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. 2022 Apr;51(2):185–191. [Article in Chinese] doi: 10.3724/zdxbyxb-2022-0047

脂质纳米粒- mRNA递送系统及其在嵌合抗原受体 T细胞治疗中的应用

Research advance in lipid nanoparticle-mRNA delivery system and its application in CAR-T cell therapy

Baixin YE 1,2,3,4, Yongxian HU 1,2,3,4, Mingming ZHANG 1,2,3,4, He HUANG 1,2,3,4
PMCID: PMC9353640  PMID: 36161298

Abstract

尽管嵌合抗原受体（CAR）T细胞治疗在血液系统恶性肿瘤患者中取得了显著的临床疗效，但需要进一步优化。脂质纳米粒（LNP）-信使核糖核酸（mRNA）递送系统作为一种非病毒性基因载体运用于CAR-T细胞治疗研究中，一方面通过LNP将密封蛋白-6 mRNA靶向递送至抗原提呈细胞，从而实现抗原提呈细胞辅助性增强密封蛋白-6靶向的CAR-T细胞的功能，以进一步诱导对实体瘤的清除；另一方面，通过LNP将成纤维细胞激活蛋白（FAP）CARmRNA靶向递送至T细胞，实现体内FAP靶向的CAR-T细胞的制备，以通过阻断心脏纤维化过程达到治疗急性心肌损伤的目的。在CAR-T细胞研究和治疗中，LNP-mRNA递送系统具有不与细胞基因组整合、价格便宜、毒副作用小及可修饰等优点，亦存在蛋白瞬时表达导致调控细胞功能的持久性不足及制备等方面的技术局限性。本文综述了LNP-mRNA递送系统及其在CAR-T细胞治疗中的应用研究。

嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）;信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）;脂质纳米粒（lipid nanoparticle，LNP）;抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）;密封蛋白（claudin，CLDN）;成纤维细胞激活蛋白（fibroblast activation protein，FAP）;

当前，CAR-T细胞治疗作为一种新型免疫疗法 [1] ，在急性淋巴细胞白血病、淋巴瘤及多发性骨髓瘤等血液系统恶性肿瘤的治疗中疗效显著 [ 2- 4] ，可能是一种潜在的治愈肿瘤的方法 [5] 。CAR分子是一种由具有特异性识别抗原的抗体单链可变区片段与具有细胞内转导T细胞活化信号的T细胞受体-CD3ζ等结构域融合而形成的人工CAR，其既可赋予T细胞具有类似于抗体特异性识别抗原分子的功能，又具备激活T细胞免疫的能力 [6] 。随着合成生物学及基因编辑技术的飞速发展 [ 7- 8] ，利用新的技术体系对CAR-T细胞实现辅助性功能增强及体内制备是目前该领域最新的研究方向 [ 9- 10] 。1978年，研究人员首次发现脂质体介导的兔珠蛋白mRNA能够在人类或小鼠体内进行翻译，遂开启了基于脂质的mRNA递送系统的研究先河 [11] 。LNP是一种基于脂质材料、能够携带核酸及小分子药物进入细胞内的非病毒性载体递送系统，已尝试用于基因治疗、肿瘤免疫及2019冠状病毒病疫苗开发等领域 [11] 。近期，研究人员利用LNP-mRNA递送系统实现了CAR-T细胞辅助性功能增强及其体内制备 [ 9- 10] ，这为该领域未来的发展指明了方向。本文综述了LNP-mRNA体内递送系统及其在CAR-T细胞治疗中的研究进展，以期为LNP-mRNA进一步临床应用提供思路。

不同脂质分子通常用于制备不同基于脂质的核酸递送系统，包括传统的脂质体、脂质复合物、阳离子纳米乳、纳米结构化脂质载体和LNP等 [ 11- 12] 。相对而言，LNP是一种更高效的核酸递送系统，其形态类似于一种微团结构，包含可装载药物或核酸分子的含水内核（ 图1）。在LNP-mRNA递送系统中，mRNA分子被装载于该内核环境中，并被携带至相应的组织部位。由于mRNA在血液循环中容易被多种酶蛋白降解，从而影响递送过程和效率，因此，用于制备LNP-mRNA递送系统的条件一般要求较高，需要利用特殊的工艺对特殊脂质成分按照精确比例进行配制。LNP的成分主要包括阳离子/离子化脂质和辅助性脂质 [13] 。不同脂质成分发挥不同的作用，其中阳离子脂质的头部带有正电荷，可与核酸聚合物混合形成复合物，保护RNA和DNA免受核酸酶降解；离子化脂质在正常酸碱度值时呈中性，但在酸碱度值降低时会发生质子化而带有正电荷。阳离子/离子化脂质结构对所递送核酸的质量及活性有重要影响，且能通过降低其免疫原性而弱化其毒副作用。此外，辅助性脂质包括磷脂、胆固醇、聚乙二醇化脂质等其他脂质成分，可影响LNP的稳定性及其递送效率 [14] 。一般来讲，LNP表面亦可连接特异性抗体分子等，赋予LNP-mRNA递送系统组织或细胞的靶向性，为精准修饰细胞功能奠定技术基础。由此可见，根据特定的生理或病理条件，可通过对LNP-mRNA递送系统的组成成分进行设计并优化，从而为特定类型的免疫细胞功能修饰奠定基础 [ 11， 15] 。

图 1 .

图 1

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LNP-mRNA递送系统组成及结构LNP-mRNA递送系统由外层脂质分子形成的膜性外壳及包裹了mRNA分子的含水内核组成，外层脂质分子可进行修饰，如连接相应的基团或特异性抗体等，从而实现其细胞靶向性. LNP：脂质纳米粒；mRNA：信使核糖核酸.

LNP-mRNA递送系统在体内发挥相应功能须经历如下过程 [11] ：LNP-mRNA随着血液循环被运送至不同的组织和细胞，根据LNP外表面脂质分子的特点，其可与细胞膜表面蛋白发生相互作用，从而介导LNP-mRNA与特定细胞膜结合，并触发LNP的内吞过程，见 图2。如当LNP外表面偶联CD5特异性抗体后，该抗体可通过与表达CD5抗原的T细胞膜结合，从而介导T细胞对LNP-mRNA特异性的内吞过程，该过程赋予了LNP的靶向性，对开发相关疾病的靶向治疗方法意义重大。当LNP被细胞内吞后，在细胞质中形成内体，大部分LNP在内体中被酶降解，仅有一小部分LNP-mRNA能完成内体释放过程，从而使外源性mRNA分子进入细胞质中，在核糖体等细胞器的辅助下启动翻译过程，从而成功表达外源性蛋白，以完成细胞的功能调控过程。

图 2 .

图 2

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LNP-mRNA递送系统的作用过程LNP-mRNA与细胞膜相关分子或受体结合（A），以内吞的方式进入细胞质内（B）形成内体（C），LNP-mRNA与内体膜融合并释放mRNA分子，mRNA在细胞质内进行翻译合成功能性蛋白（D）. LNP：脂质纳米粒；mRNA：信使核糖核酸.

LNP-mRNA递送系统在完成上述过程中需要克服多个生理性屏障 [11] ：①LNP结构需要保护mRNA免受体液中核酸酶的降解；②LNP需要避免被吞噬细胞及肾脏系统等清除；③LNP-mRNA递送系统还需要靶向到相应的组织或细胞附近，并被特定的靶细胞内吞；④LNP-mRNA被内吞储存在内体后，还需要从内体成功释放到细胞质中，才能完成整个功能过程。上述复杂递送过程受LNP本身的组成成分影响较大 [14] 。不仅如此，对mRNA序列进行修饰亦可以减少被核酸酶水解的概率。因此，LNP-mRNA组分构成的设计及修饰对于核酸精准递送来说至关重要。

当前，CAR-T细胞治疗在血液系统恶性肿瘤中取得了显著疗效 [ 16- 17] ，然而在实体瘤的治疗中仍面临巨大挑战 [6] 。在肿瘤治疗中，CAR-T细胞本身的植入及持续性是影响临床疗效的重要因素 [18] 。在B细胞性血液系统恶性肿瘤的治疗过程中，CAR-T细胞可以直接靶向B细胞系列表面分子；而B细胞发挥了类似抗原提呈的功能，在CAR-T细胞与B细胞相互作用过程中，为CAR-T细胞的定植与持续性提供了充足的生长信号 [ 4， 19] 。在实体瘤治疗中，CAR-T细胞定植及持续性不足是导致临床效果不佳的重要原因：首先，CAR-T细胞难以到达实体瘤组织部位，从而与肿瘤细胞膜表面蛋白发挥相互作用的可能性受到一定的限制，导致CAR-T细胞在体内获取促进其定植及持续性的信号强度不足；其次，在肿瘤免疫抑制的环境下，CAR-T细胞即使与肿瘤细胞表面抗原接触，仍然难以获取足够的增殖信号 [ 20- 22] 。由此可见，APC可能在CAR-T细胞定植和生存中发挥重要作用，通过激活APC而介导CAR-T细胞的功能增强是可行的 [10] 。

LNP-mRNA通过静脉注射的方式进入血液循环，可被脾脏、淋巴结及骨髓中的APC摄取，并激活APC中I型干扰素介导的免疫激活通路，从而促进抗原特异性T细胞激活并扩增 [23] 。基于上述思路，LNP-mRNA可以克服实体瘤治疗中CAR-T细胞持久性不足的问题，并且可以增强CAR-T细胞抗肿瘤的功效 [10] 。在肿瘤细胞紧密连接中发挥重要作用的跨膜蛋白CLDN6作为一种肿瘤相关抗原 [ 24- 25] ，可以成为实体瘤患者CAR-T细胞治疗的新靶点 [10] 。LNP-mRNA递送系统携带CLDN6抗原mRNA进入树突状细胞后，促使树突状细胞膜表面表达CLDN6抗原，树突状细胞通过与CLDN6靶向的CAR-T细胞结合并为其提供生存信号，以促进CAR-T细胞的定植和扩增（ 图3）。静脉注射LNP-mRNA可促进CLDN6在小鼠体内脾树突状细胞和巨噬细胞上表达；在接受过全身照射诱导的淋巴细胞清除后的小鼠中发现，单次静脉注射CLDN6靶向的LNP-mRNA疫苗便可诱导CAR-T细胞显著扩增；在重复接受LNP-mRNA疫苗接种后的小鼠中可检测到记忆性CAR-T细胞，可见LNP-mRNA赋予CAR-T细胞更长的持久性；仅注射CLDN6靶向的CAR-T细胞的小鼠体内肿瘤生长延迟但并未停止，而在LNP-mRNA接种后的小鼠中，有60%对肿瘤显示出完全排斥的现象，这在动物实验水平证明了LNP-mRNA疫苗接种对CAR-T细胞治疗实体瘤功效有增强作用 [10] 。由此可见，基于LNP-mRNA递送系统，通过激活APC可进一步在体内实现CAR-T细胞的辅助性功能增强效应。

图 3 .

图 3

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基于LNP-mRNA递送系统的树突状细胞激活对CAR-T细胞治疗效果的影响LNP-mRNA靶向导入树突状细胞后，在树突状细胞细胞膜表面表达靶标分子CLDN6，该靶标分子CLDN6与CLDN6靶向的CAR-T细胞结合，能辅助性功能增强CLDN6靶向的CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞的功能. CLDN：密封蛋白；CAR：嵌合抗原受体；LNP：脂质纳米粒；mRNA：信使核糖核酸.

当前，CAR-T细胞的制备主要借助于体外转染技术，即将患者或其他供者的T细胞通过携带CAR基因序列的病毒载体进行体外转染，从而工程化制备CAR-T细胞，并回输给患者以治疗相关疾病 [ 2， 16] 。该流程存在多个可以优化的环节，如细胞制备流程较为繁琐、体外T细胞来源有限及存在病毒载体插入到细胞基因组并诱导肿瘤产生的风险等 [26] 。

最近，体内制备CAR-T细胞的研究在心肌损伤领域取得了重要进展 [9] （ 图4）。心肌损伤后，心脏成纤维细胞被活化并分泌多种因子，导致心肌细胞的功能受损及心肌组织硬度增强 [ 27- 29] 。因此，清除活化的成纤维细胞是阻断心肌损伤的重要干预措施 [ 30- 32] 。研究表明，FAP是心肌组织中成纤维细胞活化的表面抗原标志 [ 9， 30] ，其可作为CAR-T细胞的靶标分子用于抗心肌纤维化的CAR-T细胞构建。有研究团队构建了CD5靶向的LNP-FAP CAR mRNA递送系统 [ 9， 33] 。由于CD5自然表达于T淋巴细胞和少量B淋巴细胞的膜表面，且对T淋巴细胞效应功能是非必需的分子，研究者将CD5的特异性抗体分子偶联在LNP-mRNA表面，从而使CD5特异性抗体修饰后的LNP-mRNA递送系统靶向CD5阳性T淋巴细胞；同时，合成了针对FAP的CAR分子mRNA，并进行碱基修饰，以增加其稳定性。体外实验表明，CD5靶向的LNP-FAP CAR mRNA与小鼠T细胞共孵育48 h后，可被83%的T淋巴细胞特异性摄取，并能有效杀伤FAP表达靶细胞；体内实验也进一步证实该递送系统对T淋巴细胞具有很好的特异性，小鼠在注射CD5靶向的LNP-FAP CAR mRNA 48 h后，可持续检测到一群FAP CAR阳性T淋巴细胞（17.5%~24.7%），相比较而言，小鼠在注射无CD5靶向的LNP-FAP CAR mRNA后体内不能检测到FAP CAR阳性T淋巴细胞，说明CD5靶向的LNP-FAP CAR mRNA具有较好的T淋巴细胞靶向性，这为体内构建CAR-T细胞奠定了重要的技术基础。不仅如此，血管紧张素Ⅱ/苯肾上腺素诱导的心肌损伤小鼠在CD5靶向的LNP-FAP CAR mRNA处理后左心室舒张及收缩功能恢复到正常水平，而经无CD5靶向的LNP-FAP CAR mRNA处理后小鼠左心室舒张及收缩功能无明显改善；进一步研究发现，FAP CAR阳性T淋巴细胞与FAP阳性的活化成纤维细胞在空间上具有聚集性，且其聚集部位周围的心肌纤维化程度明显减轻，而其他部位心肌纤维化则无明显改变 [9] 。该研究在功能水平证实了该LNP-mRNA递送系统的有效性和T淋巴细胞靶向性，首次证明了体内制备CAR-T细胞是可行的。

图 4 .

图 4

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基于LNP-mRNA递送系统的体内嵌合抗原受体T细胞的制备LNP-mRNA递送系统通过其表面抗CD5抗体，与体内T细胞膜表面CD5结合，促使T细胞膜表面表达FAP CAR分子，从而完成体内生成FAP靶向的CAR-T细胞.FAP靶向的CAR-T细胞与心肌纤维细胞膜表面FAP分子结合，可介导心肌纤维细胞的凋亡过程. FAP：成纤维细胞激活蛋白；CAR：嵌合抗原受体；LNP：脂质纳米粒；mRNA：信使核糖核酸.

值得注意的是，基于CD5靶向的LNP-FAP CAR mRNA递送系统的体内CAR表达是瞬时的，致使CAR-T细胞存在亦是短期的，如果需要加强效果，可进行多次给药。这种瞬时性特点有利于控制剂量及减轻毒副作用。然而，对于肿瘤性疾病来说，由于肿瘤细胞不易清除，记忆性CAR-T细胞的存在对长期免疫监视肿瘤细胞的发生非常重要，可在一定程度上避免肿瘤复发 [34] 。然而，通过LNP-mRNA递送系统体内瞬时制备CAR-T细胞在肿瘤治疗中可能不利于记忆性CAR-T细胞的存活，在肿瘤长期控制过程中可能存在一定的局限性。对于心肌纤维化、自身免疫性疾病及感染性疾病等非肿瘤性疾病的CAR-T细胞治疗来说 [ 35- 37] ，瞬时性CAR-T细胞有利于规避其长期效应导致的毒副作用，在临床应用过程中，对剂量和效果可能更具有可调控性，因此未来的发展潜力巨大。

LNP-mRNA递送系统在大规模临床推广中已显示出较好的安全性及有效性 [38] ，作为一种非病毒性基因载体在CAR-T细胞治疗研究及应用中相比病毒性基因载体具有如下突出优势：①LNP-mRNA递送系统可有效避免病毒性基因载体中基因组与靶细胞基因组发生整合，理论上避免了因病毒基因插入导致肿瘤发生的风险；②LNP-mRNA递送系统实现基因的瞬时表达，可通过给药次数对给药剂量进行相对精准的调整，较病毒性基因载体更具可控性；③LNP-mRNA递送系统使用起来更加方便，且成本相对较低，易于在临床进行大规模推广；④可通过对LNP-mRNA表面进行分子修饰，使其具有组织或细胞靶向性，对于精准调控CAR-T细胞功能具有更好的操作性。

当然，LNP-mRNA递送系统在CAR-T细胞治疗应用过程中亦存在一些不足 [8] ：①LNP-mRNA递送系统作为一种靶蛋白的瞬时表达系统，无法满足持久蛋白表达的要求，不利于建立免疫细胞的长期免疫监视功能。在较长时间间隔期，部分CAR-T细胞亚群会发育为记忆性细胞，这有利于携带了CAR分子的T淋巴细胞长期对肿瘤细胞进行监视及清除，从而成为一种“活药物”；但若采用LNP-mRNA递送系统介导的CAR分子瞬时表达，将限制体内产生记忆性CAR-T细胞，不利于控制肿瘤的复发。②由于LNP-mRNA递送系统介导蛋白表达的瞬时性，需要多次给药才能达到治疗目标，因此治疗成本较高、治疗流程繁琐。③LNP-mRNA递送系统研发存在较多技术难题，如mRNA的内体释放效率低及易被降解、LNP的转染效率及特异性有待提高等，LNP-mRNA在保存及运输条件等方面亦有较高的要求。未来LNP-mRNA递送系统在CAR-T细胞治疗应用过程中仍须克服技术本身的局限性，以更好应用于临床肿瘤治疗。

COMPETING INTERESTS

所有作者均声明不存在利益冲突

Funding Statement

国家自然科学基金（81730008）

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Articles from Journal of Zhejiang University (Medical Sciences) are provided here courtesy of Zhejiang University Press

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