还可以体外促进ROBs矿化成熟，但其具体作用机制仍有待探究。本实验室前期研究已经证明，PEMFs可通过sAC/PKA/CREB信号途径促进成骨细胞矿化成熟。那么，又是什么信号使sAC活化的呢？最有可能的就是Ca2+。因为已有研究表明sAC可被Ca2+激活[24]，而电磁场处理可以引起包括成骨细胞在内的胞内Ca2+浓度的显著升高[25]，初级纤毛内的Ca2+主要来源于胞外环境，而不是胞内的钙库[26]，这就使我们联想到了作为Ca2+通道的瞬时受体电位之一的PC2。PC1和PC2蛋白共定位于ROBs初级纤毛中，其中PC1为感受器蛋白，具有感受外界信号刺激的功能，PC2作为Ca2+通道蛋白，与PC1相互作用完成细胞内外信号传导[27]。已有研究发现，特异性敲除Pkd2基因的小鼠表现出骨密度降低，骨小梁体积变小，矿盐沉着率下降的情况[28]。本研究通过一系列实验也发现PC2在PEMFs通过sAC/ PKA/CREB信号途径促进成骨细胞矿化成熟中起着至关重要的作用。
本研究发现，PEMFs处理能激活ROBs内sAC/ PKA/CREB信号途径并且能显著提高PC2蛋白的表达量。但使用AMI阻断PC2功能或用RNAi法敲低PC2的表达后，PEMFs不再能激活sAC/PKA/CREB信号途径，也不再能促进ROBs的矿化与成熟，这就说明PC2位于sAC/PKA/CREB信号途径的上游。本研究还发现，干扰ROBs初级纤毛的发生后，PC2的表达量大大降低，PEMFs也不再能激活PC2的表达，分析是干扰初级纤毛后PEMFs不再能通过sAC/PKA/CREB信号途径促进ROBs的分化与成熟的原因之一。与此同时，本实验也再次证明PC2定位于ROBs初级纤毛上，而ROBs的初级纤毛具有接受PEMFs信号的能力[29]，结合以上实验结果推测PC2应该是一种感受或传导PEMFs所发出的物理信号的特殊蛋白受体，PC2可能在将PEMFs发出的物理信号转化为胞内化学信号中有着重要的作用，这将有助于进一步阐明PEMFs促进骨形成的具体机制。
考虑到PC2在PEMFs通过sAC/PKA/CREB信号途径促进成骨细胞的成熟及矿化中的重要作用，我们推测PC2也可能在PEMFs促进ROBs矿化成熟的其它信号途径中起着关键作用，例如BMP2和Wnt/β-catenin信号途径。此外，为证明PC2确实发挥了关键作用，也有必要检测PEMFs处理后初级纤毛及ROBs胞内Ca2+浓度的变化，以及这种变化是否确实由PC2的Ca2+通道功能来实现。与此同时，PC1的变化情况也值得关注，已有报道指出成骨细胞在流体力学刺激下，PC1蛋白释放出C末端肽链并进入细胞质，在胞质内再次水解并发生核转位，激活Runx-2的表达，提高成骨活性[30, 31]。那么在PEMFs的作用下，PC1是否也会发生类似构象变化从而促进ROBs的分化与成熟？PC1又是如何与PC2相互作用从而影响sAC/PKA/CREB信号途径的呢？这都些都是本课题组今后的研究方向。
Biography
何玥颖，硕士，E-mail: hyy6163@163.com
Funding Statement
国家自然科学基金（81770879）；甘肃省青年科技基金计划项目（20JR5RA589）
Supported by National Natural Science Foundation of China (81770879)
Contributor Information
何 玥颖 (Yueying HE), Email: hyy6163@163.com.
陈 克明 (Keming CHEN), Email: chkeming@aliyun.com.
References
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