A (-)-Carvona Modula a Sinalização de Cálcio Intracelular com Ação Antiarrítmica em Corações de Ratos

Gilmara Beatriz Andrade da Silva; Diego Santos Souza; José Evaldo Rodrigues Menezes-Filho; Júlio Alves da Silva-Neto; Jader dos Santos Cruz; Danilo R Roman-Campos; Lucindo José Quintans-Júnior; Carla Maria Lins de Vasconcelos

doi:10.36660/abc.20210499

. 2022 Jul 29;119(2):294–304. [Article in Portuguese] doi: 10.36660/abc.20210499

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A (-)-Carvona Modula a Sinalização de Cálcio Intracelular com Ação Antiarrítmica em Corações de Ratos

Gilmara Beatriz Andrade da Silva ¹, Diego Santos Souza ¹, José Evaldo Rodrigues Menezes-Filho ¹, Júlio Alves da Silva-Neto ¹, Jader dos Santos Cruz ², Danilo R Roman-Campos ³, Lucindo José Quintans-Júnior ¹, Carla Maria Lins de Vasconcelos ^1,^✉

PMCID: PMC9363060 PMID: 35946691

Resumo

Fundamento:

A (-)-carvona é um monoterpeno encontrado em óleos essenciais com atividade antioxidante e anti-inflamátoria.

Objetivos:

O objetivo deste estudo foi analisar a propriedade antiarrítmica da (-)-carvona no coração de rato e seus efeitos sobre a sinalização de Ca⁺² intracelular.

Métodos:

Os efeitos da (-)-carvona foram avaliados sobre a contratilidade atrial (0,01 – 4 mM) e ventricular (0,5 mM), e no eletrocardiograma (0,5mM). A fração de encurtamento, a corrente de cálcio do tipo L (I_Ca,L) e a sinalização de Ca⁺² foram medidas no cardiomiócito isolado (0,5 mM). O efeito antiarrítmico foi avaliado no modelo de arritmia induzida por sobrecarga de cálcio (0,5 mM) (n = 5). Um p < 0,05 foi adotado como nível de significância estatística.

Resultados:

No átrio, a (-)-carvona causou inotropismo negativo de maneira concentração-dependente (EC₅₀ 0,44 ± 0,11 mM) e diminuiu o inotropismo positivo induzido pelo CaCl₂ (0,1 – 8,0 mM) e BAY K8644 (5 - 500 nM), um agonista de canal de cálcio do tipo L. Em coração isolado, a (-)-carvona (0,5mM) reduziu a contratilidade ventricular em 73% e a frequência cardíaca (em 46%), aumentou o Pri (30,7%, tempo desde o início da onda P até a onda R) e o QTc (9,2%, uma medida de despolarização e repolarização dos ventrículos), sem mudar a duração do complexo QRS. A (-)-carvona diminuiu a fração de encurtamento (61%), a (I_Ca,L) (79%) e o transiente intracelular de Ca⁺² (38%). Além disso, a (-)-carvona apresentou ação antiarrítmica, identificada pela redução do escore de arritmia (85%) e ocorrência de fibrilação ventricular.

Conclusão:

A (-)-carvona reduz a entrada de Ca⁺² através de canais de Ca⁺² do tipo L e, assim, diminui a contratilidade cardíaca e o Ca⁺² intracelular e apresenta promissora atividade antiarrítmica no coração de ratos.

Palavras-chave: Arritmias Cardíacas, Monoterpenos, Ratos

Introdução

As arritmias são consideradas um problema sério de saúde pública e são uma importante causa de morbidade e mortalidade no mundo.¹ Entre as principais, batimentos ventriculares prematuros (BVP), taquicardia ventricular sustentada, e fibrilação ventricular são comuns em pacientes com miocardiopatia isquêmica ou não isquêmica.¹ No entanto, os tratamentos com drogas antiarrítmicas geralmente causam respostas pró-arrítmicas adversas ou ausência de melhora na qualidade de vida de indivíduos com arritmias.²

Desde 1970, quando Vaughan-Williams classificou as drogas antiarrítmicas com base em seus mecanismos farmacológicos para bloquear canais iônicos ou receptores específicos, pesquisadores investiram muito tempo e esforço para descobrir novas terapias com um risco mais baixo de efeitos adversos para o paciente.^3–5

Entre as novas terapias, compostos de origem natural têm demonstrado sua capacidade de inibir arritmias cardíacas ventriculares, gerando interesse na comunidade científica. Os terpenos mostraram-se como os principais compostos com atividade antiarrítmica comprovada.^6–9 Entre eles, a carvona (p-mentha-6,8-dien-2-one) é de particular interesse, dadas suas propriedades já estabelecidas. A carvona é uma cetona pertencente ao grupo dos monoterpenos, e conhecida por sua atividade antioxidante, antimicrobiana, e antifúngica.^10,11 Parece atuar também sobre canais de sódio dependentes de voltagem nos neurônios, levando a um efeito anticonvulsionante.^12,13 Ainda, a carvona demonstrou um efeito antiespasmódico pela inibição dos canais de cálcio dependentes de voltagem, e uma ação anticâncer sinergística com a doxorrubicina sobre células MCF7, reduzindo sua cardiotoxicidade.¹⁴ Como já foi decrito na literatura, a carvona bloqueia canais de sódio e cálcio, e medicamentos dessa classe têm propriedades antiarrítmicas e cardioprotetoras. Assim, decidimos estudar os efeitos da carvona sobre a regulação do cálcio na célula e sua possível ação antiarrítmica nos corações de ratos.⁹

Embora existam vários estudos sobre a (-)-carvona na literatura científica, em nosso conhecimento, não existem explicações ou hipóteses sobre o mecanismo de ação desse monoterpeno no músculo cardíaco. Portanto, nosso objetivo foi avaliar os possíveis efeitos cardíacos da (-)-carvona, e apresentar uma melhor explicação científica de suas ações no tecido cardíaco que possa servir como base para o desenvolvimento de novos medicamentos de origem natural para o tratamento de arritmias.

Materiais e métodos

Animais

Os experimentos foram conduzidos com ratos machos Wistar (250-300 g) obtidos do biotério da Universidade Federal de Sergipe (UFS). Em cada procedimento, foram usados cinco animais.¹⁵ Este estudo foi aprovado pelo Comitê de ética em pesquisa com animais da UFS (protocolo 61/16, 20 de fevereiro de 2017). O manejo dos ratos foi realizado em acordo com os princípios éticos na experimentação animal (NIH publication 86-23, revised 1985; http://oacu.od.nih.gov/regs/index.htm).

Avaliação do efeito inotrópico da (-)-carvona

O efeito inotrópico da (-)-carvona foi avaliado no átrio esquerdo dos corações dos ratos imersos em uma câmara contendo solução de Krebs-Henseleit (K-H) (em mM): NaCl 120, KCl 5,4, MgCl₂ 1,2, NaHCO₃ 27, CaCl₂ 1,25, Glicose 10, NaH₂PO₄ 2,0 (pH 7,4). O átrio foi mantido a 29° ± 0,1°C, oxigenado (95% O₂ e 5% CO₂), estirado a uma tensão de 5mM e submetido à estimulação de campo (1 Hz, 100 V, 0,5 ms) (Stimulator SD9 GRASS). A força atrial foi registrada utilizando um transdutor de força isométrica (GRASS FT03), e os sinais foram digitalizados (DATAQ DI710, WINDAQ PRO Acquisition). As curvas de dose-resposta da (-)-carvona (0,001 – 4,0 mM) e nifedipina (0,03 - 100 µM, bloqueador de canal de Ca⁺²) foram obtidas para determinar a resposta contrátil e calcular o EC50. Dimetilsulfóxido (DMSO) 0,5% foi usado como diluente para a (-)-carvona.

Efeitos da (-)-carvona sobre a entrada de cálcio no miocárdio atrial

Para analisar a ação da (-)-carvona sobre a entrada de Ca⁺², foram obtidas curvas de dose-resposta de CaCl₂ (0,1 a 8,0 mM) e (±)-Bay K8644 (5 a 500 nM) no átrio esquerdo no controle e após pré-incubação com (-)-carvona (1 mM) por 15 minutos. Os resultados foram expressos em porcentagens da resposta contrátil máxima do átrio ao CaCl₂ no controle. Em ambos os protocolos, a concentração inicial de CaCl₂ na solução de K-H foi 0,5mM.^7,16

Effeitos da (-)-carvona sobre o perfil eletrocardiográfico e pressão do ventrículo esquerdo (PVE)

Após a administração intraperitoneal de heparina (1000 UI) por 15 minutos, os corações foram removidos e preparados em um sistema de perfusão aórtica de fluxo constante (10mL/min). O coração foi perfundido com solução de K-H previamente filtrada (0,45 µm), oxigenado (95% O₂ + 5% CO₂) e mantido a 34 ± 0,1°C (Haake F3). Para registrar o eletrocardiograma (ECG), três eletrodos (Ag/AgCl/NaCl 1 M) foram colocados sobre o coração para detectar sinais elétricos. Os sinais foram amplificados e digitalizados (PowerLab 4/35 ADInstrument, EUA). A medida da PVE foi realizada utilizando-se um balão com água (15cm/Hg) introduzido na cavidade do ventrículo esquerdo. Esse aparelho foi acoplado a um transdutor de pressão (MLT0699/A). Os sinais foram amplificados e enviados para um conversor AD (PowerLab 4/35 26 ADInstrument, EUA). O sistema foi calibrado usando uma coluna de mercúrio. Os parâmetros de contração (PVE, tempo para o pico e tempo de relaxamento) foram avaliados em 30 batimentos consecutivos pelo programa LabChart 8.0 Pro Software (ADInstruments, USA) em situação controle e após cinco, 10 e 15 minutos após o início da perfusão com carvona (0,5 mM). O ECG mediu o intervalo PR (PRi – período entre o início da onda P até a onda R), duração do complexo QRS (QRS – período que se estende da onda Q até a onda S), e o intervalo QT (QTi - período entre o início da onda Q até a onda o final da onda T). O QTi foi convertido a QTc usando a formula de Bazett normalizada para roedores (QTc-B = QTi/RR/f), onde f é a duração média do intervalo RR no controle (f = 271 ms).

Efeitos da (-)-carvona sobre a fração de encurtamento

Os cardiomiócitos do ventrículo esquerdo e direito foram isolados dos ratos de acordo com o protocolo de Shioya (2007),¹⁷ com algumas modificações. A fração de encurtamento foi avaliada medindo-se a mudança no comprimento celular com um microscópio invertido acoplado a um sistema de detecção de bordas (Ionoptix, EUA). Os cardiomiócitos foram colocados em uma câmera experimental (temperatura ambiente) contendo solução de Tyrode (em mM: NaCl 150, KCl 5,4, MgCl₂ 0,5, HEPES 10, Glicose 10, CaCl₂ 1,8, pH 7,4). Os cardiomiócitos foram visualizados usando uma câmera (Ionoptix Myocam at 240 Hz) acoplada a um microscópio e um programa de detecção de imagem foi utilizado (Ionoptix Ionwizard 6,3). As mudanças longitudinais nas bordas dos cardiomiócitos foram capturadas pelo sistema de detecção, e os dados gerados foram armazenados e analisados. A fração de encurtamento foi avaliada nas células controles e após incubação com (-)-carvona 0,5mM.

Efeitos da (-)-carvona sobre a corrente de cálcio do tipo L (I_Ca,L)

Os registros de ‘voltage-clamp’ do grampeamento de voltagem foram obtidos usando um EPC 10.2 (HEK Elektronik, Alemanha). Na configuração de célula inteira, aguardou-se um período de 3-5 minutos para se estabelecer o equilíbrio iônico entre a pipeta e o meio intracelular. Os eletrodos de registro possuíam resistência de 2-3 MΩ. Os cardiomiócitos ventriculares com resistência de série acima de 8 MΩ foram descartados. A composição da solução interna era (em mM): 120 CsCl, 20 TEACl, 5 NaCl, 10 HEPES e 10 EGTA, 1 MgCl2 (pH foi estabelecido em 7,2 usando CsOH), e a solução externa foi composta de (em mM): 150 TEACl, 0,5 MgCl2, 1,8 CaCl2, 10 HEPES e 11 glicose (pH 7,4, com TEAOH). Para avaliar os efeitos agudos de 0,3 e 0,5 mM de (-)-carvona sobre I_Ca,L, registrou-se um curso temporal do pico da corrente I_Ca,L tanto na ausência como após exposição a uma data concentração de (-)-carvona. Foram aplicados pulsos com potenciais entre −80 mV to −40 mV por 50 ms para inativar quaisquer canais de Na⁺ ou do tipo Ca⁺² remanescentes. Em seguida, foi aplicado um pulso de teste a 0mV por 300ms para medir I_Ca,L.

Efeitos da (-)-carvona sobre o transiente global de Ca⁺² intracelular

Os cardiomiócitos do ventrículo direito e esquerdo foram incubados com 10 µM de FLUO4-AM (Molecular Probes, Eugene, OR, EUA) diluídos com DMSO por 30 minutos. As células em seguida foram lavadas com solução de Tyrode (1,8 mM Ca⁺²) para retirar o excesso de FLUO4-AM. Um sistema confocal (Zeiss GmbH, Jena, Alemanha) com uma objetiva de imersão em óleo (63x) foi usado para análise de imagens fluorescentes confocais. O FLUO4-AM foi excitado a 488nm (laser de argônio) e a intensidade da emissão foi medida a 510 nm. Os cardiomiócitos foram escaneados com uma linha de 512 pixel posicionada ao longo do eixo longitudinal da célula, a cada 1,54 ms. O processamento da imagem digital foi realizada usando uma linguagem de programação IDL (Research Systems, Boulder, CO, EUA).⁹ Os níveis de Ca²⁺ intracellular foram expressos em F/F₀, onde F₀ indica a fluorescência de repouso. O transiente global de Ca⁺² intracelular foi registrado no controle e após três minutos de incubação com (-)-carvona 0,5mM à temperatura ambiente.

Efeitos antiarrítmicos da (-)-carvona

Arritmia ex-vivo foi determinada em corações isolados como descrito previamente.¹⁸ Primeiramente, os corações foram perfundidos com solução K-H contendo 1,25 mM de cálcio (grupo controle). Após 20 minutos, os corações foram perfundidos com solução K-H contendo 3,3 mM de cálcio (grupo com cálcio elevado) ou com cálcio +0,5 mM (-)-carvona durante 15 minutos (grupo cálcio elevado + carvona). O ECG foi monitorado por 15 minutos para avaliar a ocorrência de arritmias. As arritmias encontradas foram BVP, taquicardia ventricular (TV) e fibrilação ventricular (FV). O período de 15 minutos de experimento foi dividido em intervalos de três minutos e os escores de arritmia foram adicionados no final, como descrito por Curtis e Walker (1988).^9,19 Episódios de BVP < 3 eventos/3 minutos foram classificados como escore 0 e > 10 eventos/3 minutos receberam escore 1; 1-5 episódios de TV < 40 s receberam escore 2, e > 5 episódios de TV ou um episódio de FV com duração < 40 s receberam escore 3; 2 - 5 episódios de TV ou FV com duração < 80 s receberam escore 4; > 5 episódios de FV, TV e/ou FV com duração < 160 s receberam escore de 5; TV e/ou FV com duração < 300 s receberam escore de 6, e duração > 300 s escore 5.

Análise estatística

Todos os resultados foram apresentados em média ± desvio padrão (DP). O programa GraphPad Prism v.5.0 (GraphPad Software, CA, USA) foi usado para as análises. A normalidade dos dado foi testada usando o teste de Shapiro-Wilk. Os valores médios foram comparados usando a análise de variância (ANOVA) seguida do teste post hoc de Tukey ou teste t não pareado. Um p<0,05 foi usado como nível de significância.

Resultados

A (-)-carvona (0,003 a 4 mM) reduziu a força atrial de maneira concentração-dependente. A Figura 1A mostra traçados de curvas da concentração atrial isolada em situação controle, com (-) carvona 0,3, 2 e 4 mM, e no washout. Como pode ser visto, 4mM de (-)-carvona reduziram a contratilidade do miocárdio em aproximadamente 96%, e a reversibilidade após o washout foi de aproximadamente 65%. A Figura 1B mostra uma curva de concentração-resposta do efeito inotrópico negativo da (-)-carvona que apresentou um EC₅₀ de 0,44 ± 0,11 mM (n = 5). A nifedipina, usada como controle positivo, apresentou valores de EC₅₀ de 0,0034 ± 0,0011 mM (n = 5). O DMSO a 0,5%, usado como diluente, não apresentou efeito sobre a força atrial (dados não apresentados).

Uma vez que a (-)-carvona provocou um efeito inotrópico negativo, decidimos investigar se o canal de cálcio está envolvido em seu mecanismo de ação. Os resultados revelaram que a (-)carvona (1mM) deslocou a curva de concentração-resposta para a direita, aumentando o EC50 do CaCl₂ de 1,46 ± 0,14 mM (controle) para 3,17 ± 0,22 mM (CaCl2 + carvona) (Figura 1C, n = 5, p < 0,05). Um dado interessante foi a inibição do inotropismo induzido pelo (±)-BAY K8644, um agonista do canal de cálcio do tipo L (Figura 1 D).

Nos corações isolados, 0,5mM de (-)-carvona também induziu uma redução na PVE, como pode ser observado nos traçados da Figura 2A (n=5). Uma redução de 73% na PVE foi observada após 15 minutos de perfusão do coração com 0,5mM de (-)-carvona (Figura 2B). A (-)-carvona não alterou o tempo para o pico (Figura 2C), mas reduziu significativamente o tempo de relaxamento (24%) após 15 minutos de perfusão com (-)-carvona (Figura 2D).

A Figura 3A apresenta traçados ecocardiográficos representativos da situação controle após 15 minutos de perfusão com 0,5mM de (-)-carvona e washout. Como pode ser observado, a (-)-carvona diminuiu a frequência cardíaca (n=5, Figura 3B) e aumentou tanto o PRi como o QTi (n=5, Figura 3C e D), sem mudar a duração do complexo QRS (Figura 3E).

A Figura 4A apresenta registros da contratilidade celular na situação controle (painel superior) e após perfusão com 0,5mM de (-)-carvona (painel inferior), mostrando a redução na fração de encurtamento nos cardiomiócitos. As médias dos resultados mostraram redução da fração de encurtamento após incubação com (-)-carvona (n=5, Figura 4B). Ainda, a (-)-carvona reduziu tanto o tempo para o pico como o tempo de relaxamento em 50% (Figuras 4C e D).

Considerando o papel principal dos canais de Ca⁺² do tipo L no controle da contração cardíaca, usamos o teste de grampeamento de voltagem (técnica de patch-clamp) para testar se a (-)-carvona afetaria a I_Ca,L nos cardiomiócitos dos ventrículos. A Figura 5A mostra registros de I_Ca,L das fases de despolarização (300ms) de -40 a 0mV na situação controle e com 0,5mM de (-)-carvona. A Figura 5B ilustra a progressão da I_Ca,L ao longo do tempo, mostrando redução da I_Ca,L após incubação com (-)-carvona. A média de redução do pico de I_Ca,L induzida pela (-)-carvona foi de 79% (n=4, 10 células, Figura 5C). O efeito de 0,3mM de (-)-carvona sobre a I_Ca,L também foi avaliado, e se observou uma redução de 43% na I_Ca,L (dados não apresentados). Concluímos que a (-)-carvona inibe os canais de Ca⁺² do tipo L, e que esse efeito pode contribuir para seu efeito inotrópico negativo evidenciado nos tecidos dos átrios e ventrículos.

Com base nesses resultados, buscamos avaliar o transiente de cálcio intracelular em cardiomiócitos ventriculares imersos com FUO4-AM. A Figura 5D (esquerda) mostra as imagens obtidas usando microscopia confocal do transiente de cálcio intracelular no controle e após pré-incubação com 0,5mM de (-)-carvona. Observou-se que a fluorescência do cálcio, mostrada em verde, foi reduzida com (-)-carvona. A Figura 5D (à direita) mostra traçados representativos do transiente de cálcio intracelular no controle e com (-)-carvona. A Figura 5E apresenta a fluorescência do cálcio como razão F/F₀, a qual foi reduzida após incubação com (-)-carvona (n=5). O pré-tratamento dos cardiomiócitos com (-)-carvona acelerou o tempo de decaimento em 50% (Figura 5G), enquanto que o tempo para pico do transiente de Ca⁺² (Figura 5F) não foi alterado.

Uma vez que os bloqueadores de canais de cálcio apresentam efeitos antiarrítmicos, decidimos investigar se a (-)carvona apresentaria essa propriedade. O efeito antiarrítmico da (-)-carvona foi avaliado em um modelo de arritmia induzido pela sobrecarga de cálcio. Três tipos de arritmias foram observados nos corações perfundidos com alta concentração de cálcio: BVP, TC e FV (Figura 6A). Como observado na Figura 6B, a (-)-carvona reduziu significativamente o escore de arritmia (n=5). Além disso, nossos resultados mostraram que nos corações submetidos à cálcio elevado e perfusão simultânea com (-)-carvona, a gravidade das arritmias foi menor, uma vez que a ocorrência de FV diminuiu de 34% (cálcio elevado) para 8%. Ainda, os corações perfundidos com (-)-carvona apresentaram principalmente BVP, considerada uma arritmia de menor gravidade.

Discussão

Nossos resultados mostraram a capacidade do monoterpeno (-)-carvona em reduzir a força atrial de corações de ratos de maneira concentração-dependente, o que foi parcialmente reversível após a lavagem. A (-)-carvona mostrou baixa potência em comparação à nifedipina, um clássico bloqueador de canal de C⁺² tipo L. Sabe-se que a força contrátil é dependente da concentração de Ca⁺² citoplasmático livre, e que a entrada de Ca⁺² através de canais de Ca⁺² do tipo L é essencial para estimular a liberação de cálcio induzida pelo cálcio do retículo sarcoplasmático (RS). Esse mecanismo é muito importante por regular a força do miocárdio.

Assim, decidimos investigar se havia uma correlação entre a redução da força atrial e uma diminuição na entrada de Ca⁺² no mecanismo de ação da (-)-carvona. Nossos resultados mostraram que a (-)-carvona reduziu a entrada de Ca⁺² ao prejudicar a resposta inotrópica positiva tanto para Ca⁺² como para Bay K 8644, um agonista dos canais de Ca⁺² do tipo L. O bloqueio do canal de Ca⁺² promovido pela (-)-carvona foi provavelmente o responsável pela diminuição da força atrial observada em nossos experimentos. Em músculos lisos, a carvona apresenta efeito antiespasmódico; ela reduziu a contração induzida por alta concentração de K⁺ e foi quase 100 vezes mais potente que o verapamil, um bloqueador de canal de cálcio.^13,20

A capacidade dos terpenos em bloquear o canal de Ca⁺² foi observada tanto no músculo liso como no músculo cardíaco.²¹ Os monoterpenos podem modular a função dos canais iônicos dependentes de voltagem e dependentes de ligantes.^22,23 Assim, esses compostos são úteis em prevenir doenças cardiovasculares, tais como arritmia e hipertensão. Em relação ao sistema cardiovascular, monoterpenos tais como rotundifolona,²⁴ terpineol,²⁵ timol,²³ e carvacrol²³ atuam como bloqueadores de canal de cálcio. Também foi demonstrado que em cardiomiócito isolado, R(+)-pulegona,¹⁶ geraniol,⁶ nerol,⁷ farnesol⁹ e (-)-mentol²⁶ bloquearam o canal de Ca⁺² do tipo L.

O bloqueio dos canais de Ca⁺² pode induzir alterações eletrofisiológicas importantes, como uma diminuição da condução elétrica no coração e da frequência cardíaca. Assim, nós investigamos se a (-)-carvona poderia induzir alterações fisiológicas no coração. Realizamos experimentos com corações isolados para registrar simultaneamente a PVD e perfis eletrocardiográficos. A (-)-carvona promoveu uma diminuição na PVD, o que corrobora nossos resultados obtidos no átrio esquerdo isolado, discutido anteriormente, bem como uma redução na frequência cardíaca. Como se sabe, a frequência cardíaca é usualmente controlada pelo marcapasso primário do coração, o nó sinusal. As células do nó sinusal têm a propriedade de automaticidade como resultado de despolarização gradual durante a diástole elétrica (despolarização diastólica lenta). Uma lenta despolarização diastólica e a fase da despolarização do potencial de ação do marcapasso são processos fundamentais para a formação de impulso elétrico do nó sinusal. Esses fenômenos estão ligados à entrada de Ca⁺² pelo sarcolema; uma redução no influxo pode induzir a dissociação eletromecânica do miocárdio e bradicardia.²⁷ A corrente iônica provavelmente afetada, e responsável pela diminuição da frequência cardíaca, é a I_Ca,L. O efeito da (-)-carvona sobre o influxo de cálcio promoveu uma redução na frequência cardíaca e um aumento na duração do intervalo PRi, indicativo de bloqueio atrioventricular de primeiro grau. Nesse bloqueio, há um atraso na transmissão de impulso elétrico dos átrios para os ventrículos, aumentando o período refratário do miocárdio. Outras substâncias que promovem esse bloqueio são betabloqueadores, glicosídeos cardíacos, e drogas que aumentam a atividade colinérgica.²⁸

Também foi observado que a (-)-carvona aumentou o intervalo QTc, que reflete o período necessário para a despolarização e a repolarização ventricular ocorrer, i.e., um parâmetro indireto para estimar a duração do potencial de ação ventricular. O prolongamento do QTc pode ocorrer devido ao bloqueio dos canais de potássio.^6,9 Agentes antiarrítmicos da classe III são bloqueadores de canais de potássio que prolongam a duração do potencial de ação aumentando o período refratário dos tecidos atrial, nodal e ventricular. Um aumento no período refratário das células atriais é de grande importância no tratamento de taquiarritmia atrial.²⁹ A amiodarona, um bloqueador de múltiplos canais, é considerada uma das drogas antiarrítmicas mais efetivas, sendo amplamente prescrita. Contudo, o uso desses medicamentos em longo prazo tem sido associado à ocorrência de torsades de pointes³⁰ e de efeitos adversos.²⁹

Em cardiomiócitos ventriculares isolados, 0,5mM de (-)-carvona reduziu a fração de encurtamento e acelerou o tempo de relaxamento, conforme foi também observado no coração isolado. Sabe-se que a força contrátil do músculo cardíaco depende da concentração de Ca⁺² livre no citoplasma, e a entrada de Ca⁺² através de canais de Ca⁺² do tipo L é essencial para a liberação de cálcio dependente de cálcio do RS. Assim, o teste de grampeamento de voltagem foi realizado para testar se a (-)-carvona afeta a I_Ca,L. Os resultados mostraram que a (-)-carvona reduziu significativamente a I_Ca,L no cardiomiócito ventricular. Uma vez que a (-)-carvona reduz a I_Ca,L, é razoável pensar que esse monoterpeno afetaria profundamente a liberação de Ca⁺² do RS. Nossos resultados mostraram que a (-)-carvona também afetou a amplitude do transiente de Ca⁺² e acelerou o tempo de decaimento de 50%. Sabe-se que o relaxamento do músculo cardíaco é amplamente determinado pela recaptação de Ca⁺² pelo retículo sarco(endo)plasmático Ca²⁺-ATPase (SERCA2a) e por outra proteína de transporte tais como os trocadores de Na+/Ca²⁺ (NCX) e membrana plasmática Ca²⁺ ATPase (PMCA).¹⁷ Assim, a diminuição do Ca⁺² citosólico pode estar associada com a ativação de algumas dessas vias.

A nifedipina (10 µM), um bloqueador de canal de cálcio do tipo L, reduziu a amplitude do Ca⁺² transiente em 79% em miócitos do ventrículo de rato neonatos.²⁴ O bloqueio produzido pela nifedipina (1 µM) foi totalmente reversível após o washout com solução padrão.³¹ Nossos resultados indicam que a (-)-carvona é um bloqueador de canal de Ca⁺², similar à nifedipina, mas o efeito sobre a I_Ca,L foi irreversível na presença de (-)-carvona (500 μM). Segundo Vaughan-Williams (1970), os bloqueadores de canal de cálcio pertencem à classe IV de antiarrítmicos, e são amplamente utilizados na prática clínica.^32,33

Uma vez que a (-)-carvona reduz a entrada de cálcio sarcolemal, nós investigamos sua possível atividade antiarrítmica e observamos uma drástica redução ao longo do tempo em eventos como FV em um modelo ex vivo de sobrecarga de cálcio. De fato, nossos resultados mostraram que a (-)-carvona apresentou um bom efeito antiarrítmico, confirmado por uma redução nos escores de arritmia e redução na ocorrência de fibrilação atrial, considerada um tipo mais grave de arritmia. Sabe-se que as substâncias ativas oriundas de plantas podem apresentar propriedades antiarrítmicas importantes,³⁴ com grande potencial para serem usadas como agentes antiarrítmicos em estudos clínicos e pré-clínicos. Podemos citar, por exemplo, os terpenos geraniol, nerol, D-limoneno e farnesol que inibiram canais de Ca⁺² do tipo L e apresentaram atividade antiarrítmica.^6–9 Embora muitos estudos experimentais mostraram que os terpenos exercem efeitos antiarrítmicos, esses compostos não são ainda usados na clínica. Além do efeito antiarrítmico, a (-)-carvona também mostrou um efeito cardioprotetor contra a cardiotoxicidade induzida por doxorrubicina in vivo e potencializou sua toxicidade anticâncer in vitro.¹⁴ Esses efeitos cardioprotetores fazem a carvona uma molécula promissora na prática clínica.

Limitações do estudo

Este estudo revelou que a (-)-carvona reduz a corrente de cálcio do tipo L, induz efeito inotrópico negativo, e tem efeitos antiarrítmicos no coração de ratos. Porém, podemos apontar também algumas limitações, como a falta de avaliação dos efeitos antiarrítmicos da (-)-carvona, em um modelo in vivo de arritmia e outros modelos in vitro que indiretamente geram uma sobrecarga de cálcio. Outra limitação deste estudo foi o fato de não termos avaliado os efeitos da carvona sobre outros canais importantes para a excitação cardíaca, tampouco sua ação sobre a SERCA2a. Ainda, há outras limitações, incluindo implicações toxicológicas do uso agudo e em longo prazo da carvona, sua metabolização e farmacodinâmica.

Conclusão

Podemos concluir que a (-)-carvona diminuiu a corrente de cálcio do tipo L e o transiente de cálcio intracelular no miocárdio, promovendo uma redução na contratilidade atrial e ventricular. Em corações de ratos isolados, a (-)-carvona causou uma diminuição nas taxas cardíacas e aumento em intervalos PR, característica de bloqueadores de canais de cálcio. Ainda, observou-se uma redução significativa da gravidade das arritmias, como fibrilação ventricular em corações submetidos à perfusão com carvona. A (-)-carvona é, portanto, uma substância natural altamente promissora em relação ao desenvolvimento de novas drogas antiarrítmicas.

Agradecimentos

Este estudo recebeu apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e da Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG). JSC (processo #312474/2017-2), DRC (FAPESP processo #2019/21304-4), bolsistas CNPq. DSS é bolsista da FAPESP (#2019/18918-0), JERMF é bolsista do CNPq e JASN é bolsista da CAPES.

Footnotes

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado por CNPq, CAPES, FAPEMIG e FAPESP.

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de tese de Doutorado de Gilmara Beatriz Andrade da Silva pela Universidade Federal de Sergipe.

Referências

1.Cronin EM, Bogun FM, Maury P, Peichl P, Chen M, Namboodiri N, et al. 2019 HRS/EHRA/APHRS/LAHRS Expert Consensus Statement on Catheter Ablation of Ventricular Arrhythmias. Heart Rhythm. 2020;17(1):2-154. doi: 10.1016/j.hrthm.2019.03.002. [DOI] [PMC free article] [PubMed]
2.Fishman GI. Drug-Induced Arrhythmias, Precision Medicine, and Small Data. Circ Arrhythm Electrophysiol. 2017;10(4):e005208. doi: 10.1161/CIRCEP.117.005208. [DOI] [PMC free article] [PubMed]
3.Benchimol A, Desser KB. New Drugs for Treating Cardiac Arrhythmias. Postgrad Med. 1981;69(1):77-84. doi: 10.1080/00325481.1981.11715649. [DOI] [PubMed]
4.Chia KKM, Kanagaratnam L, Hellestrand K, Kowey P, Whalley D. Pharmacological Therapy for Ventricular Arrhythmias: A State-of-the Art Review. Heart Lung Circ. 2019;28(1):49-56. doi: 10.1016/j.hlc.2018.10.002. [DOI] [PubMed]
5.Ganjehei L, Massumi A, Nazeri A, Razavi M. Pharmacologic Management of Arrhythmias. Tex Heart Inst J. 2011;38(4):344-9. [PMC free article] [PubMed]
6.Menezes-Filho JE, Gondim AN, Cruz JS, Souza AA, Santos JN, Conde-Garcia EA, et al. Geraniol Blocks Calcium and Potassium Channels in the Mammalian Myocardium: Useful Effects to Treat Arrhythmias. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2014;115(6):534-44. doi: 10.1111/bcpt.12274. [DOI] [PubMed]
7.Menezes-Filho JER, Souza DS, Santos-Miranda A, Cabral VM, Santos JNA, Cruz JDS, et al. Nerol Attenuates Ouabain-Induced Arrhythmias. Evid Based Complement Alternat Med. 2019;2019:5935921. doi: 10.1155/2019/5935921. [DOI] [PMC free article] [PubMed]
8.Nascimento GAD, Souza DS, Lima BS, Vasconcelos CML, Araújo AAS, Durço AO, et al. Bradycardic and Antiarrhythmic Effects of the D-Limonene in Rats. Arq Bras Cardiol. 2019;113(5):925-32. doi: 10.5935/abc.20190173. [DOI] [PMC free article] [PubMed]
9.Souza DS, Menezes-Filho JER, Santos-Miranda A, Jesus ICG, Silva Neto JA, Guatimosim S, et al. Calcium Overload-induced Arrhythmia is Suppressed by Farnesol in Rat Heart. Eur J Pharmacol. 2019;859:172488. doi: 10.1016/j.ejphar.2019.172488. [DOI] [PubMed]
10.Elmastaş M, Dermirtas I, Isildak O, Aboul‐Enein HY. Antioxidant Activity of S‐Carvone Isolated from Spearmint (Mentha Spicata L. Fam Lamiaceae). J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 2006;29(10):1465-75. doi: 10.1080/10826070600674893
11.Moro, I. J. et al. Evaluation of antimicrobial, cytotoxic and chemopreventive activities of carvone and its derivatives. Braz. J. Pharm. Sci. 2017;539(4): e00076. doi: 10.1590/s2175-97902017000400076.
12.Nogoceke FP, Barcaro IM, Sousa DP, Andreatini R. Antimanic-like Effects of (R)-(-)-carvone and (S)-(+)-carvone in Mice. Neurosci Lett. 2016;619:43-8. doi: 10.1016/j.neulet.2016.03.013. [DOI] [PubMed]
13.Souza FV, Rocha MB, Souza DP, Marçal RM. (-)-Carvone: Antispasmodic Effect and Mode of Action. Fitoterapia. 2013;85:20-4. doi: 10.1016/j.fitote.2012.10.012. [DOI] [PubMed]
14.Abbas MM, Kandil Yİ, Abbas MA. R-(-)-carvone Attenuated Doxorubicin Induced Cardiotoxicity In Vivo and Potentiated Its Anticancer Toxicity In Vitro. Balkan Med J. 2020;37(2):98-103. doi: 10.4274/balkanmedj.galenos.2019.2019.7.117. [DOI] [PMC free article] [PubMed]
15.Curtis MJ, Alexander S, Cirino G, Docherty JR, George CH, Giembycz MA, et al. Experimental Design and Analysis and their Reporting II: Updated and Simplified Guidance for Authors and Peer Reviewers. Br J Pharmacol. 2018;175(7):987-93. doi: 10.1111/bph.14153. [DOI] [PMC free article] [PubMed]
16.Cerqueira SV, Gondim AN, Roman-Campos D, Cruz JS, Passos AG, Lauton-Santos S, et al. R(+)-pulegone Impairs Ca²+ homeostasis and Causes Negative Inotropism in Mammalian Myocardium. Eur J Pharmacol. 2011;672(1-3):135-42. doi: 10.1016/j.ejphar.2011.09.186. [DOI] [PubMed]
17.Shioya T. A Simple Technique for Isolating Healthy Heart Cells from Mouse Models. J Physiol Sci. 2007;57(6):327-35. doi: 10.2170/physiolsci.RP010107. [DOI] [PubMed]
18.Zhou P, Zhang SM, Wang QL, Wu Q, Chen M, Pei JM. Anti-arrhythmic Effect of Verapamil is Accompanied by Preservation of cx43 Protein in Rat Heart. PLoS One. 2013;8(8):e71567. doi: 10.1371/journal.pone.0071567. [DOI] [PMC free article] [PubMed]
19.Curtis MJ, Walker MJ. Quantification of Arrhythmias Using Scoring Systems: an Examination of Seven Scores in an In Vivo Model of Regional Myocardial Ischaemia. Cardiovasc Res. 1988;22(9):656-65. doi: 10.1093/cvr/22.9.656. [DOI] [PubMed]
20.Bers DM. Cardiac Excitation-contraction Coupling. Nature. 2002;415(6868):198-205. doi: 10.1038/415198a. [DOI] [PubMed]
21.Silva-Filho JC, Oliveira NN, Arcanjo DD, Quintans-Júnior LJ, Cavalcanti SC, Santos MR, et al. Investigation of Mechanisms Involved in (-)-borneol-induced Vasorelaxant Response on Rat Thoracic Aorta. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2012;110(2):171-7. doi: 10.1111/j.1742-7843.2011.00784.x. [DOI] [PubMed]
22.Oz M, El Nebrisi EG, Yang KS, Howarth FC, Al Kury LT. Cellular and Molecular Targets of Menthol Actions. Front Pharmacol. 2017;8:472. doi: 10.3389/fphar.2017.00472. [DOI] [PMC free article] [PubMed]
23.Peixoto-Neves D, Silva-Alves KS, Gomes MD, Lima FC, Lahlou S, Magalhães PJ, et al. Vasorelaxant Effects of the Monoterpenic Phenol Isomers, Carvacrol and Thymol, on Rat Isolated Aorta. Fundam Clin Pharmacol. 2010;24(3):341-50. doi: 10.1111/j.1472-8206.2009.00768.x. [DOI] [PubMed]
24.Guedes DN, Silva DF, Barbosa-Filho JM, Medeiros IA. Calcium Antagonism and the Vasorelaxation of the Rat Aorta Induced by Rotundifolone. Braz J Med Biol Res. 2004;37(12):1881-7. doi: 10.1590/s0100-879x2004001200014. [DOI] [PubMed]
25.Khaleel C, Tabanca N, Buchbauer G. α-Terpineol, a Natural Monoterpene: A Review of its Biological Properties. Open Chem. 2018;16(1):349–61. doi: 10.1515/chem-2018-0040.
26.Baylie RL, Cheng H, Langton PD, James AF. Inhibition of the Cardiac L-type Calcium Channel Current by the TRPM8 Agonist, (-)-menthol. J Physiol Pharmacol. 2010;61(5):543-50. [PubMed]
27.Lipsius SL, Hüser J, Blatter LA. Intracellular Ca2+ Release Sparks Atrial Pacemaker Activity. News Physiol Sci. 2001;16:101-6. doi: 10.1152/physiologyonline.2001.16.3.101. [DOI] [PubMed]
28.Zhou Q, Xiao J, Jiang D, Wang R, Vembaiyan K, Wang A, et al. Carvedilol and its New Analogs Suppress Arrhythmogenic Store Overload-induced Ca2+ Release. Nat Med. 2011;17(8):1003-9. doi: 10.1038/nm.2406. [DOI] [PMC free article] [PubMed]
29.Mehraein, F. A Review on Amiodarone as an Antiarrhythmic Drug. Abnorm. Heart Rhythms. 2015; 96:1593-600. doi: 10.1136/hrt.2008.152652.
30.Tisdale JE. Drug-induced QT Interval Prolongation and Torsades de Pointes: Role of the Pharmacist in Risk Assessment, Prevention and Management. Can Pharm J (Ott). 2016;149(3):139-52. doi: 10.1177/1715163516641136. [DOI] [PMC free article] [PubMed]
31.Wang F, Koide M, Wellman GC. Nifedipine Inhibition of High-Voltage Activated Calcium Channel Currents in Cerebral Artery Myocytes Is Influenced by Extracellular Divalent Cations. Front Physiol. 2017;8:210. doi: 10.3389/fphys.2017.00210. [DOI] [PMC free article] [PubMed]
32.Gao H, Wang F, Wang W, Makarewich CA, Zhang H, Kubo H, et al. Ca(2+) Influx through L-type Ca(2+) Channels and Transient Receptor Potential Channels Activates Pathological Hypertrophy Signaling. J Mol Cell Cardiol. 2012;53(5):657-67. doi: 10.1016/j.yjmcc.2012.08.005. [DOI] [PMC free article] [PubMed]
33.Williams EMV. A Classification of Antiarrhythmic Actions Reassessed After a Decade of New Drugs. J Clin Pharmacol. 1984;24(4):129-47. doi: 10.1002/j.1552-4604.1984.tb01822.x. [DOI] [PubMed]
34.Bryzgalov AO, Tolstikova TG, Shults EE, Petrova KO. Natural Products as a Source of Antiarrhythmic Drugs. Mini Rev Med Chem. 2018;18(4):345-62. doi: 10.2174/1389557516666161104144815. [DOI] [PubMed]

Arq Bras Cardiol. 2022 Jul 29;119(2):294–304. [Article in English]

(-)-Carvone Modulates Intracellular Calcium Signaling with Antiarrhythmic Action in Rat Hearts

Abstract

Background:

(-)-Carvone is a monoterpene found in essential oils with antioxidant and anti-inflammatory activity.

Objective:

The aim of this paper was to analyze the antiarrhythmic property of (-)-carvone in the rat heart and its effects on the intracellular Ca²⁺ signaling.

Methods:

The effects of (-)-carvone were evaluated on the ventricular (0.5 mM) and atrial contractility (0.01 – 4 mM) and on electrocardiogram (0.5 mM). Fractional shortening, L-type calcium current (I_Ca,L) and Ca²⁺ signaling were measured in the isolated cardiomyocyte (0.5 mM). Antiarrhythmic effect was evaluated in arrhythmia model induced by calcium overload (0.5 mM) (n = 5). P < 0.05 was used as the significance level.

Results:

In the atrium, (-)-carvone evoked negative inotropism that was concentration-dependent (EC50 0.44 ± 0.11 mM) and decreased the positive inotropism evoked by CaCl₂ (0.1 to 8.0 mM) or BAY K8644 (5 to 500 nM), an agonist of L-type Ca²⁺ channel. In isolated heart, (-)-carvone (0.5 mM) promoted reduction of ventricular contractility (73%) and heart rate (46%), increased PRi (30.7%, time from the onset of the P wave until the R wave) and QTc (9.2%, a measure of the depolarization and repolarization of the ventricles) without changing the QRS complex duration. (-)-Carvone decreased the fractional shortening (61%), I_Ca,L (79%) and Ca²⁺ intracellular transient (38%). Furthermore, (-)-carvone showed antiarrhythmic action, verified by decrease of the arrhythmia score (85%) and occurrence of ventricular fibrillation.

Conclusion:

(-)-Carvone decreases Ca²⁺ entry through L-type Ca²⁺ channels, reducing the cardiac contractility and intracellular Ca²⁺, and, therefore, presenting promising antiarrhythmic activity in the rat hearts.

Keywords: Arrhythmias, Cardiac, Monoterpenes, Rats

Introduction

Arrhythmias are considered a serious public health problem and are an important cause of morbidity and mortality in the world.¹ Among the main cardiac arrhythmias, ventricular premature beats (VPB), sustained ventricular tachycardia and fibrillation are common in patients with ischemic and nonischemic cardiomyopathy.¹ However, treatments with antiarrhythmic drugs often cause pro-arrhythmic adverse responses or no improvement in the quality of life of people affected by arrhythmias.²

Since 1970, when Vaughan-Williams classified the antiarrhythmic drugs based on their pharmacological mechanisms to block specific ion channels or receptors, researchers have invested a great deal of time and effort to discover new therapies with a lower risk of adverse effects for the patient.^3–5

Among the new therapies, compounds of natural origin have demonstrated their capacity to inhibit ventricular cardiac arrhythmias generating interest in the scientific community. Terpenes have been shown to be the main compounds with proven antiarrhythmic activity.^6–9 Among these terpenes, one of particular interest is carvone (p-mentha-6,8-dien-2-one) because of its already established properties. Carvone is a monoterpene ketone known for its antioxidant, antimicrobial and antifungal activity.^10,11 It has also been reported to have a blocking effect on voltage-gated sodium channels in neurons, leading to an anticonvulsant effect.^12,13 Furthermore, carvone has also shown an antispasmodic effect through voltage-dependent calcium channel inhibition, and synergistic anticancer action with doxorubicin on the MCF 7 cell line while decreasing its cardiotoxicity.¹⁴ As has already been described in the literature, carvone blocks sodium and calcium channels, and drugs of this class have antiarrhythmic and cardioprotective properties. Therefore, we decided to study the effects or carvone on the cellular calcium handling and its possible antiarrhythmic action in rat hearts.⁹

Although there are several studies about (-)-carvone in the scientific literature, there are, to the best of our knowledge, no explanations or hypotheses on the mechanism of action of this monoterpene in the cardiac muscle. Therefore, our objective was to assess the possible cardiac effects of (-)-carvone, and to provide a better scientific understanding of its action in cardiac tissue that might serve as basis for the development of new drugs of natural origin for the treatment of arrhythmias.

Material and Methods

Animals

The experiments were performed using male Wistar rats (250-300 g) obtained from the animal care facility of the Federal University of Sergipe (UFS). In each experimental procedure, five animals were used.¹⁵ This research was approved by the Ethics Committee on Animal Research of the UFS (protocol 61/16, February 20^th 2017). Animal handling was in compliance with the Principles of Laboratory Animal Care (NIH publication 86-23, revised 1985; http://oacu.od.nih.gov/regs/index.htm).

Evaluation of inotropic effect of (-)-carvone

The inotropic effect of (-)-carvone was evaluated in the left atrium of rat hearts immersed in an organ bath containing Krebs-Henseleit solution comprising (in mM): NaCl 120, KCl 5.4, MgCl₂ 1.2, NaHCO₃ 27, CaCl₂ 1.25, Glucose 10, NaH₂PO₄ 2.0 (pH 7.4). The atrium was maintained at 29° ± 0.1°C, oxygenated (95% O₂ and 5% CO₂), stretched to 5 mN and submitted to field stimulation (1 Hz, 100 V, 0.5 ms) (Stimulator SD9 GRASS). Atrial force was recorded using an isometric force transducer (GRASS FT03), and the signals digitalized (DATAQ DI710, WINDAQ PRO Acquisition). The concentration-response curves of (-)-carvone (0.001 to 4.0 mM) and nifedipine (0.03 to 100 µM, Ca²⁺ channel blocker) were obtained to determine contractile response and calculate the EC₅₀. Dimethyl sulfoxide (DMSO) at 0.5% was used as the diluent for (-)-carvone.

Effects of (-)-carvone on Ca²⁺ influx in the atrial myocardium

To analyze the effect of (-)-carvone on the Ca²⁺ influx, the concentration-response curves of CaCl₂ (0.1 to 8.0 mM) and (±)-Bay K8644 (5 to 500 nM) in the left atrium in the control and after pre-incubation with (-)-carvone (1 mM) for 15 min were obtained. The results were expressed as percentages of the maximum atrial contractile response to CaCl₂ in the control. In both protocols, the initial concentration of CaCl₂ in the K-H solution was 0.5 mM.^7,16

Effects of (-)-carvone on the electrocardiographic profile and left ventricular developed pressure (LVDP)

After intraperitoneal administration of heparin in rats (1000 IU) for 15 minutes, the hearts were removed and mounted on a constant-flow (10 mL/min) aortic perfusion system. The heart was perfused with previously filtered K-H solution (0.45 µm), oxygenated (95% O₂ + 5% CO₂) and maintained at 34 ± 0.1°C (Haake F3). To record the electrocardiogram (ECG), three electrodes (Ag/AgCl/NaCl 1 M) were placed on the heart to sense electrical signals. The signals were amplified and digitalized (PowerLab 4/35 ADInstrument, USA). LVDP was measured using a water-filled balloon (15 cm/Hg) introduced into the cavity of the left ventricle. This device was coupled to a pressure transducer (MLT0699/A). The signals were amplified (Bridge Amp FE221 ADInstrument, USA) and sent to an AD converter (PowerLab 4/35 26 ADInstrument, USA). The system was calibrated using a column of mercury. Contractile parameters (LVDP, time to peak and relaxation time) were evaluated in 30 consecutive beats using LabChart 8.0 Pro Software (ADInstruments, USA) in control situation and after 5, 10 and 15 minutes from the start of carvone perfusion (0.5 mM). The ECG measured the PR interval (PRi - the period that extends from the beginning of the P wave until the R wave), QRS complex duration (QRS - the period that extends from the Q wave until the S wave), and the QT interval (QTi - the period that extends from the beginning of the Q until the end of the T wave). QTi was converted to QTc using the Bazett’s formula normalized for rodents (QTc-B = QTi/RR/f), f is the average duration of RR interval in control (f = 271 ms).

Effects of (-)-carvone on the fractional shortening

Left and right ventricular cardiomyocytes were isolated from rats according to the protocol of Shioya (2007),¹⁷ with some modifications. Shortening fraction was assessed by measuring the change in cell length using an inverted microscope coupled to an edge detection system (Ionoptix, USA). The cardiomyocytes were placed in an experimental chamber (room temperature) containing Tyrode solution (in mM: NaCl 150, KCl 5.4, MgCl₂ 0.5, HEPES 10, Glucose 10, CaCl₂ 1.8, pH 7.4). The cardiomyocytes were visualized using a camera (Ionoptix Myocam at 240 Hz) coupled to a microscope and an image detection program (Ionoptix Ionwizard 6.3) was used. Cells were submitted to an electrical field (1 Hz, 100 V, 4 ms) using a pair of platinum electrodes. The longitudinal changes in the borders of the cardiomyocytes were captured by the edge detection system and the generated data were stored and analyzed. The fractional shortening was evaluated in control cells and after incubation with 0.5 mM (-)-carvone.

Effects of (-)-carvone on the L-type calcium current (I_Ca,L)

Whole-cell voltage-clamp recordings were obtained using an EPC 10.2 (HEK Elektronik, Germany). In whole-cell configuration, 3-5 min was waited to establishment of an ionic equilibrium between the pipette solution and intracellular environment. The recording electrodes had tip resistances of 2-3 MΩ. Ventricular cardiomyocytes with series resistance above 8 MΩ were discarded. The composition of internal solution was (in mM): 120 CsCl, 20 TEACl, 5 NaCl, 10 HEPES and 10 EGTA, 1 MgCl₂ (pH was set to 7.2 using CsOH) and external solution was (in mM): 150 TEACl, 0.5 MgCl₂, 1.8 CaCl₂, 10 HEPES and 11 glucose (pH 7.4 set using TEAOH). To evaluate the acute effects of 0.3 and 0.5 mM (-)-carvone on I_Ca,L, a time course of I_Ca,L peak current was recorded in absence and after exposure to a given concentration of (-)-carvone. Pre-pulses from a holding potential of −80 mV to −40 mV for 50 ms was applied to inactivate any remnant Na⁺ or T-type Ca²⁺ channels. Then, a test pulse to 0 mV was applied during 300 ms to measure I_Ca,L.

Effects of (-)-carvone on the intracellular global Ca²⁺ transient

Left and right ventricular cardiomyocytes were loaded with 10 M of FLUO4-AM (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) diluted in DMSO for 30 min. To remove the excess dye the cells were washed with Tyrode solution (1.8 mM Ca²⁺). A confocal system (LSM 510 Meta, Zeiss GmbH, Jena, Germany) with a 63x oil immersion objective was used for confocal fluorescence imaging. FLUO4-AM was excited at 488 nm (Argon laser) and the emission intensity was measured at 510 nm. Cardiomyocytes were scanned with a 512-pixel line that was positioned along the longitudinal axis of the cell, every 1.54 ms. Digital image processing was performed using IDL programming language (Research Systems, Boulder, CO, USA).⁹ The intracellular Ca²⁺ levels were reported as F/F₀, where F₀ is the resting fluorescence. Intracellular global Ca²⁺ transient was recorded in the control and after three minutes of incubation with 0.5 mM (-)-carvone in room temperature.

Effects antiarrhythmic of (-)-carvone

Ex vivo arrhythmia was determined in isolated hearts as previously described.¹⁸ Initially, the hearts were perfused with K-H solution containing 1.25 mM of calcium (control group). After 20 min, the hearts were perfused with K-H solution containing 3.3 mM of calcium (high calcium group) or with high calcium + 0.5 mM (-)-carvone during 15 min (high calcium group + carvone). The ECG was monitored for 15 min to evaluate the occurrence of arrhythmias. The arrhythmias observed were VPB, ventricular tachycardia (VT) and ventricular fibrillation (VF). The 15 minutes of the experiment was divided into three-minute intervals and the arrhythmia scores were added at the end as described by Curtis and Walker (1988).^9,19 Episodes of VPB < 10 events/3 min were classifed as score 0 and > 10 events/3 min scored 1; 1-5 episodes of VT < 40 s were 2 and > 5 episodes of VT or 1 episode of VF with duration < 40 s were scored 3; 2 - 5 episodes of VT or VF with duration < 80 s were scored 4; > 5 episodes of VF, VT and/or VF with duration < 160 s was scored as 5; VT and/or VF with duration < 300 s was scored as 6 and > 300 s scored as 5.

Statistical analysis

All results are shown as the means ± standard deviation of mean (S.D). GraphPad Prism v.5.0 (GraphPad Software, CA, USA) was used for the statistical analyses. Data were tested for normality using the Shapiro-Wilk test. Mean values were compared using the one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey’s post hoc test or unpaired t-test. P < 0.05 was used as the significance level.

Results

(-)-Carvone (0.003 to 4 mM) decreased the atrial force in a concentration-dependent manner. Figure 1A shows tracing of curves of isolated atrial contraction in the control situation and with 0.3, 2 and 4 mM of (-)-carvone and washout. As can be seen, 4 mM of (-)-carvone decreased myocardial contractility by approximately 96% and the reversibility after washout was of approximately 65%. Figure 1B shows a concentration-response curve of the negative inotropic effect of (-)-carvone that presented EC₅₀ of 0.44 ± 0.11 mM (n = 5). Nifedipine, used as positive control, presented EC₅₀ values of 0.0034 ± 0.0011 mM (n = 5). DMSO at 0.5%, used as a diluent, had no effect on atrial force (data not shown).

As (-)-carvone evoked a negative inotropic effect, we decided to investigate the involvement of calcium channel in its action mechanism. The results revealed that (-)-carvone (1 mM), shifted the concentration-response curve of CaCl₂ to the right, increasing the EC₅₀ of CaCl₂ from 1.46 ± 0.14 mM (control) to 3.17 ± 0.22 mM (CaCl₂ + carvone) (Fig. 1C, n = 5, p < 0.05). Interestingly, (-)-carvone impaired the positive inotropism induced by (±)-BAY K8644, an agonist of the L-type calcium channel (Figure 1D).

In the isolated hearts, 0.5 mM (-)-carvone also induced reduction in LVDP, as can be seen in the representative traces shown in Figure 2A (n = 5). A 73% reduction in LVDP was observed after 15 minutes of heart perfusion with 0.5 mM of (-)-carvone (Figure 2B). (-)-Carvone did not change the time to peak (Figure 2C) but it did significantly reduce the relaxation time (24%) after 15 min of (-)-carvone perfusion (Figure 2D).

Figure 3A shows representative ECG tracings in the control situation, after 15 min perfusion with 0.5 mM of (-)-carvone and washout. As can be seen, (-)-carvone decreased heart rate (n = 5, Figure 3B) and increased PRi and QTi (n = 5, Figures 3C and D), without changing the duration of QRS complex (Figure 3E).

Figure 4A shows representative records of the cellular contractility in the control situation (top panel) and after perfusion with 0.5 mM of (-)-carvone (bottom panel), showing the reduction in fractional shortening in cardiomyocytes. The average results showed reduction of the fractional shortening after incubation with (-)-carvone (n = 5, Figure 4B). Furthermore, (-)-carvone decreased both time to peak and time to 50% relaxation (Figures 4C and D).

Considering the major role of L-type Ca²⁺ channels in the control of the cardiac contraction, we used whole-cell patch-clamp to test whether (-)-carvone affects I_Ca,L in ventricular cardiomyocytes. Figure 5A shows I_Ca,L recordings of 300-ms depolarizing steps from −40 to 0 mV in the control situation and with 0.5 mM (-)-carvone. Figure 5B ilustrates the time course of I_Ca,L showing reduction of I_Ca,L after (-)-carvone incubation. The average decrease of peak I_Ca,L induced by (-)-carvone was 79% (n = 4, 10 cells, Fig. 5C). The effect of 0.3 mM of (-)-carvone on the I_Ca,L was also evaluated, and a 43% reduction in the I_Ca,L was observed (data not shown). We concluded that (-)-carvone inhibits L-type Ca²⁺ channels and that this effect may contribute to its negative inotropic effect evidenced in atrial and ventricle tissues.

In view of these results, we sought to evaluate the intracellular calcium transient in ventricular cardiomyocyte loaded with FUO4-AM. Figure 5D (left) shows the images obtained using confocal microscopy of the intracellular calcium transient in the control and after pre-incubation with 0.5 mM of (-)-carvone. It was noted that the fluorescence of calcium, shown in green, was reduced with (-)-carvone. Figure 5D (right) shows representative tracings of the intracellular calcium transient in the control and with (-)-carvone. Figure 5E shows calcium fluorescence as the F/F₀ ratio, which was reduced after incubation with (-)-carvone (n = 5). (-)-Carvone pretreatment of cardiomyocytes accelerated the time to 50% decay (Figure 5G), whereas the time to peak Ca²⁺ transient (Fig. 5F) remained unchanged.

Since calcium channel blocking drugs present antiarrhythmic effects, we decided to investigate whether (-)-carvone could present this property. The antiarrhythmic effect of (-)-carvone was evaluated in an arrhythmia model induced by calcium overload. Three types of arrhythmias were observed in hearts perfused with high calcium: VPB, VT, e VF (Figure 6A). As can be seen in Figure 6B, (-)-carvone significantly decreased the arrhythmia score (n = 5). In addition, our results showed that in hearts subjected to high calcium with simultaneous perfusion of (-)-carvone the severity of arrhythmias was lower, as the occurrence of VF decreased from 34% (high calcium) to 8%. Furthermore, the hearts perfused with (-)-carvone had mostly VPB (52%), considered an arrhythmia of lesser severity.

Discussion

Our results showed the ability of monoterpene (-)-carvone to reduce the atrial force of rat hearts in a concentration-dependent manner that was partially reversible after washing. (-)-Carvone showed low potency when compared to nifedipine, a classic L-type Ca²⁺ channel blocker. It is known that contractile force is dependent on free cytoplasmic Ca²⁺ concentration and that Ca²⁺ influx through L-type Ca²⁺ channels is essential to trigger the calcium-induced calcium release from the sarcoplasmic reticulum (SR).²⁰ This mechanism is very important because it regulates myocardial force.

Thus, we decided to investigate whether there was a correlation between atrial force reduction and a decrease in Ca²⁺ entry in the action mechanism of (-)-carvone. Our results showed that (-)-carvone reduced Ca²⁺ influx in the atria by impairing the positive inotropic response to both Ca²⁺ and (-)-Bay K 8644, an agonist of L-type Ca²⁺ channels. The blockade of Ca²⁺ channel promoted by (-)-carvone was probably responsible for the decreased atrial force observed in our experiments. In smooth muscles, carvone presents antispasmodic effect; it reduced the contraction induced by high K⁺ and was almost 100 times more potent than verapamil, a calcium channel blocker.¹³

The ability of terpenes to block the Ca²⁺ channel has been observed both in smooth muscle and cardiac muscle.²¹ Monoterpenes can modulate the function of voltage-dependent and ligand-dependent ion channels.^22,23 Therefore, they are useful in preventing cardiovascular diseases such as arrhythmia and hypertension. With respect to the cardiovascular system, several studies have reported that monoterpenes such as rotundifolone,²⁴ terpineol,²⁵ timol,²³ and carvacrol²³ act as blockers of calcium channel. It has also been shown that in isolated cardiomyocyte, R(+)-pulegone,¹⁶ geraniol,⁶ nerol,⁷ farnesol ⁹ and (-)-menthol²⁶ blocked the L-type Ca²⁺ channel.

Blockage of Ca²⁺ channels can induce important electrophysiological changes, such as a decrease in electrical conduction in the heart and heart rate. Therefore, we investigated whether (-)-carvone could induce physiological changes in the heart. Experiments using isolated hearts were performed to simultaneously record LVDP and ECG profiles. (-)-Carvone promoted a decrease in LVDP, which corroborates our findings in the isolated left atrium, as discussed earlier, and also induced a reduction in heart rate. As is known, heart rate is usually controlled by the heart’s primary pacemaker, the sinus node. Sinus node cells display the property of automaticity as a result of gradual depolarization during electrical diastole (slow diastolic depolarization). The slow diastolic depolarization and the phase of depolarization of the pacemaker action potential are essential processes for the formation of the electrical impulse of the sinus node. These phenomena are linked to Ca²⁺ influx by the sarcolemma; a decreased influx can induce electromechanical decoupling of the myocardium and bradycardia.²⁷ The ionic current that was probably affected, and was responsible for decreasing heart rate, may be the I_Ca,L. The effect of (-)-carvone on calcium influx promoted a reduction in heart rate and an increase in the duration of the PRi interval, indicative of first-degree atrioventricular block. In this blockage, there is a delay in the transmission of electrical impulse from the atria to the ventricles, increasing the refractory period of myocardium. Other substances that promote this blockage are β-blockers, cardiac glycosides, and drugs that increase cholinergic activity.²⁸

It was observed that (-)-carvone also increased the QTc interval, which reflects the period necessary for depolarization and ventricular repolarization to occur, i.e., an indirect parameter to estimate the ventricular action potential duration. QTc prolongation may be due to the blockage of potassium channels.^6,9 Class III antiarrhythmic agents are potassium channel blockers that prolong the duration of the action potential increasing the refractory period of atrial, nodal and ventricular tissues. An increase in the refractory period of the atrial cells is of great importance in the treatment of atrial tachyarrhythmia.²⁹ Amiodarone, a multiple-channel blocker, is considered one of the most effective antiarrhythmic drugs, and is widely prescribed. However, long-term use of antiarrhythmic drugs has been reported to cause torsades de pointes³⁰ and adverse effects.²⁹

In isolated ventricular cardiomyocytes, 0.5 mM of (-)-carvone reduced the shortening fraction and accelerated the relaxation time, as was also observed in the isolated heart. It is known that the contractile force of the heart muscle depends on the free cytoplasmic Ca²⁺ concentration, and Ca²⁺ influx through L-type Ca²⁺ channels is essential to trigger calcium-induced calcium release from the SR. Then, whole-cell patch-clamp was performed to test whether (-)-carvone affects I_Ca,L. The results showed that (-)-carvone significantly reduced the I_Ca,L in ventricular cardiomyocyte. As (-)-carvone reduces I_Ca,L, it is reasonable to think that this monoterpene would profoundly affect the Ca²⁺ release from the SR. Our results showed that (-)-carvone also affected the Ca²⁺ transient amplitude and accelerated the time to 50% decay. It is known that the cardiac muscle relaxation is largely determined by reuptake of Ca²⁺ into the SR by sarco(endo)plasmic reticulum Ca²⁺ ATPase (SERCA2a) and by another transport protein such as Na⁺/Ca²⁺ exchanger (NCX) and plasma membrane Ca²⁺ ATPase (PMCA).¹⁷ Then, the decrease of the cytosolic Ca²⁺ may be associated with the activation of some of these pathways.

Nifedipine (10 µM), a L-type calcium channel blocker, reduced the amplitude of the Ca²⁺ transient by 79% in neonatal rat ventricular myocytes.²⁴ The blockade produced by nifedipine (1 μM) was totally reversible after washout with standard solution.³¹ Our results indicate that (-)-carvone is a Ca²⁺ channel blocker, similar to nifedipine, but the effect on the I_Ca,L was irreversible in the presence of 500 μM (-)-carvone. According to Vaughan-Williams (1970), calcium channel blockers belong to class IV of the antiarrhythmics, and are widely used in clinical medicine.^32,33

As (-)-carvone reduced sarcolemal Ca²⁺ influx, we investigated their possible antiarrhythmic activity and observed a drastic reduction over time in events such as VF in an ex vivo model of calcium overload. Indeed, our results showed that (-)-carvone had a good antiarrhythmic effect, confirmed by decreased arrhythmia scores and reduction in the occurrence of ventricular fibrillation, considered a more severe type of arrhythmia. It is already known that active substances from plant material can have significant antiarrhythmic properties,³⁴ with great potential to be used as antiarrhythmics in preclinical and clinical studies. We can cite as example the terpenes geraniol, nerol, D-limonene and farnesol that have been shown to inhibit L-type Ca²⁺ channels and present antiarrhythmic activity.^6–9 Although many experimental studies have shown that terpenes exert antiarrhythmic effects, these compounds are not yet used in the clinic. In addition to the antiarrhythmic effect, (-)-carvone also had a cardioprotective effect against doxorubicin-induced cardiotoxicity in vivo and potentiated its anticancer toxicity in vitro.¹⁴ These cardioprotective effects of carvone make it a promising molecule for use in clinical practice.

Study limitation

This study revealed that (-)-carvone reduces L-type calcium current, induces negative inotropic effect, and has antiarrhythmic effects in rat hearts. But we also can point some limitations, as the lack of evaluation of antiarrhythmic effects of (-)-carvone in an in vivo model of arrhythmia and other in vitro models that indirectly generate calcium overload. Another limitation of this study is that we did not assess the effects of carvone on other important channels for cardiac excitation, nor evaluate its action on the SERCA2a. Furthermore, there are other limitations, including toxicological implications of the acute and long-term use of carvone, its metabolization, and pharmacodynamics.

Conclusion

We can conclude that (-)-carvone decreased L-type calcium current and intracellular calcium transient in the myocardium, promoting a reduction in atrial and ventricular contractility. In isolated rat hearts, (-)-carvone caused a decrease in heart rates and increase in PR intervals, typical of calcium channel blockers. In addition, a significant reduction in the severity of arrhythmias such as ventricular fibrillation in hearts submitted to (-)-carvone perfusion was observed. (-)-Carvone is, therefore, a highly promising natural substance in respect of the development of new antiarrhythmic drugs.

Acknowledgments

This study was supported by the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) and Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG). JSC (Grants #312474/2017-2), DRC (FAPESP grant #2019/21304-4), CNPq research fellows. DSS hold a fellowship from FAPESP (#2019/18918-0), JERMF is a recipient os a CNPq scholarship and JASN is a recipient of a CAPES scholarship.

Footnotes

Sources of Funding

This study was funded by CNPq, CAPES, FAPEMIG e FAPESP.

Study Association

This article is part of the thesis of doctoral submitted by Gilmara Beatriz Andrade da Silva, from Universidade Federal de Sergipe.

[B1] 1.Cronin EM, Bogun FM, Maury P, Peichl P, Chen M, Namboodiri N, et al. 2019 HRS/EHRA/APHRS/LAHRS Expert Consensus Statement on Catheter Ablation of Ventricular Arrhythmias. Heart Rhythm. 2020;17(1):2-154. doi: 10.1016/j.hrthm.2019.03.002. [DOI] [PMC free article] [PubMed]

[B2] 2.Fishman GI. Drug-Induced Arrhythmias, Precision Medicine, and Small Data. Circ Arrhythm Electrophysiol. 2017;10(4):e005208. doi: 10.1161/CIRCEP.117.005208. [DOI] [PMC free article] [PubMed]

[B3] 3.Benchimol A, Desser KB. New Drugs for Treating Cardiac Arrhythmias. Postgrad Med. 1981;69(1):77-84. doi: 10.1080/00325481.1981.11715649. [DOI] [PubMed]

[B4] 4.Chia KKM, Kanagaratnam L, Hellestrand K, Kowey P, Whalley D. Pharmacological Therapy for Ventricular Arrhythmias: A State-of-the Art Review. Heart Lung Circ. 2019;28(1):49-56. doi: 10.1016/j.hlc.2018.10.002. [DOI] [PubMed]

[B5] 5.Ganjehei L, Massumi A, Nazeri A, Razavi M. Pharmacologic Management of Arrhythmias. Tex Heart Inst J. 2011;38(4):344-9. [PMC free article] [PubMed]

[B6] 6.Menezes-Filho JE, Gondim AN, Cruz JS, Souza AA, Santos JN, Conde-Garcia EA, et al. Geraniol Blocks Calcium and Potassium Channels in the Mammalian Myocardium: Useful Effects to Treat Arrhythmias. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2014;115(6):534-44. doi: 10.1111/bcpt.12274. [DOI] [PubMed]

[B7] 7.Menezes-Filho JER, Souza DS, Santos-Miranda A, Cabral VM, Santos JNA, Cruz JDS, et al. Nerol Attenuates Ouabain-Induced Arrhythmias. Evid Based Complement Alternat Med. 2019;2019:5935921. doi: 10.1155/2019/5935921. [DOI] [PMC free article] [PubMed]

[B8] 8.Nascimento GAD, Souza DS, Lima BS, Vasconcelos CML, Araújo AAS, Durço AO, et al. Bradycardic and Antiarrhythmic Effects of the D-Limonene in Rats. Arq Bras Cardiol. 2019;113(5):925-32. doi: 10.5935/abc.20190173. [DOI] [PMC free article] [PubMed]

[B9] 9.Souza DS, Menezes-Filho JER, Santos-Miranda A, Jesus ICG, Silva Neto JA, Guatimosim S, et al. Calcium Overload-induced Arrhythmia is Suppressed by Farnesol in Rat Heart. Eur J Pharmacol. 2019;859:172488. doi: 10.1016/j.ejphar.2019.172488. [DOI] [PubMed]

[B10] 10.Elmastaş M, Dermirtas I, Isildak O, Aboul‐Enein HY. Antioxidant Activity of S‐Carvone Isolated from Spearmint (Mentha Spicata L. Fam Lamiaceae). J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 2006;29(10):1465-75. doi: 10.1080/10826070600674893

[B11] 11.Moro, I. J. et al. Evaluation of antimicrobial, cytotoxic and chemopreventive activities of carvone and its derivatives. Braz. J. Pharm. Sci. 2017;539(4): e00076. doi: 10.1590/s2175-97902017000400076.

[B12] 12.Nogoceke FP, Barcaro IM, Sousa DP, Andreatini R. Antimanic-like Effects of (R)-(-)-carvone and (S)-(+)-carvone in Mice. Neurosci Lett. 2016;619:43-8. doi: 10.1016/j.neulet.2016.03.013. [DOI] [PubMed]

[B13] 13.Souza FV, Rocha MB, Souza DP, Marçal RM. (-)-Carvone: Antispasmodic Effect and Mode of Action. Fitoterapia. 2013;85:20-4. doi: 10.1016/j.fitote.2012.10.012. [DOI] [PubMed]

[B14] 14.Abbas MM, Kandil Yİ, Abbas MA. R-(-)-carvone Attenuated Doxorubicin Induced Cardiotoxicity In Vivo and Potentiated Its Anticancer Toxicity In Vitro. Balkan Med J. 2020;37(2):98-103. doi: 10.4274/balkanmedj.galenos.2019.2019.7.117. [DOI] [PMC free article] [PubMed]

[B15] 15.Curtis MJ, Alexander S, Cirino G, Docherty JR, George CH, Giembycz MA, et al. Experimental Design and Analysis and their Reporting II: Updated and Simplified Guidance for Authors and Peer Reviewers. Br J Pharmacol. 2018;175(7):987-93. doi: 10.1111/bph.14153. [DOI] [PMC free article] [PubMed]

[B16] 16.Cerqueira SV, Gondim AN, Roman-Campos D, Cruz JS, Passos AG, Lauton-Santos S, et al. R(+)-pulegone Impairs Ca²+ homeostasis and Causes Negative Inotropism in Mammalian Myocardium. Eur J Pharmacol. 2011;672(1-3):135-42. doi: 10.1016/j.ejphar.2011.09.186. [DOI] [PubMed]

[B17] 17.Shioya T. A Simple Technique for Isolating Healthy Heart Cells from Mouse Models. J Physiol Sci. 2007;57(6):327-35. doi: 10.2170/physiolsci.RP010107. [DOI] [PubMed]

[B18] 18.Zhou P, Zhang SM, Wang QL, Wu Q, Chen M, Pei JM. Anti-arrhythmic Effect of Verapamil is Accompanied by Preservation of cx43 Protein in Rat Heart. PLoS One. 2013;8(8):e71567. doi: 10.1371/journal.pone.0071567. [DOI] [PMC free article] [PubMed]

[B19] 19.Curtis MJ, Walker MJ. Quantification of Arrhythmias Using Scoring Systems: an Examination of Seven Scores in an In Vivo Model of Regional Myocardial Ischaemia. Cardiovasc Res. 1988;22(9):656-65. doi: 10.1093/cvr/22.9.656. [DOI] [PubMed]

[B20] 20.Bers DM. Cardiac Excitation-contraction Coupling. Nature. 2002;415(6868):198-205. doi: 10.1038/415198a. [DOI] [PubMed]

[B21] 21.Silva-Filho JC, Oliveira NN, Arcanjo DD, Quintans-Júnior LJ, Cavalcanti SC, Santos MR, et al. Investigation of Mechanisms Involved in (-)-borneol-induced Vasorelaxant Response on Rat Thoracic Aorta. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2012;110(2):171-7. doi: 10.1111/j.1742-7843.2011.00784.x. [DOI] [PubMed]

[B22] 22.Oz M, El Nebrisi EG, Yang KS, Howarth FC, Al Kury LT. Cellular and Molecular Targets of Menthol Actions. Front Pharmacol. 2017;8:472. doi: 10.3389/fphar.2017.00472. [DOI] [PMC free article] [PubMed]

[B23] 23.Peixoto-Neves D, Silva-Alves KS, Gomes MD, Lima FC, Lahlou S, Magalhães PJ, et al. Vasorelaxant Effects of the Monoterpenic Phenol Isomers, Carvacrol and Thymol, on Rat Isolated Aorta. Fundam Clin Pharmacol. 2010;24(3):341-50. doi: 10.1111/j.1472-8206.2009.00768.x. [DOI] [PubMed]

[B24] 24.Guedes DN, Silva DF, Barbosa-Filho JM, Medeiros IA. Calcium Antagonism and the Vasorelaxation of the Rat Aorta Induced by Rotundifolone. Braz J Med Biol Res. 2004;37(12):1881-7. doi: 10.1590/s0100-879x2004001200014. [DOI] [PubMed]

[B25] 25.Khaleel C, Tabanca N, Buchbauer G. α-Terpineol, a Natural Monoterpene: A Review of its Biological Properties. Open Chem. 2018;16(1):349–61. doi: 10.1515/chem-2018-0040.

[B26] 26.Baylie RL, Cheng H, Langton PD, James AF. Inhibition of the Cardiac L-type Calcium Channel Current by the TRPM8 Agonist, (-)-menthol. J Physiol Pharmacol. 2010;61(5):543-50. [PubMed]

[B27] 27.Lipsius SL, Hüser J, Blatter LA. Intracellular Ca2+ Release Sparks Atrial Pacemaker Activity. News Physiol Sci. 2001;16:101-6. doi: 10.1152/physiologyonline.2001.16.3.101. [DOI] [PubMed]

[B28] 28.Zhou Q, Xiao J, Jiang D, Wang R, Vembaiyan K, Wang A, et al. Carvedilol and its New Analogs Suppress Arrhythmogenic Store Overload-induced Ca2+ Release. Nat Med. 2011;17(8):1003-9. doi: 10.1038/nm.2406. [DOI] [PMC free article] [PubMed]

[B29] 29.Mehraein, F. A Review on Amiodarone as an Antiarrhythmic Drug. Abnorm. Heart Rhythms. 2015; 96:1593-600. doi: 10.1136/hrt.2008.152652.

[B30] 30.Tisdale JE. Drug-induced QT Interval Prolongation and Torsades de Pointes: Role of the Pharmacist in Risk Assessment, Prevention and Management. Can Pharm J (Ott). 2016;149(3):139-52. doi: 10.1177/1715163516641136. [DOI] [PMC free article] [PubMed]

[B31] 31.Wang F, Koide M, Wellman GC. Nifedipine Inhibition of High-Voltage Activated Calcium Channel Currents in Cerebral Artery Myocytes Is Influenced by Extracellular Divalent Cations. Front Physiol. 2017;8:210. doi: 10.3389/fphys.2017.00210. [DOI] [PMC free article] [PubMed]

[B32] 32.Gao H, Wang F, Wang W, Makarewich CA, Zhang H, Kubo H, et al. Ca(2+) Influx through L-type Ca(2+) Channels and Transient Receptor Potential Channels Activates Pathological Hypertrophy Signaling. J Mol Cell Cardiol. 2012;53(5):657-67. doi: 10.1016/j.yjmcc.2012.08.005. [DOI] [PMC free article] [PubMed]

[B33] 33.Williams EMV. A Classification of Antiarrhythmic Actions Reassessed After a Decade of New Drugs. J Clin Pharmacol. 1984;24(4):129-47. doi: 10.1002/j.1552-4604.1984.tb01822.x. [DOI] [PubMed]

[B34] 34.Bryzgalov AO, Tolstikova TG, Shults EE, Petrova KO. Natural Products as a Source of Antiarrhythmic Drugs. Mini Rev Med Chem. 2018;18(4):345-62. doi: 10.2174/1389557516666161104144815. [DOI] [PubMed]

PERMALINK

A (-)-Carvona Modula a Sinalização de Cálcio Intracelular com Ação Antiarrítmica em Corações de Ratos

Gilmara Beatriz Andrade da Silva

Diego Santos Souza

José Evaldo Rodrigues Menezes-Filho

Júlio Alves da Silva-Neto

Jader dos Santos Cruz

Danilo R Roman-Campos

Lucindo José Quintans-Júnior

Carla Maria Lins de Vasconcelos

Resumo

Fundamento:

Objetivos:

Métodos:

Resultados:

Conclusão:

Introdução

Materiais e métodos

Animais

Avaliação do efeito inotrópico da (-)-carvona

Efeitos da (-)-carvona sobre a entrada de cálcio no miocárdio atrial

Effeitos da (-)-carvona sobre o perfil eletrocardiográfico e pressão do ventrículo esquerdo (PVE)

Efeitos da (-)-carvona sobre a fração de encurtamento

Efeitos da (-)-carvona sobre a corrente de cálcio do tipo L (ICa,L)

Efeitos da (-)-carvona sobre o transiente global de Ca+2 intracelular

Efeitos antiarrítmicos da (-)-carvona

Análise estatística

Resultados

Figura 2. Efeitos da (-)-carvona sobre a contratilidade no coração de rato isolado. (A) registros da pressão do ventrículo esquerdo (PVE) no controle (painel superior) e com 0,5 mM de (-)carvona (painel inferior); (B) PVE; (C) tempo para o pico; e (D) tempo de relaxamento (n = 5, *p < 0,05).

Discussão

Limitações do estudo

Conclusão

Agradecimentos

Footnotes

Referências

(-)-Carvone Modulates Intracellular Calcium Signaling with Antiarrhythmic Action in Rat Hearts

Gilmara Beatriz Andrade da Silva

Diego Santos Souza

José Evaldo Rodrigues Menezes-Filho

Júlio Alves da Silva-Neto

Jader dos Santos Cruz

Danilo R Roman-Campos

Lucindo José Quintans-Júnior

Carla Maria Lins de Vasconcelos

Abstract

Background:

Objective:

Methods:

Results:

Conclusion:

Introduction

Material and Methods

Animals

Evaluation of inotropic effect of (-)-carvone

Effects of (-)-carvone on Ca2+ influx in the atrial myocardium

Effects of (-)-carvone on the electrocardiographic profile and left ventricular developed pressure (LVDP)

Effects of (-)-carvone on the fractional shortening

Effects of (-)-carvone on the L-type calcium current (ICa,L)

Effects of (-)-carvone on the intracellular global Ca2+ transient

Effects antiarrhythmic of (-)-carvone

Statistical analysis

Results

Figure 2. Effects of (-)-carvone on the cardiac contractility in the isolated rat heart. (A) Records of left ventricle developed pressure (LVDP) in the control (top panel) and with 0.5 mM (-)-carvone (bottom panel); (B) LVDP; (C) time to peak; and (D) relaxation time (n = 5, *p < 0.05).

Discussion

Study limitation

Conclusion

Acknowledgments

Footnotes

ACTIONS

PERMALINK

RESOURCES

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Links to NCBI Databases

Efeitos da (-)-carvona sobre a corrente de cálcio do tipo L (I_Ca,L)

Efeitos da (-)-carvona sobre o transiente global de Ca⁺² intracelular

Effects of (-)-carvone on Ca²⁺ influx in the atrial myocardium

Effects of (-)-carvone on the L-type calcium current (I_Ca,L)

Effects of (-)-carvone on the intracellular global Ca²⁺ transient