TXNIP/Trx-1/GPX4通路促进新生大鼠缺氧缺血后海马神经元铁死亡的作用机制

Abstract

Objective

To observe the change in ferroptosis in hippocampal neurons after hypoxia-ischemia (HI) in neonatal rats and investigate the related mechanism based on the TXNIP/Trx-1/GPX4 signaling pathway.

Methods

Healthy neonatal Sprague-Dawley rats, aged 7 days, were randomly divided into three groups: sham-operation (n=30), hypoxic-ischemic brain damage (HIBD) (n=30) and siRNA (TXNIP siRNA) (n=12). The classic Rice-Vannucci method was used to establish a neonatal rat model of HIBD. At 6 hours, 24 hours, 72 hours, and 7 days after modeling, Western blot was used to measure the protein expression of GPX4 in the hippocampal tissue at the injured side; at 24 hours after modeling, laser speckle imaging combined with hematoxylin-eosin staining was used to determine whether the model was established successfully; NeuN/GPX4 and GFAP/GPX4 immunofluorescence staining combined with Western blot and other methods was used to measure the protein expression of GPX4 and the signal molecules TXNIP and Trx-1 in the hippocampal tissue at the injured side; the kits for determining the content of serum iron and tissue iron were used to measure the change in iron content; quantitative real-time PCR was used to measure the mRNA expression of TXNIP, Trx-1, and GPX4.

Results

At 6 hours, 24 hours, 72 hours, and 7 days after modeling, the HIBD group had a significantly lower protein expression level of GPX4 than the sham-operation group (P<0.05). At 24 hours after modeling, the HIBD group had a significantly lower cerebral blood flow of the injured side than the sham-operation group (P<0.05), with loose and disordered arrangement and irregular morphology of hippocampal CA1 neurons at the injured side. Compared with the sham-operation group, the HIBD group had a significantly higher number of TXNIP⁺ cells and significantly lower numbers of Trx-1⁺ cells and NeuN⁺GPX4⁺/NeuN⁺ cells in the hippocampal CA1 region at the injured side (P<0.05), with almost no GFAP⁺GPX4⁺ cells in the hippocampal CA1 region. Compared with the sham-operation group, the HIBD group and the siRNA group had significantly higher levels of serum iron and tissue iron in the hippocampus at the injured side (P<0.05). Compared with the HIBD group, the siRNA group had significantly lower levels of serum iron and tissue iron in the hippocampus at the injured side (P<0.05). The HIBD group and the siRNA group had significantly higher mRNA and protein expression levels of TXNIP than the sham-operation group (P<0.05), and the siRNA group had significantly lower expression levels than the HIBD group (P<0.05). The HIBD group and the siRNA group had significantly lower mRNA and protein expression levels of Trx-1 and GPX4 in the hippocampus at the injured side than the sham-operation group (P<0.05), and the siRNA group had significantly higher expression levels than the HIBD group (P<0.05).

Conclusions

HI induces ferroptosis of hippocampal neurons in neonatal rats by activating the TXNIP/Trx-1/GPX4 pathway, thereby resulting in HIBD.

新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）是围生期常见的严重疾病，可导致癫痫、永久性认知和神经功能障碍等并发症^［1］，但其发病机制尚不清楚。氧化应激在缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）中发挥重要作用^［2］，铁死亡作为氧化应激依赖性的新型程序性细胞死亡，不同于细胞凋亡、自噬和焦亡，多由铁积累和谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）的丢失诱导脂质过氧化引起^［3］。有研究表明，新生大鼠缺氧缺血可导致海马神经元铁死亡，引起HIBD^［4］，但其发生铁死亡的具体机制尚待阐明。硫氧还原蛋白-1（thioredoxin-1，Trx-1）作为抗氧化剂，可以维持氧化还原稳态，在清除脂质活性氧和还原氧化蛋白方面发挥重要作用^［5］。已有研究表明Trx-1在抑制帕金森病相关的神经细胞铁死亡中起关键性作用，可上调GPX4表达参与调控铁死亡^［6］。硫氧还原蛋白互作蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）是硫氧还原蛋白系统的内源性抑制剂，可结合并负调控Trx-1，抑制其氧化还原调节能力，从而引起细胞的氧化应激反应、炎症和细胞死亡^［7-8］。缺氧缺血（hypoxia-ischemia，HI）后是否通过TXNIP/Trx-1/GPX4通路导致铁死亡，从而导致HIBD，目前尚不清楚。因此，本研究通过建立HIBD模型，观察造模后海马TXNIP/Trx-1/GPX4通路诸分子及铁死亡的变化，并于侧脑室注射TXNIP小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），沉默上游信号分子TXNIP mRNA的表达，观察下游信号分子及铁死亡的变化，从而探讨HI后脑神经细胞铁死亡的发生机制，以期为HIE的临床诊疗提供新思路。

1. 材料与方法

1.1. 实验动物及分组

SPF级7日龄Sprague-Dawley新生大鼠72只［SCXK（鲁）20190003，山东省济南朋悦实验动物繁育有限公司］，雌雄不限，平均体重（11.8±1.5）g，采用随机数字表法分为假手术组（n=30）、HIBD组（n=30）及siRNA（TXNIP siRNA）组（n=12）。假手术组与HIBD组根据造模后时间分为6 h、24 h、72 h及7 d 4个亚组，行Western blot法检测（n=3）；造模后24 h，假手术组与HIBD组行激光散斑成像、组织切片检测（n=6）；假手术组、HIBD组及siRNA组行组织铁、血清铁测定（n=4），实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）检测（n=4）和Western blot法检测（n=4）。

1.2. HIBD 模型的建立

采用经典的Rice-Vannucci法建立HIBD模型^［9］。7日龄新生大鼠乙醚吸入麻醉后，剪开颈部正中皮肤，分离损伤（右）侧颈总动脉，电凝笔（RS-300，Roboz公司，美国）电凝，消毒并缝合皮肤，置于低氧舱（DYC-Ⅲ，武汉七〇一研究所）内缺氧（氧舱氧浓度8.0%±0.1%，温度37℃）2 h，实验过程中全程监测，后放回母鼠笼中喂养。HIBD组与siRNA组大鼠均建立HIBD模型，假手术组大鼠仅分离右侧颈总动脉，不予电凝及缺氧处理。

1.3. 颅骨表面血流量测定

造模后24 h，HIBD组和假手术组新生大鼠乙醚吸入麻醉后，手术剪沿头背部正中纵向剪开皮肤，暴露颅骨，将新生大鼠置于激光散斑成像台内，调整焦距使图像清晰。采用moorO₂Flo组织血流血氧实时成像系统观察新生大鼠脑血流量，激光检视光源，前囟到“人”字点设置感兴趣区（region of interest，ROI）^［10］，观察过程中可滴入丙三醇保持颅骨表面湿润。通过系统将原始散斑图像转换成脑血流图像并计算ROI脑血流量。

1.4. 侧脑室注射TXNIP siRNA

siRNA组新生大鼠固定于立体定位仪上，正中剪开头皮，于损伤侧侧脑室（坐标AP：-0.5 mm，ML：-2 mm，DV：-2 mm）缓慢注入3 μL TXNIP siRNA与转染试剂混合液^［11］，1 μL/min缓慢注入，留针2 min后拔针缝合头皮，复温苏醒后回母鼠身边饲养。假手术组与HIBD组于相同部位注射3 μL 0.9%氯化钠溶液。

1.5. 标本的采集与处理

造模后24 h，3组新生大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠15 mg/kg，分别取血清和损伤侧海马组织，放至-80℃冰箱冻存，行血清铁含量、组织铁含量、Western blot及qPCR检测；另行常规心脏灌注取脑组织，4%多聚甲醛后固定，梯度乙醇脱水、二甲苯透明，浸蜡、石蜡包埋，取海马层面脑组织行冠状位连续切片，厚度为4 μm，每3~5张切片取1张切片，分别行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色、免疫荧光染色。

1.6. HE染色

石蜡切片，二甲苯脱蜡、梯度酒精水化，采用HE染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，G1120）染色，行苏木精染核10 min后，盐酸酒精分色30 s，去离子水冲洗，伊红染液染浆2 min，无水乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。置于光学显微镜下观察新生大鼠损伤侧海马CA1区神经细胞病理形态学改变。

1.7. Western blot法检测新生大鼠损伤侧海马组织TXNIP、Trx-1及GPX4蛋白表达

造模后6 h、24 h、72 h及7 d，Western blot法检测造模后新生大鼠损伤侧海马组织GPX4蛋白表达。造模后24 h，Western blot法检测造模后新生大鼠损伤侧海马组织TXNIP、Trx-1蛋白表达。提取新生大鼠损伤侧海马组织，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，PC0020）测定蛋白浓度。制备12% SDS-PAGE分离胶，经电泳、转膜、封闭后，加入兔抗TXNIP、Trx-1、GPX4（浓度均为1∶500），鼠抗GAPDH（Proteintech，武汉三鹰生物技术有限公司，浓度1∶10 000）一抗后，4℃冰箱过夜。次日，分别加入山羊抗兔或山羊抗鼠二抗。使用高性能成像系统（Protein Simple，美国）曝光并拍照，采用Image J进行灰度值测定。

1.8. 免疫荧光染色法检测新生大鼠损伤侧海马CA1区神经细胞TXNIP、Trx-1及GPX4蛋白表达

造模后24 h，石蜡切片，脱蜡、水化，进行抗原修复，0.3% TritonX-100透膜，5% BSA-PBS封闭1 h后，加入兔抗GPX4（1∶200，Affinity，英国）与鼠抗NeuN（1∶200，Chemicon，美国）一抗混合液或兔抗GPX4（1∶200，Affinity，英国）与鼠抗GFAP（1∶200，武汉博士德生物工程有限公司）一抗混合液、兔抗Trx-1（1∶200，Cell Signaling Technology，美国）、兔抗TXNIP（1∶200，Affinity，英国），4℃冰箱过夜。次日37℃孵育箱复温，0.01M PBS洗涤3遍后，滴加Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG（1∶200）、Alexa Fluor 594标记的山羊抗鼠IgG（1∶200）荧光二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）混合液，37℃避光孵育1 h后PBS冲洗，含4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的荧光封片剂（F6507，Sigma，美国）封片。置于正置荧光显微镜下进行观察、拍照并统计各组损伤侧海马CA1区NeuN⁺GPX4⁺/NeuN⁺、GFAP⁺GPX4⁺DAPI⁺、TXNIP⁺DAPI⁺、Trx-1⁺DAPI⁺细胞数。

1.9. 血清铁测定

造模后24 h，3组取新生大鼠上层清亮血清，采用血清铁测定试剂盒（A039-1-1，南京建成生物工程研究所），加入铁显色剂，取上清液置于96孔板中，酶标仪在520 nm波长下测定各孔吸光度OD值。

1.10. 损伤侧海马组织铁测定

造模后24 h，采用组织铁含量测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，BC4355）测定新生大鼠损伤侧海马组织铁含量。3组分别称取损伤侧海马组织，以1 g/mL比例加入提取液进行冰浴匀浆。5 952 r/min，4℃离心10 min，取上清120 μL，加入组织铁试剂，后加入60 μL氯仿，充分震荡混匀，室温下10 000 r/min离心10 min，吸取上层无机相200 μL置于96孔板，酶标仪在520 nm波长下测定吸光度。组织铁含量计算公式：每克组织中铁含量（μg/g）=6.98×ΔA测定（定义为0.125 μmol/mL Fe³⁺标准液吸光度A-蒸馏水吸光度A）÷ΔA标准（定义为样本吸光度A-蒸馏水吸光度A）÷样本质量（g）。

1.11. qPCR检测新生大鼠损伤侧海马组织TXNIP、Trx-1、GPX4 mRNA表达

3组分别取新生大鼠损伤侧海马组织，提取样本总RNA，将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，采用Bio Rad CFX Manager荧光定量PCR仪，SYBR Green 荧光染料法进行相对定量。采用20 μL体系，加入cDNA模板1 μL、无酶水7.8 μL、SYBR Premix荧光定量反应试剂10 μL，上游、下游引物各0.6 μL，反应条件：95℃预变性10 min，PCR反应阶段：95℃变性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸30 s，共循环40次，结果以Cq值表示，采用2^-△△Cq法比较TXNIP、Trx-1、GPX4 mRNA在各组新生大鼠损伤侧海马组织中表达的差异。

引物序列为：GAPDH：上游（5'-3'）：ACAGCAACAGGGTGGTGGAC，下游（5'-3'）：TTTGAGGGTGCAGCGAACTT；TXNIP：上游（5'-3'）：CATGTTCCCGAATCGTGGTC，下游（5'-3'）：CTTGGAGCCAGGGACACTAA；Trx-1：上游（5'-3'）：AAGGAAGCTTTTCAGGAGGC，下游（5'-3'）：GGCAGTCATCCACGTCTACT；GPX4：上游（5'-3）：AATTCGCAGCCAAGGACATC，下游（5'-3）：AGGCCAGGATTCGTAAACCA。

1.12. 统计学分析

数据分析采用SPSS 22.0统计学软件。计量资料采用均数±标准差（ $\overline{x}$ ±s）表示，两组间比较采用两样本t检验分析，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 造模后24 h，新生大鼠损伤侧脑血流量变化

造模后24 h，假手术组新生大鼠可维持一定的脑血流量；HIBD组损伤侧ROI脑血流量急剧下降，低于假手术组［（687±75）PU vs（1 432±99）PU，t=14.654，P<0.001］。见图1。

图1. 造模后24 h，新生大鼠损伤侧脑血流量变化 造模后24 h，激光散斑成像结果显示，假手术组新生大鼠损伤侧脑血流量丰富，HIBD组新生大鼠损伤侧脑血流量较少。.

2.2. 造模后24 h，新生大鼠损伤侧海马CA1区神经细胞形态学变化

造模后24 h，假手术组新生大鼠损伤侧海马CA1区神经细胞排列紧密整齐，形态规则；HIBD组新生大鼠损伤侧海马CA1区神经细胞排列疏松紊乱，形态不规则。见图2。

图2. 造模后24 h，新生大鼠损伤侧海马CA1区神经细胞形态学变化 HE染色（×400），标尺=20 μm。造模后24 h，假手术组神经细胞排列整齐，形态规则；HIBD组神经细胞排列疏松紊乱。.

2.3. 造模后，新生大鼠损伤侧海马组织TXNIP、Trx-1、GPX4蛋白表达水平变化

造模后6 h，HIBD组损伤侧海马组织GPX4蛋白表达水平低于假手术组（P<0.05）；造模后24 h，HIBD组损伤侧海马组织GPX4蛋白表达水平低于造模后6 h（P<0.05）；造模后72 h、7 d，HIBD组损伤侧海马组织GPX4蛋白表达水平高于造模后24 h（P<0.05）；造模后各时间点，HIBD组GPX4蛋白表达水平均低于假手术组（均P<0.05），见图3、表1。造模后24 h，siRNA组损伤侧海马组织GPX4蛋白、Trx-1蛋白表达水平高于HIBD组，但低于假手术组（均P<0.05）；HIBD组损伤侧海马组织GPX4蛋白、Trx-1蛋白表达水平低于假手术组；HIBD组、siRNA组损伤侧海马组织TXNIP蛋白表达水平均高于假手术组，且siRNA组TXNIP蛋白表达水平低于HIBD组（均P<0.05）。见图4、表2。

图3. 各组新生大鼠造模后不同时间点损伤侧海马组织GPX4蛋白表达条带图.

表1.

新生大鼠造模后不同时间点损伤侧海马组织GPX4蛋白表达水平比较

组别	造模后6 h	造模后24 h	造模后72 h	造模后7 d	F值	P值
假手术组	1.016±0.025	1.016±0.018	1.011±0.025	1.105±0.021a,b,c	12.478	0.002
HIBD组	0.716±0.011	0.650±0.017a	0.813±0.046b	0.858±0.032b	30.021	<0.001
t值	19.219	25.595	6.625	11.155
P值	<0.001	<0.001	0.003	<0.001

注：a示与同组造模后6 h相比，P<0.05；b示与同组造模后24 h相比，P<0.05；c示与同组造模后72 h相比，P<0.05。［HIBD］缺氧缺血性脑损伤；［GPX4］谷胱甘肽过氧化物酶4。

$\overline{x}\pm s$ ，n=3

图4. 造模后24 h，3组新生大鼠损伤侧海马组织TXNIP、Trx-1、GPX4蛋白表达条带图.

表2.

造模后24 h，3组新生大鼠损伤侧海马组织GPX4、TXNIP、Trx-1蛋白表达水平比较

组别	TXNIP	Trx-1	GPX4
假手术组	0.494±0.037	1.317±0.056	1.001±0.018
HIBD组	0.802±0.022a	0.801±0.030a	0.850±0.022a
siRNA组	0.619±0.019a,b	1.167±0.058a,b	0.932±0.034a,b
F值	126.911	113.510	35.256
P值	<0.001	<0.001	<0.001

注：a示与假手术组相比，P<0.05；b示与HIBD组相比，P<0.05。［HIBD］缺氧缺血性脑损伤；［siRNA］小干扰RNA；［TXNIP］硫氧还原蛋白互作蛋白；［Trx-1］硫氧还原蛋白-1；［GPX4］谷胱甘肽过氧化物酶4。

$\overline{x}\pm s$ ，n=4

2.4. 造模后24 h，新生大鼠损伤侧海马CA1区神经细胞中TXNIP、Trx-1、GPX4蛋白表达水平变化

NeuN是神经元标志物，GFAP是星形胶质细胞标志物。造模后24 h，HIBD组损伤侧海马CA1区NeuN⁺GPX4⁺/NeuN⁺低于假手术组（P<0.05）；假手术组、HIBD组损伤侧海马CA1区均几乎未见GFAP⁺GPX4⁺细胞。HIBD组损伤侧海马CA1区TXNIP⁺细胞数高于假手术组（P<0.05）；HIBD组损伤侧海马CA1区Trx-1⁺细胞数低于假手术组（P<0.05）。见图5~8，表3。

图5. 造模后24 h，新生大鼠损伤侧海马CA1区神经元中铁死亡的变化 造模后24 h，各组新生大鼠损伤侧海马CA1区NeuN/GPX4免疫荧光结果（×400），标尺=20 μm，箭头指示NeuN⁺GPX4⁺DAPI⁺细胞。NeuN是神经元标志物，GPX4是铁死亡关键蛋白，NeuN⁺细胞核染为红色，GPX4⁺胞浆染为绿色，DAPI⁺细胞核染为蓝色。.

图8. 造模后24 h，新生大鼠损伤侧海马CA1区神经细胞中Trx-1蛋白表达的变化 造模后24 h，各组新生大鼠损伤侧海马CA1区Trx-1免疫荧光结果（×400），标尺=20 μm，箭头指示Trx-1⁺DAPI⁺细胞。Trx-1⁺胞浆染为绿色，DAPI⁺标记细胞核染为蓝色。.

表3.

造模后24 h，损伤侧海马CA1区神经细胞中TXNIP、Trx-1、GPX4蛋白表达水平比较 （ $\overline{x}\pm s$ ，n=6）

组别	NeuN+GPX4+/NeuN+	TXNIP+DAPI+(个/mm2)	Trx-1+DAPI+(个/mm2)
假手术组	0.157±0.008	99.2±13.2	206.1±28.0
HIBD组	0.046±0.006	265.0±33.6	102.3±10.6
t值	27.081	12.141	9.174
P值	<0.001	<0.001	<0.001

注：［NeuN］神经元核抗原；［GPX4］谷胱甘肽过氧化物酶4；［TXNIP］硫氧还原蛋白互作蛋白；［Trx-1］硫氧还原蛋白-1；［DAPI］4',6-二脒基-2-苯基吲哚；［HIBD］缺氧缺血性脑损伤。

图6. 造模后24 h，新生大鼠损伤侧海马CA1区星形胶质细胞中铁死亡的变化 造模后24 h，各组新生大鼠损伤侧海马CA1区GFAP/GPX4免疫荧光结果（×400），标尺=20 μm。GFAP是星形胶质细胞标志物，GPX4是铁死亡关键蛋白，GFAP⁺染为红色，GPX4⁺胞浆染为绿色，DAPI⁺细胞核染为蓝色。.

图7. 造模后24 h，新生大鼠损伤侧海马CA1区神经细胞中TXNIP蛋白表达的变化 造模后24 h，各组新生大鼠损伤侧海马CA1区TXNIP免疫荧光结果（×400），标尺=20 μm，箭头指示TXNIP⁺DAPI⁺细胞。TXNIP⁺胞浆染为绿色，DAPI⁺标记细胞核染为蓝色。.

2.5. 3组新生大鼠血清及损伤侧海马组织铁含量变化

造模后24 h，HIBD组与siRNA组血清铁、损伤侧海马组织铁含量均高于假手术组；siRNA组血清铁、损伤侧海马组织铁含量均低于HIBD组（均P<0.05）。见表4。

表4.

3组血清铁及损伤侧海马组织铁含量比较

组别	血清铁 (mg/L)	组织铁 (μg/g)
假手术组	3.103±0.092	1.663±0.134
HIBD组	4.529±0.216a	2.183±0.096a
siRNA组	4.245±0.186a,b	1.845±0.037a,b
F值	75.811	29.062
P值	<0.001	<0.001

注：a示与假手术组相比，P<0.05；b示与HIBD组相比，P<0.05。［HIBD］缺氧缺血性脑损伤；［siRNA］小干扰RNA。

$\overline{x}\pm s$ ，n=4

2.6. 3组新生大鼠海马组织TXNIP、Trx-1、GPX4 mRNA表达水平变化

造模后24 h，HIBD组与siRNA组损伤侧海马组织TXNIP mRNA表达水平高于假手术组；siRNA组TXNIP mRNA表达水平低于HIBD组（均P<0.05）。HIBD组损伤侧海马组织Trx-1、GPX4 mRNA表达水平低于假手术组，siRNA组损伤侧海马组织Trx-1、GPX4 mRNA表达水平高于HIBD组（均P<0.05）。见表5。

表5.

造模后24 h，3组损伤侧海马组织各mRNA表达水平比较 （ $\overline{x}$ ±s，n=4）

组别	GPX4 mRNA	Trx-1 mRNA	TXNIP mRNA
假手术组	0.032±0.002	0.314±0.035	0.005±0.001
HIBD组	0.014±0.002a	0.199±0.005a	0.011±0.001a
siRNA组	0.018±0.002a,b	0.246±0.013a,b	0.008±0.001a,b
F值	67.677	27.699	39.289
P值	<0.001	<0.001	<0.001

注：a示与假手术组相比，P<0.05；b示与HIBD组相比，P<0.05。［HIBD］缺氧缺血性脑损伤；［siRNA］小干扰RNA；［GPX4］谷胱甘肽过氧化物酶4；［Trx-1］硫氧还原蛋白-1；［TXNIP］硫氧还原蛋白互作蛋白。

3. 讨论

最新研究表明，铁死亡是一种新型程序性细胞死亡，与HIBD密切相关^［12］。本研究发现造模后24 h，激光散斑成像结果显示HIBD组新生大鼠损伤侧脑血流量低于假手术组，提示HIBD新生大鼠模型损伤侧颈总动脉血流已阻断；HE染色结果显示，新生大鼠损伤侧海马CA1区神经细胞排列紊乱，形态不规则，均提示HIBD模型建立成功。

本研究还发现HIBD组血清铁、损伤侧海马组织铁含量均高于假手术组，提示HI后新生大鼠血液及组织中铁含量超载可能导致铁死亡。

GPX4是铁死亡关键蛋白^［13］。Western blot结果发现造模后各时间点HIBD组损伤侧海马组织GPX4蛋白表达水平均低于假手术组，造模后24 h，HIBD组损伤侧海马组织GPX4蛋白表达水平较低，且低于造模后其他时间点，提示HI后可致GPX4蛋白表达下调，导致铁死亡，这与文献^［14］报道一致，但HI后海马CA1区铁死亡的细胞定位尚不清楚。本研究采用NeuN/GPX4、GFAP/GPX4免疫荧光双标染色，结果显示造模后24 h，HIBD组损伤侧海马CA1区NeuN⁺GPX4⁺/NeuN⁺低于假手术组，假手术组和HIBD组损伤侧海马CA1区几乎未见GFAP⁺GPX4⁺细胞，提示HI后，铁死亡主要发生在海马神经元。

TXNIP是Trx-1的抑制剂，可与其结合并抑制Trx-1的抗氧化功能，导致氧化应激，但TXNIP/Trx-1通路是否与HI后海马神经元铁死亡相关尚不清楚^［15-16］。本研究发现造模后24 h，qPCR与Western blot结果提示HIBD组损伤侧海马组织TXNIP mRNA与蛋白表达水平均高于假手术组，Trx-1、GPX4 mRNA与蛋白表达水平均低于假手术组，提示HI可上调信号分子TXNIP的表达，进而抑制Trx-1、GPX4蛋白表达，导致铁死亡。免疫荧光染色结果亦发现，HIBD组损伤侧海马CA1区TXNIP⁺细胞数较假手术组增多，Trx-1⁺细胞数较假手术组减少，进一步说明HI可通过TXNIP/Trx-1/GPX4通路调控铁死亡。

为验证HI能否通过激活TXNIP/Trx-1/GPX4通路导致新生大鼠铁死亡，本研究采用损伤侧侧脑室注射TXNIP siRNA法干扰TXNIP基因表达，造模后24 h，siRNA组血清铁、损伤侧海马组织铁含量均低于HIBD组，表明沉默TXNIP基因可抑制HIBD新生大鼠血液中铁超载及损伤侧海马组织铁死亡。qPCR和Western blot检测结果显示，siRNA组损伤侧海马组织TXNIP mRNA及蛋白表达水平低于HIBD组，Trx-1、GPX4 mRNA及蛋白表达水平高于HIBD组，说明沉默TXNIP基因可调控HIBD新生大鼠TXNIP下游因子Trx-1、GPX4基因及其蛋白表达变化，引起铁死亡，导致HIBD。

综上，新生大鼠HI通过激活TXNIP/Trx-1/GPX4通路，诱发新生大鼠海马神经元铁死亡，进而导致HIBD。

利益冲突声明

所有作者均声明不存在利益冲突。