北京市新生儿短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症筛查、临床特征及基因突变分析

Abstract

Objective

: To investigate the clinical characteristics of infants with short-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency (SCADD) and related gene mutations in Beijing.

Methods

: The acylcarnitine levels in the blood samples of 100 603 neonates in Beijing during August 2014 and March 2022 were measured by tandem mass spectrometry (MS/MS). The suspected SCADD neonates were rechecked by MS/MS, urine gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) and next-generation sequencing (NGS) for diagnosis. The clinical, biochemical and gene mutation characteristics of infants with SCADD were analyzed; the growth and intellectual development of these patients were observed regularly.

Results

: Among 100 603 live births, the elevated C4 concentration or elevated C4/C3 ratio were detected in the initial screening from 196 neonates, and 131 were recalled. Five cases of SCADD were diagnosed with an incidence rate of 4.97/100 000 (1/20 121). There was no significant abnormality in clinical manifestations, however, the blood butyrylcarnitine (C4) level and the ratio of C4 to propionylcarnitine (C3) were raised in all diagnosed cases. Urinary organic acids were analyzed in 4 cases, all of whom had increased ethyl malonate acid levels. Seven mutations were detected in the ACADS gene, all of which were known missense mutations. One patient had homozygous mutation, and the others showed compound heterozygous mutations. No clinical symptoms were observed, and the physical and intellectual development was normal in all patients at a median age of 33 (4-40) months during follow-up.

Conclusions

: The incidence rate of SCADD was 1/20 121 in Beijing. Neonates with early diagnosis and without clinical symptoms usually have good prognosis.

短链酰基辅酶A脱氢酶（short-chain acyl-CoA dehydrogenase，SCAD，ACADS）;SCAD缺乏症（SCAD deficiency，SCADD）;丁酰基肉碱（butyrylcarnitine，C4）;丙酰基肉碱（propionylcarnitine，C3）;美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）;

SCADD是SCAD编码基因缺陷引起血C4和尿乙基丙二酸蓄积的一种脂肪酸氧化代谢障碍疾病。1984年Turnbull等 ^[1] 首次报道了SCADD患者，早期认为SCADD是相对严重的疾病，临床表现为发育迟缓、低血糖、癫痫、肌张力低下和行为异常等。近年来随着串联质谱法新生儿疾病筛查的广泛开展，通过新生儿筛查确诊的SCADD患儿多数无临床症状 ^{[ 2- 3]} 。本文回顾性分析了北京市新生儿疾病筛查中心2014年8月至2022年3月100 603名新生儿遗传代谢病串联质谱法筛查资料，了解该病的发病率、临床特征及基因突变特点。

2014年8月至2022年3月北京市分娩并自愿接受串联质谱法筛查的100 603名活产新生儿，其中足月儿95 898名，早产儿4633名，过期产儿72名；男性52 332名，女性48 271名。遵照《新生儿疾病筛查技术规范（2010年版）》 ^[4] ，对出生72 h后并充分哺乳的新生儿采足跟血滴于S&S903采血滤纸上晾干后，送北京市新生儿筛查中心检验。监护人自愿参加新生儿筛查并签署知情同意书，研究方案通过首都医科大学附属北京妇产医院医学伦理委员会审查（IEC-B-03-V01-FJ1）。

S&S903采血滤纸为英国Whatman公司产品；ACQuity TQ Dectector三重四极杆串联质谱仪为美国Waters公司产品；TSQ 8000 Evo气相色谱-质谱联用仪为美国Thermo公司产品；高通量测序系统 Illumina NovSeq 6000为美国Illumina公司产品。新生儿非衍生化法筛查试剂盒为芬兰PerkinElmer公司产品；尿有机酸定量检测试剂为本筛查中心自制。DNA提取、文库构建、目标区域捕获试剂盒均为北京迈基诺基因科技股份有限公司产品；标准测序试剂盒为美国Illumina公司产品。

采用非衍生化串联质谱法检测游离肉碱和30种酰基肉碱的浓度水平。血C4升高（正常参考值0.1~0.5 μmol/L）伴C4/C3比值（正常参考值0.05~0.50）升高判定为初筛阳性。初筛阳性的患儿于出生后2~3周召回，进行血酰基肉碱谱、尿有机酸分析及高通量测序，并同时检测母亲血酰基肉碱谱，以排除母源性C4升高。

新鲜尿样经尿素酶、盐酸羟铵、氢氧化钠和盐酸处理，加入内标十七烷酸、二十四烷和托品酸，乙酸乙酯萃取两次，经甲基硅烷化衍生后上机检测。

采用高通量测序对可疑病例进行基因检测，并对 ACADS基因进行生物信息学分析。采集患儿及其父母外周血各2 mL（乙二胺四乙酸抗凝），选用Illumina NovSeq 6000测序平台，首先对患儿DNA标本进行相关核基因的高通量测序（由北京迈基诺基因科技股份有限公司完成）。核基因测序结果与单核苷酸多态性（dbSNP）数据库、ESP6500si数据库、千人基因组（1000 Genomes）数据库等公共数据库的资料进行比对，获得可疑的突变位点。对筛选出的致病基因位点及其父母DNA标本进行Sanger测序验证并确定其突变来源。利用SIFT、PolyPhen-2、MutationTaster、GERP++等数据库对单核苷酸多态性及插入和缺失的致病性进行预测分析，根据ACMG联合分子病理协会在2015年提出的“序列变异解读标准和指南” ^[5] 进行致病性判定。

血C4升高伴 ACADS基因纯合或复合杂合突变，或血C4及尿乙基丙二酸升高伴 ACADS基因杂合突变，以上同时排除血C4升高的母源性疾病诊断为SCADD ^{[ 3， 6]} 。

对确诊病例进行饮食指导，避免长时间禁食，如有游离肉碱减少则及时补充。间隔2~3个月进行门诊随访，监测项目包括体格检查、血酰基肉碱谱及尿有机酸分析、血糖、肝功能指标、血脂、血肌酸激酶、血常规及心脏超声和腹部超声等。5例患儿的随访时间为32.5（3.5~39.0）个月。

100 603名活产新生儿中初筛C4浓度升高或伴C4/C3比值升高196名，召回131名新生儿，确诊SCADD患儿5例，SCADD发病率为4.97/10万（1/20 121）。5例确诊患儿中，男性3例，女性2例，均为正常体重足月儿，父母非近亲婚配，否认遗传病家族史。5例患儿临床表现均无明显异常，血C4中位浓度为1.00（0.57~2.06） μmol/L，同时伴C4/C3比值[1.03（0.52~1.89）]升高；其中4例患儿乙基丙二酸均增高，为47.75（13.40~123.21） mg/g肌酐（正常值0.00~6.20 mg/g肌酐）。见 表1。

表 1 五例短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症患儿的诊断及随访情况

Table 1 The diagnosis and follow-up of 5 cases with short-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency

例序	初筛		复查	ACADS突变及致病风险	随访	转归 c
出生后时间（d）	C4 a	C4/C3比值		出生后时间（d）	C4 a	C4/C3比值	乙基丙二酸 b	月龄	C4 a	C4/C3比值	乙基丙二酸 b
1	7	1.14	1.46		23	2.06	1.89	123.21	c.1031A>G（p.Glu344Gly）（父）：Pc.1067C>T（p.Ala356Val）（母）：P	40	—	—	—	正常
2	3	0.52	0.34		32	1.00	1.03	79.07	c.391G>A（p.Gly131Ser）（父）：VUS c.989G>A（p.Arg330His） （母）：LP	38	0.75~1.68	0.58~2.10	93.73	正常
3	4	1.86	1.24		16	1.56	1.66	—	c.1031A>G（p.Glu344Gly） （父）：P c.1031A>G（p.Glu344Gly） （母）：P	33	1.62~3.09	1.69~5.42	52.90~115.45	正常
4	3	0.97	1.01		17	0.57	0.54	16.42	c.625G>A（p.G209S）（父）：VUS c.1195C>T（p.R399W）（母）：LP	19	0.51~0.68	0.32~0.52	13.64~16.22	正常
5	3	0.71	0.38		14	0.57	0.52	13.40	c.625G>A（p.G209S）（父）：VUS c.625G>A（p.G209S）（母）：VUS c.136C>T（p.R46W）（母）：P	4	0.68	0.44	—	正常

—：未检测. ^a单位为μmol/L； ^b单位为mg/g肌酐； ^c正常指患儿体格发育和智力发育均正常. 例1为电话随访，例2~5为门诊随访. 正常值范围：C4为0.1~0.5 μmol/L；C4/C3比值为0.05~0.50；乙基丙二酸为0.0~6.2 mg/g肌酐. C4：丁酰基肉碱；C3：丙酰基肉碱；ACADS：短链酰基辅酶A脱氢酶；P：致病；VUS：临床意义未明；LP：可能致病.

5例患儿检测出 ACADS基因突变7种，均为已报道错义突变；其中1例患儿（例3）为纯合突变，余均为复合杂合突变，其中例5携带来源于母亲的2种已知突变c.136C>T（p.R46W）和c.625G>A（p.G209S），以及来源于父亲的1种已知突变c.625G>A（p.G209S）。突变频率较高的为c.1031A>G（p.Glu344Gly）（3/11）和c.625G>A（p.G209S）（3/11）。突变分别来源于父母双方，Sanger测序结果与高通量测序结果一致，且符合常染色体隐性遗传规律。见 表1。

5例患儿随访年龄中位数为33（4~40）个月，除例1为电话随访外，其余4例均门诊随访，随访期间C4浓度和C4/C3比值均高于正常值。所有患儿早期确诊后均开始生活管理和喂养指导，避免饥饿。5例患儿体格发育和智力发育均正常，无临床表现；4例门诊随访患儿随访期间2例（例2和例3）出现游离肉碱降低或正常低限，伴乙基丙二酸升高，予左卡尼汀口服液对症治疗后病情稳定；1例（例4）出现肌酸激酶及其同工酶升高，但无临床表现，心脏超声和心电图检查结果均正常，予辅酶Q10和果糖二磷酸钠对症治疗半年后正常。见 表1。提示通过新生儿筛查诊断的SCADD患儿病情较轻，预后较好。

SCAD是一种同型四聚体的线粒体黄素酶蛋白，其以前体形式转运到线粒体中，并经过蛋白水解加工为成熟形式发挥作用，可以降解短链脂肪酸，属于生物酰基辅酶A脱氢酶家族。SCAD是丁酰基肉碱与己酰基肉碱线粒体β氧化脱氢的第一个催化酶，其活性缺陷引起血C4、尿乙基丙二酸及甲基琥珀酸的蓄积，导致患儿发育迟缓、语言发育落后、肌张力低下、肌病、惊厥、生长迟缓、喂养困难、昏睡和行为问题等临床表现 ^{[ 6- 7]} 。

SCADD的发病率具有种族和地域差异性，全球总发病率为1/50 000~1/35 000 ^{[ 7- 9]} 。美国、德国与澳大利亚发病率为1.05/10万（1/95 000） ^[10] ；日本广岛地区发病率为1/10万 ^[2] 。中国台湾地区发病率为0.8/10万（1/118 543） ^[11] ；浙江地区新生儿疾病筛查中心筛查1 430 024名新生儿，SCADD发病率为1.19/10万（1/84 117） ^[12] ；山东省青岛市筛查296 627名新生儿，SCADD发病率为2.36/10万（1/42 375） ^[13] 。本文资料显示北京市SCADD发病率为4.97/10万（1/20 121），高于文献报道，考虑可能与地域差异及样本量偏小有一定关系。

SCADD属于一种常染色体隐性遗传病，其致病基因 ACADS定位于染色体12q24.31，长约13 kb，含10个外显子，编码412个氨基酸；大多数患者携带纯合突变或复合杂合突变，或伴失活突变等，以错义突变为主 ^{[ 3， 7]} ，至今已报道110余种突变。欧美地区和犹太人以c.625G>A和c.511C>T突变为主 ^[14] 。日本报道了c.164C>T、c.1031A>G和c.323G>A位点 ^[2] 。国内研究显示的突变热点与日本基本一致，有别于欧美国家：浙江省报道以c.1031A>G、c.164C>T和c.991G>A多见 ^[12] ，山东省以c.1031A>G多见 ^{[ 13， 15]} 。本文资料共发现7种已知错义突变，均位于保守性结构域，突变体导致错误折叠的蛋白质在线粒体内聚集，可能具有细胞毒性而导致细胞凋亡；突变以c.1031A>G（p.Glu344Gly）和c.625G>A（p.G209S）为主。c.625G>A因在正常人群中携带率较高（正常人群数据库频率为0.264 746），ACMG指南评估为临床意义未明，目前考虑为多态性变异；但有研究显示此突变合并致病性突变时，可出现介于双等位基因多态性变异和失活突变之间的SCAD酶功能障碍而导致生化异常 ^[16] 。本文资料显示c.625G>A检出频率较高，目前携带此突变的2例患儿随访年龄小，血尿改变轻微，故此突变引起的生化表型对临床的实际影响仍需长期且大样本资料进一步评估。此外，已有研究提示纯合突变的患者尿乙基丙二酸排泄增加的发生率更高 ^[3] ，本文资料中例3的表现与报道一致。

SCADD临床表型跨度较大，从严重的婴儿期代谢性酸中毒和神经系统损害到无临床表现 ^[8] ；其临床表现与基因型及SCAD酶活性缺乏程度均无明显相关性 ^{[ 2， 8， 17]} ；多项研究对新生儿筛查确诊的SCADD患儿长期跟踪随访均未发现任何临床症状或多数无临床症状 ^{[ 3， 16- 18]} 。因为SCADD缺乏明确的临床特征，故通过筛查发现这种疾病有一定意义，不仅可以早期干预改善患儿预后，而且有助于临床与生化表型、环境影响因素的相关研究 ^[7] 。本文资料通过新生儿筛查诊断的5例患儿均进行生活管理和喂养指导，4例门诊随访至今体格和智力发育正常，未发生疾病相关临床表现；1例（例4）出现肌酸激酶及其同工酶升高情况，对症用药后改善，结合上述分析基因突变特点，同时监测血C4和尿乙基丙二酸水平，考虑心功能损害与SCADD疾病本身无关。因为该例目前监测时间较短，是否会出现代谢失调、发育迟缓、肌张力降低、惊厥和其他表现均需要进一步随访观察。

目前SCADD的治疗与其他脂肪酸氧化代谢病一致 ^{[ 9， 19]} ，主要是饮食管理，避免长时间禁食与低血糖等，急性发作期的治疗与其他脂肪酸代谢障碍类似，可给予静脉10%葡萄糖液或口服葡萄糖液抑制分解代谢。左旋肉碱可增加C4代谢从而减少尿乙基丙二酸排出，但其可行性及有效性仍须进一步证实。有研究显示，大剂量核黄素（每日10 mg/kg）能减少患者尿乙基丙二酸排出，患者临床症状改善，但停止摄入后症状复现 ^[10] ；目前国内核黄素使用经验有限，其有效性仍须进一步研究。

综上，新生儿疾病筛查可以早期诊断SCADD，经饮食干预可以有效避免新生儿饥饿等导致应激状态，减少SCADD发病。但SCADD的长期疾病管理和治疗手段仍须深入研究。

COMPETING INTERESTS

所有作者均声明不存在利益冲突