表达工程化剪接因子腺病毒的构建及其在调控乳鼠心肌细胞中的YAP1可变剪接中的应用

Abstract

Objective

To construct an adenovirus vector expressing artificial splicing factor capable of regulating alternative splicing of Yap1 in cardiomyocytes.

Methods

The splicing factors with different sequences were constructed against Exon6 of YAP1 based on the sequence specificity of Pumilio1. The PCR fragment of the artificially synthesized PUF-SR or wild-type PUFSR was cloned into pAd-Track plasmid, and the recombinant plasmids were transformed into E. coli DH5α for plasmid amplification. The amplified plasmids were digested with Pac I and transfected into 293A cells for packaging to obtain the adenovirus vectors. Cultured neonatal rat cardiomyocytes were transfected with the adenoviral vectors, and alternative splicing of YAP1 was detected using quantitative and semi-quantitative PCR; Western blotting was performed to detect the signal of the fusion protein Flag.

Results

The transfection efficiency of the adenovirus vectors was close to 100% in rat cardiomyocytes, and no fluorescent protein was detected in the cells with plasmid transfection. The results of Western blotting showed that both the negative control and Flag-SR-NLS-PUF targeting the YAPExon6XULIE sequence were capable of detecting the expression of the protein fused to Flag. The results of reverse transcription-PCR and PCR demonstrated that the artificial splicing factor constructed based on the 4th target sequence of YAP1 effectively regulated the splicing of YAP1 Exon6 in the cardiomyocytes (P < 0.05).

Conclusion

We successfully constructed adenovirus vectors capable of regulating YAP1 alternative splicing rat cardiomyocytes.

在基因表达的过程中选择性剪接是一步非常关键调控步骤^{[1, 2]}，其剪接的多样性给人的健康带来十分重要的影响^{[3, 4]}。通过选择性剪接，大多数基因会产生多种剪接亚型^[5]，具有相反的功能^[6]。在组织发育过程中，剪接异构体的选择在不同组织中受到严格调控^[7]，这种调控遭到破坏是人类疾病发生的常见原因之一^{[8, 9]}。可变剪接在病理生理过程中发挥重要作用^[10]，探讨特异性调节选择性剪接的新方法，将提高我们对剪接调节的理解，将有助于剪接调控相关疾病的治疗^[11]。

可变剪接过程通常是顺式作用元件通过募集反式作用剪接因子，来进行调节^[12]。这些顺式作用元件通过招募反式作用剪接因子，可以影响剪接位点的使用^[13]。反式剪接因子包含两大类，一类是富含丝氨酸/精氨酸的蛋白质(SR蛋白)，另一类是异质核核糖核蛋白(HnRNPs)。SR蛋白含有N末端RNA识别基序(RRM)^[14]和C端的RS结构域。其中RRM能与mRNAs前体中的外显子剪接增强子结合，使得C-末端精氨酸/丝氨酸结构域，发挥剪接调控作用，促进外显子剪入^[15]。

在RNA结合蛋白中，人Pumilio1的PUF结构域与同源RNA序列紧密结合^[16]。它包含8个PUF重复序列，能够分别识别8个连续的RNA碱基序列。通过改变这些PUF重复结构域，可以改变它们结合的RNA序列。因此可以设计一个PUF结构域来特异性结合大多数8-核苷酸RNAs。因为PUF蛋白本身是缺乏额外的功能模块，只有通过蛋白质之间的相互融合，才能形成RNA功能域，组装成识别特定序列，并具有相应功能的人工生物分子^{[17, 18]}；从而可以按照想要靶向的序列，设定人工化的RNA操控分子^[19]。

本研究通过合成生物学的方法，将这些序列特异的PUF结构域与剪接效应域构建融合蛋白，可以设计结合特定RNA序列，具有模块化的剪接因子。基于这一原理，2009年，北卡大学教堂山分校(UNC-CH)的王泽峰课题组基于可编程的RNA结合蛋白PUF构建了第一个可以进行RNA剪接调控的人工剪接因子^[20]。2018年，吴嘉炜课题组通过修改了PUF结构域，使其识别不同的RNA靶标，来构造了人工RNA结合蛋白，发现9个和10个重复序列，对RNA的结合力最高。但是，通过9个和10个重复序列构建的人工RNA剪接因子对可变剪接的调控方面，并不优于8个重复序列构建的人工RNA剪接因子^[21]。2021年，大连医科大学的汪洋课题组，设计了PUF人工蛋白来促进circRNA的形成^[22]。以上的几个研究证实了通过PUF序列进行人工剪接因子的构造和促进circRNA产生。但是将PUF蛋白转染到细胞过程总是会会产生脱靶和过表达等问题，因此本文通过腺病毒为载体将其应用到SD大鼠的心肌细胞中来调节PUF蛋白的可变剪接，使其能够特异性指向目标蛋白和调控剪接。

1. 材料和方法

1.1. 实验试剂

磷酸缓冲溶液(赛默飞)、RNA提示剂、三氯甲烷(西亚化学)、异丙醇(默克)、75%乙醇(阿拉丁)、双蒸水、胶原酶(I优宁维)、DMEM培养基(赛默飞)、10%小牛血清(赛默飞)、TBST溶液(默克)、质粒(谱新)、反转录试剂盒(联迈生物)、心肌细胞免疫鉴定盒(医诺生物)、Actinin一抗，α-Actinin (D6F6) XP Rabbit mAb(CST)、二抗：Anti-rabbit IgG (H+L)，F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 555 Conjugate)(CST)。

1.2. 实验动物

出生3 d的SD乳鼠，体质量22 g左右，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司[实验动物生产许可证号：SCXK(苏)2018-0008]。实验动物饲养条件：室温(18~22 ℃)，维持正常昼夜节律(12 h/12 h)，自由进食、饮水。动物实验经海军军医大学(第二军医大学)动物伦理审查委员会审查批准(SYXK 2020-01-015)。

1.3. 心肌细胞培养

出生3 d的SD乳鼠，75%酒精消毒皮肤，剪开胸腔，取出心室，迅速置入预冷的无钙镁离子平衡盐溶液中，用镊子去除心房后，将心室剪成1 mm³左右的组织碎块。用0.1%的胶原酶，4 ℃消化组织块，过夜。次日，1 mL移液器吹打组织块，将其吹散，以1000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀以全培液重悬。差速贴壁2 h，分离心肌成纤维细胞。细胞计数后，以3×10⁵-5×10⁵/mL密度接种于6孔板中，5% CO₂孵箱、37 ℃培养。24 h后换成含10%小牛血清和0.1 mmol/L BrdU的DMEM培液，以抑制掺杂的少量非心肌细胞增殖，继续孵育48 h后，换成不含血清DMEM溶液。心肌细胞无血清培养12 h后，观察细胞表型及提取蛋白。

1.4. RNA抽提

培养的SD大鼠心肌细胞，用预冷磷酸缓冲盐溶液漂洗后，置于1 mL总RNA提示剂中，-20 ℃保存备用。加入200 μL的三氯甲烷，震荡器震荡混匀后冰上，静置5 min；低温离心机中12 000 r/min离心10 min。小心吸取上清到新的EP管中，加入400 μL异丙醇，上下颠倒，混匀后，置于-20 ℃冰箱，沉淀RNA。超速离心机12 000 r/min，4 ℃离心15 min，弃上清，管底可见RNA白色沉淀斑块。加入75%乙醇1 mL，8000 r/min，4 ℃离心10 min，弃上清。短暂离心，用移液枪将剩余乙醇吸净，晾干。待酒精彻底挥发后，RNA沉淀斑块由白色变为透明，加入无RNA酶的水40 μL，吹打溶解RNA。取1 μL RNA进行浓度测定。

1.5. 逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)

取1 μg总RNA，按照说明书配反转录体系，采用SSIII进行反转录，反应条件：42 ℃ 15 min；95 ℃ 5 min；16 ℃保持。反转录产物用双蒸水稀释10倍后，作为PCR的cDNA模板。PCR产物经凝胶电泳进行分离。荧光定量PCR采用Sybgreen法。通过荧光信号获得目的基因的CT值，以GAPDH或U6为内参，通过2^-ΔΔCT的方法计算目的基因的相对表达量。

1.6. 腺病毒构建

将人工化的PUF-SR的PCR片断克隆到pAd-Track质粒中。将pAd-Track-PUF-SR质粒用Pme Ⅰ酶切后，转染BJ5183感受态菌进行同源重组，卡钠板挑选克隆后，进行质粒抽提，Pac Ⅰ酶切确认后，将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态，进行质粒扩增，获得pAd-easy-PUF-SR质粒；将其线性化后，转染293A细胞，进行病毒包装，转染后的细胞继续培养7~10 d，获得第1代腺病毒。将第1代腺病毒按10 MOI滴度，多次转染293A细胞，获得较高滴度的病毒液。将纯化好的病毒原液稀释10 000倍，然后10倍梯度依次稀释，分别转染293T细胞，37 ℃孵育24 h，荧光显微镜观察表达绿色荧光蛋白的细胞数，确定病毒滴度。

1.7. 腺病毒的转染

吸除心肌细胞的培养液，0.1 mol/L的PBS清洗2次后按MOI值1∶20计算，加入Flag-SR-NLS-PUF腺病毒液体，对照组加入0.1 mol/L PBS，感染1 h后吸除各组细胞的上清液，PBS清洗2次，加入含有血清的DMEM中，继续培养。

1.8. Western blot

蛋白样品经BCA法定量后，加入SDS裂解液，超声处理后，沸水浴煮5 min，于冰上静置2 min，用于后续Western blot检测。配制PAGE蛋白分离胶与浓缩胶后，100 V电压预电泳15 min。蛋白样品按每孔40 μg的量进行上样，100 V凝胶电泳10 min后，120 V电泳到溴芬兰至胶底。电泳结束后，100 V转膜2 h。将膜用5%牛奶封闭2 h后，置于4 ℃冰箱的摇床上，与TBST稀释的一抗α-Actinin (D6F6) XP Rabbit mAb以1∶1000孵育过夜。次日，室温下将膜用TBST清洗4次，8min/次。将膜置于用5%牛奶以1∶1000稀释的二抗Anti-rabbit IgG (H+L)，F(ab')2 Fragment中，室温孵育2 h，室温下将膜用TBST清洗4次，8 min/次。ECL显影，获得蛋白表达信号。

1.9. 心肌细胞鉴定

心肌细胞接种于35 mm培养皿中培养。贴壁后，吸去培养液，PBS漂洗细胞爬片。然后将其置于37 ℃，5% CO₂的培养箱中孵育45 min。然后吸出PBS。加组织固定液室温固定12 min。吸去固定液，加PBS液洗3次，5 min/次。弃PBS液，0.2% Triton X-100室温通透5 min，吸去通透液，加入PBS液漂洗3次，5 min/次。5%羊血清室温封闭2 h，吸去封闭液，滴加1∶100稀释(稀释液1%羊血清)的α-Actinin(D6F6)XP Rabbit mAb α-actinin抗体。4 ℃过夜。用自制针头小钩取出细胞爬片，PBS液漂洗6次，5 min/次。滴加二抗[Anti-rabbit IgG (H+L)，F(ab')2 Fragment，1∶200稀释]。盖好封口，37 ℃避光孵育1.5 h。吸去二抗，PBS液漂洗4次，5 min/ 次。取出爬片，蒸馏水清洗，DAPI封片，荧光显微镜下观察、拍照。

1.10. 统计学分析

采用SPSS19.0软件进行分析数据处理，数据以均数±标准差表示。对于符合正态分布的数据，实验组与对照组比较进行t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。所有实验独立重复3次。

2. 结果

2.1. 合成PUF-剪接因子来调控RNA可变剪接的原理

8个PUF重复蛋白结构域，可以识别8个连续的RNA碱基。PUF结构域和RNA之间的相互作用如晶体结构和图表所示。PUF重复序列结构域R1-R8分别识别核苷酸N8-N1(图 1A)。我们通过ASF的富含精氨酸/丝氨酸(SR)结构域与PUF结构域进行融合，设计一个Flag-SR-NLS-PUF结构域重组质粒载体。理论上，在细胞内，它可以表达一个带有核定位序列、剪接激活域和RNA结合域的蛋白，其中RNA结合域可以根据要识别的RNA序列进行灵活设计(图 1B)。

图 1.

PUF-SR调控可变剪接的原理

Rationale of PUF-SR-mediated regulation of alternative splicing. A: PUF Repeated Domain R1-R8 Recognizes Nucleotides N8-N1, respectively; B: Fusion of the arginine-rich/serine-rich (SR) domain of ASF with the PUF domain to form a Flag-SR-NLS-PUF domain recombinant plasmid vector.

2.2. YAP1在细胞中存在可变剪接，初步筛选调控YAP1可变剪接的作用序列

YAP1作为一个转录激活因子，能够与TEAD1等转录因子相互作用，调控基因的转录过程。本研究前期发现，YAP1在体内的多个部位存在着可变剪接。因此通过半定量PCR法在Exon5和Exon7设计引物以检测其可变剪接的情况。凝胶电泳结果的结果显示包含两种YAP1剪接亚型，一种亚型包含Exon6，一种亚型不包含Exon6(图 2A)。针对Exon6的48个碱基序列，本研究选择连续8个碱基作为PUF结构域的作用序列，一共选择6段序列，进行PUF合成(图 2B)。

图 2.

YAP1可变剪接的序列，PUF作用序列的筛选

Sequence of YAP1 alternative splicing (A) and screening of the target sequence of PUF (B).

2.3. 构建Flag-SR-NLS-PUF腺病毒对心肌细胞有较高的转染效率

根据靶向的碱基序列，通过PCR法构建PUF重复序列结构域R1-R8，将其与NLS序列和SR序列相连接后克隆到pAd-Track载体上，并使用腺病毒转染进心肌细胞中。通过荧光染色的实验结果可以看到腺病毒对心肌细胞有近乎100%的转染效率(图 3A上)。与此同时通过载体转染法对质粒进行转染作为对照(图 3A下)，但是在细胞内并没有发现绿色的荧光蛋白。这也证实通过腺病毒构建人工剪接因子的优越性。通过Western blot的实验结果，可以看出阴性对照组即野生型PUF-SR和6个靶向YAP1 Exon6序列的Flag-SR-NLS-PUF都能够检测到融合Flag的蛋白的表达(图 3B)。

图 3.

腺病毒在心肌细胞中的转染

Transfection of neonatal rat cardiomyocytes with the constructed adenovirus vectors. A: Transfection efficiency of the constructed adenoviruses and plasmids in cardiomyocytes (Original magnification: ×40). B: Expression of the protein fused with Flag detected by Western blotting.

2.4. 转染PUF-SR腺病毒到心肌细胞能有效调控YAP1可变剪接

本研究使用反转录PCR的方法检测YAP1可变剪接调控原代心肌细胞的情况，结果显示针对YAP1的第4个target序列，所构建的腺病毒，在心肌细胞中能有效调控YAP1的可变剪接，使得Exon 6的剪入增加(图 4A)。同时还设计了YAP1不同剪接亚型的定量PCR检测方法(图 4B)，检测了Flag-SR-NLS-PUF对YAP1可变剪接的调控作用，结果显示针对YAP1的第4个target序列所构建的人工剪接因子能够有效调控YAP1 Exon 6的剪入。

图 4.

PUF-SR在心肌细胞能有效调控YAP1可变剪接

PUF-SR can effectively regulate alternative splicing of YAP1 in rat cardiomyocytes. A: Results of PCR amplification. B: Results of quantitative fluorescence PCR. *P < 0.05 vs SR-PUF (WT).

3. 讨论

本研究通过PUF人工剪接因子实现了YAP1可变剪接的调控；构建了相应的腺病毒表达系统，能够对心肌细胞等多种原代细胞进行有效转染，并具有在体内应用的潜能。

本研究提供了一种操纵YAP1可变剪接的策略，可能为治疗YAP1可变剪接异常相关疾病提供一种技术手段。以前调节疾病相关剪接的方法都使用反义寡核苷酸掩盖剪接信号或通过延伸的未配对尾，招募额外因子，需要相对高剂量的寡核苷酸才能有效改变剪接^{[23, 24]}。与反义寡核苷酸方法相比，基于腺病毒表达系统的人工剪接因子调控可变剪接更灵活，因为它们可以影响多种选择拼接。

哺乳动物细胞中存在1500余种RNA结合蛋白，很多具有剪接调控功能^[25]。大多数剪接因子通过RRMs或K同源结构域等中等亲和力结合短的RNA元件。因为它们的结合亲和力较弱，并且缺乏预测性RNA识别代码，所以利用这些结构域设计RNA识别模块可行性较低^{[14, 26]}。这些RNA结合蛋白中，Pumilio1的PUF结构域能与同源RNA序列紧密结合^[20]。本研究将应用这种生成具有可预测特异性的RNA结合模块，使用了PUF蛋白的独特RNA识别模式，构建了调控YAP1可变剪接的人工剪接因子。既往基于PUF的人工剪接因子已被用来调控Bcl-x、TEAD4等多种剪接亚型的转换^[20]。理想情况下，这种工程剪接因子(ESF)应该识别任何目标，并以期望的方式调节剪接^[27]。但是在实验操作过程中，由于受结构限制，人工剪接因子通过PUF结构域识别特定区域，发挥剪接调控作用的效果，可能受到空间位阻的限制，因此需要进行实验优化，在本研究中，选择6条序列来设计PUF-剪接因子，其中只有一条效果比较明显。另外，PUF-剪接因子对可变剪接的调控作用与靶向调节的RNA分子自身有关；有些RNA分子的可变剪接容易受SR或Gly结构域的调控。那么，这些相应的分子的可变剪接也更容易被人工剪接因子控制。

本研究的创新性在于通过腺病毒构建了PUF-SR人工剪接因子能够调控难转染细胞的可变剪接。有研究表明通过PUF结构域的扩展可以RNA结合蛋白识别的结合特异性，设计基于蛋白质的RNA结合域来识别任意的RNA序列^[28]。而这种方法会产生脱靶效应，导致不能准确结合，但是通过以腺病毒为载体设计的PUF结构域恰好可以避免这种情况。有研究^[29]表明通过PUF结构域设计出人工RNA结合蛋白来帮助人们更好的了解RBPS和MiRNAs之间的功能关系，从而为治愈癌症等疾病提供方法。设计人工剪接因子来指导他们自己的前mRNAs的拼接提供了一个独特的机会来构建新的拼接调控反馈回路甚至新的调控网络，因此可以用来系统地模拟拼接调控是如何实现的^[30]。目前利用PUF结构域来应用于动物细胞的研究较少，大部分都还是注重于植物或者微生物中，本研究首次通过腺病毒为载体将其应用于乳鼠心肌细胞中并且成功实现了对YAP1可变剪接的调控。

我们在本研究中仅仅是构建了PUF-SR人工剪接因子的腺病毒，至于PUF-SR人工剪接因子调控YAP1可变剪接后是否影响心肌细胞的病理生理功能，仍有待于进一步研究。

Biographies

李阳，在读硕士研究生，E-mail: 1743673317@qq.com

赵倩，在读硕士研究生，E-mail: 1425892932@qq.com

Funding Statement

上海市杨浦区科委/卫健委科研面上项目(YPM202105)