基质细胞衍生因子 1 对于血管内皮细胞增殖影响及其相关机制研究

Abstract

Objective

To investigate the role and relative mechanism of stromal cell derived factorl (SDF-1) secreted by nucleus pulposus cells (NPCs) on the proliferation of vascular endothelial cells (VECs).

Methods

The NPCs were isolated from the degenerated disc specimens after discectomy. NPCs at passage 1 were transfected with lentivirus-mediated SDF-1 over-expression; transfected and untransfected NPCs at passage 2 were cultured in the three-dimensional alvetex® scaffold, then they were co-cultured with HMEC-1 cells. The morphology of NPCs was observed by scanning electron microscope (SEM), and the apoptosis of HMEC-1 cells was detected by Annexin V/propidiumiodide staining after 72 hours co-culutre. The proliferation of HMEC-1 cells was detected by cell counting kit 8 at 12, 24, 48, and 72 hours in transfected group and untransfected group, respectively. ELISA was used to measure the vascular endothelial growth factor (VEGF) expression level. The virus transfection efficiency and relative Akt pathway were determined by Western blot.

Results

The NPCs maintained cell phenotype and secreted much extracellular matrix in three-dimensional-culture by SEM observation. In the co-culutre system, after NPCs were transfected with SDF-1 over-expression lentivirus, the proliferation of HMEC-1 cells was significantly increased, while the apoptosis was decreased obviously. The ELISA results demonstrated that the amount of VEGF was remarkably increased in the culture medium. Furthermore, SDF-1 promoted the up-regulation of phosphorylate Akt expression; after inhibition of Akt expression by GSK690693, the proliferation rate of VECs decreased significantly.

Conclusion

Over-expression of SDF-1 by NPCs is beneficial for VECs proliferation, which is involved in SDF-1-Akt signalling pathway.

健康成熟的椎间盘是人体内最大的乏血管组织，微血管只存于纤维环的外 1/3 层和上下骨终板中，而在退变的椎间盘组织中通过免疫组织化学方法可检测到大量微血管存在^[1-3]。已有研究表明^[4]，退变椎间盘中长入的新生血管可使内部髓核组织发生免疫反应，募集大量炎性因子，从而加速其退变进程。血管内皮细胞（vascular endothelial cells，VECs）被认为是新生血管的主要物质。近年来许多研究结果显示，退变的纤维环细胞可产生和分泌 VEGF，从而为新生血管的长入创造条件^[5-6]。本研究小组前期研究显示，在退变髓核组织中基质细胞衍生因子 1（stromal cell derived factorl，SDF-1）呈现高表达，且与椎间盘退变密切相关^[7]。而 Hiasa 等^[8]的研究表明，通过 SDF-1 的基因转染可在局部缺血组织中增强其血管生成和长入能力。那么在退变椎间盘中高表达的 SDF-1 是否同样起着诱导血管生成的作用，其相关机制是什么，成为本研究的重点。本研究拟通过将人退变髓核细胞（nucelus pulposus cells，NPCs）与人 VECs 共培养，检测人退变 NPCs 分泌的 SDF-1 对 VECs 增殖凋亡的影响及潜在的调控机制，为预防椎间盘退变提供新的方法学选择。

1. 材料与方法

1.1. 组织来源

实验所需标本来源于西南医科大学附属中医院骨科 8 例椎间盘突出症患者的椎间盘组织，其中男 4 例，女 4 例；年龄 31～67 岁，平均 49 岁。病变节段：L_2、3 1 例，L_3、4 2 例，L_4、5 1 例，L₅、S₁ 4 例。退变程度按 Pfirrmann 标准分级：3 级 5 例，4 级 2 例，5 级 1 例。患者术前均签署知情同意书，本研究方案获西南医科大学医学伦理委员会批准。

1.2. 主要试剂及仪器

Ⅱ型胶原酶（Sigma 公司，美国）；胰蛋白酶（北京索莱宝科技有限公司）；PBS 缓冲液、DMEM/F12 培养基（HyClone 公司，美国）；FBS（GIBCO 公司，美国）；青霉素-链霉素溶液、总蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒、5×SDS-PAGE 加样缓冲液、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒、β-actin 小鼠抗人多克隆抗体、ECL 化学发光试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；VEGF ELISA 试剂盒（RD 公司，美国）；SDF-1 小鼠抗人单克隆抗体（Abcam 公司，美国）；磷酸化 Akt（p-Akt）小鼠抗人单克隆抗体、总 Akt 小鼠抗人单克隆抗体（Cell Signaling Technology 公司，美国）；SDF-1 过表达慢病毒（上海吉凯基因化学技术有限公司）；Akt 抑制剂 GSK690693（Selleck 公司，美国）。3D 培养耗材（Alvetex 公司，美国）；37℃ 温水浴箱（金坛华荣电气成套设备厂）；电子精密天平（Radwag 公司，波兰）；超净工作台、细胞培养箱（赛默飞公司，美国）；低温高速离心机（NBS 公司，美国）；净水器（Millipore 公司，美国）；倒置相差显微镜、荧光显微镜（Nikon 公司，日本）；扫描电镜（Hitachi 公司，日本）；流式细胞仪（BD 公司，美国）；酶标仪（Tecan 公司，奥地利）；电泳仪、电泳转膜系统（北京六一生物科技有限公司）；凝胶扫描系统、FACS Vantage SE 流式细胞仪（Bio-Rad 公司，美国）。

1.3. 人退变 NPCs 原代培养

将术中摘取的椎间盘组织置于超净台中，用 PBS 缓冲液充分洗净血渍。用眼科剪和眼科镊分离出冻胶样髓核组织，置入 15 mL 离心管中，以 1∶4 体积比加入 2.5 g/L 胰蛋白酶，37℃ 消化 30 min 后，800×g 离心 10 min，弃上清；再以 1∶4 体积比加入 2 g/L Ⅱ型胶原酶，37℃ 消化约 5 h，以组织块呈絮状、逐渐消失为止。用 200 目细胞筛过滤，将取得的过滤液同上法离心获取细胞沉淀。用含 10%FBS 的 DMEM/F12 完全培养基重悬细胞沉淀，通过细胞计数后以 1×10⁵ 个/mL 密度接种于 T25 培养瓶中。于 37℃、5%CO₂ 细胞培养箱培养。3 d 左右加液，1 周左右换液，2～3 周细胞融合达 90% 左右行胰蛋白酶消化传代培养。采用Ⅱ型胶原和聚蛋白多糖（Aggrecan）细胞免疫荧光法鉴定为髓核细胞^[3]。

1.4. SDF-1 过表达慢病毒转染人退变 NPCs

取第 1 代单层培养的 NPCs 进行慢病毒转染。转染前 1 d 以 5×10⁴ 个/孔密度将 NPCs 种植于 6 孔板中，转染前 30 min 观察细胞融合度达 30%～50%，更换新鲜的完全培养基。首先将 SDF-1 过表达慢病毒原液稀释成 1×10⁶TU/mL 的病毒工作液，将 10 μL 病毒工作液和 10 μL 浓度为 50 μg/mL 的 Polybrene 混合加入 1 mL 完全培养基中，上下颠倒轻轻混匀，室温下静置 15 min，每孔加入 1 mL 上述转染复合物，感染复数约为 50（预实验得到的最佳感染复数）。72 h 后荧光显微镜观察荧光强度；Western blot 法（见 1.6.2 方法）检测转染后 SDF-1 蛋白表达，验证其转染效率，以未转染细胞为对照。SDF-1 过表达序列：上游 5'-AGGTCGA-CTCTAGAGGATCCCGCCACCATGAACGCCAAG-GTCGTG-3'；下游 5'-AGTCCATGGTGGCGACC-GGCTTGTTTAAAGCTTTCTCCAGG-3'。

1.5. 人退变 NPCs 与人 VECs 共培养

取 HMEC-1 细胞作为本实验的人 VECs，与三维培养的人退变 NPCs 共培养。具体方法：将 HMEC-1 以平面培养方式种植于 6 孔板中，将同上法转染 72 h 后的第 2 代人退变 NPCs 种植于 alvetex® 三维培养支架上，两者相互独立生长，但通用含 10%FBS 的 DMEM/F12 培养基，于 37℃、5%CO₂ 无菌细胞孵箱中共培养。共培养至检测时间点后，移除上方含 NPCs 的三维支架，采用常规胰蛋白酶消化法收集 HMEC-1 进行后续检测。以未转染慢病毒 NPCs 的共培养体系作为对照组。

1.6. 观测指标

1.6.1 扫描电镜观察　共培养 72 h 后，取出培养孔中的 alvetex® 三维培养支架材料，2.5% 戊二醛固定 30 min；PBS 缓冲液冲洗 5 min×3 次，梯度乙醇常规脱水，采用叔丁醇置换，行临界点干燥后喷金，扫描电镜观察人退变 NPCs 在 alvetex® 三维培养支架中的生长状态。

1.6.2 Western blot 检测蛋白表达　采用 RIPA 裂解液消化、提取各处理组细胞总蛋白，BCA 法检测蛋白浓度。以每孔 50 μg 的相同蛋白质量行 SDS-PAGE 凝胶电泳，电转至聚偏氟乙烯膜，转膜后用 5%BCA 封闭 1 h，加入小鼠抗人 SDF-1 单克隆抗体，小鼠抗人 p-Akt 和总 Akt 单克隆抗体。4℃ 过夜，第 2 天复温后加入二抗孵育 1 h，充分洗膜后加 ECL 显色反应。分别检测转染组、未转染组和抑制剂组（转染组中加入 GSK690693）p-Akt 和总 Akt 蛋白表达。

1.6.3 细胞凋亡检测　采用膜联蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）-PE/碘化丙啶（propidium iodide，PI）双染法检测细胞凋亡，具体方法：共培养 72 h 后，收集转染组和非转染组 HMEC-1，胰蛋白酶消化 HMEC-1 后计数细胞，取 1×10⁴ 个 HMEC-1 重悬于结合缓冲液，依次加入 AnnexinⅤ和 PI 进行标记，37℃ 孵育 1 h 后，采用流式细胞仪检测，Flowjo 软件对结果进行分析，早期凋亡细胞在 Annexin V⁺/7-AAD^- 象限，晚期凋亡细胞在 Annexin V⁺/7-AAD⁺ 象限，将这两个象限各自细胞比例相加即为总的细胞凋亡率。

1.6.4 ELISA 检测 VEGF 表达　分别取转染组和未转染组培养基 10 μL/孔加入酶标板，37℃ 孵育 90 min；加入 100 μL 生物素化抗体工作液，37℃ 孵育 60 min，洗涤 3 次；加入 100 μL 酶结合物工作液，37℃ 孵育 30 min，洗涤 5 次；加入 90 μL 底物溶液，37℃ 孵育 15 min，加入 50 μL 终止液，置于酶标仪 450 nm 波长处测量吸光度（A）值，计算 VEGF 蛋白表达量。

1.6.5 细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）法检测 HMEC-1 增殖情况　共培养 12、24、48、72 h 时检测转染组和未转染组 HMEC-1 增殖情况；为检测 Akt 信号通路对 HMEC-1 增殖的影响，在共培养体系中加入 GSK690693（抑制剂组），于 0、24 h 检测各组 HMEC-1 增殖改变。具体方法：将 NPCs 和 HCME-1 以 1∶1 比例共培养于 96 孔板中，每种细胞初始数量为 1×10⁴ 个，每小时取3 孔观察，37℃ 孵箱中培养 4 h 后显微镜观察细胞是否贴壁。经相应处理后，各时间点每孔加入 10 μL CCK-8，轻轻混匀后放入孵箱继续培养 1 h，然后在酶标仪上 450 nm 波长下测定 A 值，间接反映细胞数量。

1.7. 统计学方法

采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。数据以均数 ± 标准差表示，组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准取双侧α=0.05。

2. 结果

2.1. NPCs 鉴定和三维培养观察

细胞免疫荧光染色示Ⅱ型胶原和 Aggrecan 均呈阳性，于细胞质表达，分别呈绿色和红色荧光，细胞核未见染色。见图 1。

图 1.

Identification of human degeneration NPCs by immunofluorescence assay at 72 hours after transfection (Fluorescence microscope×200) a. Collagen type II From left to right for collagen type II, DAPI, and merge; b. Aggrecan From left to right for Aggrecan, DAPI, and merge

转染 72 h 细胞免疫荧光法鉴定人退变 NPCs（荧光显微镜 ×200） a. Ⅱ型胶原 从左至右分别为Ⅱ型胶原、DAPI、二者重合； b. Aggrecan 从左至右分别为 Aggrecan、DAPI、二者重合

为了维持 NPCs 表型，取 alvetex® 支架进行三维培养。alvetex® 三维培养支架材料的疏松孔洞直径约 50 μm，扫描电镜下在材料空隙中可见附着的人退变 NPCs，细胞呈立体球形，伸出伪足与支架材料相互黏附，细胞周围可见大量分泌的细胞外基质。见图 2。

图 2.

Three dimensional culture observation of human degeneration NPCs (Scanning electron microscope×2 000) a. Scaffold material; b. Human degeneration NPCs, cells were spherical and located in the gap of the material; c. Cell extended parapodium with adhered to scaffold materials, a large number of secreted extracellular matrix was seen around cells

人退变 NPCs 三维培养观察（扫描电镜 ×2 000） a. 支架材料； b. 人退变 NPCs，细胞呈立体球形定植于材料空隙中； c. 细胞伸出伪足与支架材料相互黏附，细胞周围可见大量分泌的细胞外基质

2.2. SDF-1 过表达慢病毒转染人退变 NPCs 效果观察

转染 72 h 后荧光显微镜观察可见明显红色荧光，Western blot 结果显示转染后 SDF-1 蛋白表达较未转染组明显上升，提示过表达慢病毒转染 NPCs 效率较高，能有效过表达 SDF-1 蛋白。见图 3。

图 3.

The transfection efficiency of SDF-1 over-expression lentivirus a. Fluorescence microscope observation at 72 hours after transfection( ×200); b. SDF-1 expression by Western blot Mr: Relative molecular mass 1: Untransfection group 2: Transfection group

SDF-1 过表达慢病毒转染效率检测 a. 转染 72 h 荧光显微镜观察（ ×200）； b. Western blot 检测 SDF-1 表达 Mr：相对分子质量 1：未转染组 2：转染组

2.3. SDF-1 过表达抑制 HMEC-1 细胞凋亡

共培养 72 h，转染组 HMEC-1 的凋亡率为 4.57%±1.52%，显著低于未转染组的 8.33%±2.14%，差异有统计学意义（t=–5.039，P=0.007）。见图 4。

图 4.

The influence of SDF-1 over-expression on HMEC-1 cell apoptosis a. Untransfection group; b. Transfection group

SDF-1 过表达对 HMEC-1 凋亡的影响 a. 未转染组； b. 转染组

2.4. ELISA 检测 VEGF 表达

共培养 72 h，转染组培养基中 VEGF 浓度为（15.4±3.7）ng/μL，显著高于未转染组的（5.3±2.5）ng/μL，比较差异有统计学意义（t=7.302，P=0.002）。

2.5. Western blot 检测 p-Akt 和总 Akt 蛋白表达

在共培养体系中，转染组 p-Akt 蛋白表达量显著高于未转染组，抑制剂组加入 GSK690693 作用后 p-Akt 表达被显著抑制；3 组总 Akt 蛋白表达量无明显差异。见图 5。

图 5.

p-Akt and total Akt protein expressions by Western blot a. Untransfection group; b. Transfection group; c. Inhibitor group

Western blot 检测各组 p-Akt 及总 Akt 蛋白表达 a. 未转染组； b. 转染组； c. 抑制剂组

2.6. CCK-8 检测细胞增殖情况

共培养 24 h 后转染组 HMEC-1 增殖情况均优于未转染组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 6。共培养 24 h，转染组 HMEC-1 增殖情况显著高于未转染组及抑制剂组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 7。

图 6.

HMEC-1 proliferation of transfection group and untransfection group by CCK-8 assay

CCK-8 法检测转染组及未转染组 HMEC-1 增殖情况

图 7.

HMEC-1 proliferation of transfection group, untransfection group, and inhibitor group at immediate and 24 hours after co-culture by CCK-8 assay

CCK-8 法检测共培养 0、24 h 转染组、未转染组及抑制剂组 HMEC-1 增殖情况

3. 讨论

SDF-1 是人体中一类重要的趋化因子，在正常生理状态下，其可以募集带有趋化因子受体 4（chemokine receptor 4，CXCR4）受体的炎性细胞或干细胞前往损伤部位，起到组织修复重建的作用。Pereira 等^[9] 将含有 SDF-1 的透明质酸凝胶置入牛椎间盘后发现，其可使 MSCs 高效聚集在椎间盘中，从而延缓椎间盘退变。但 Zhang 等^[10] 发现，在椎间盘的病理状态下，突出的椎间盘组织中 SDF-1 和 CXCR4 表达明显上升。本课题组的前期研究同样表明，SDF-1 可促进退变 NPCs 的凋亡^[7]。一个正常成熟的椎间盘内部无血管组织，其内在封闭的髓核组织成为人体内最大的抗原组织。组织学和影像学研究发现，在退变的椎间盘内部存在大量毛细血管组织，因此一旦有炎性细胞进入，将造成抗原-抗体反应，这也是椎间盘源性疼痛的一个潜在原因^[11]。如何在早期抑制血管长入，从而避免后续的免疫炎性反应成为本研究的预期目标设想。本研究结果发现，高表达的 SDF-1 有利于血管内皮细胞株 HMEC-1 的增殖，而这些调控作用或许与 NPCs 中 Akt 信号通路的激活有关。

既往研究报道 NPCs 在体外二维培养条件下容易失去细胞表型，不能真实反映体内生理病理状况。alvetex® 三维培养支架是一种高度疏松的交联聚苯乙烯支架，形成的疏松孔洞直径 36～40 μm，孔洞间的连通缝隙 12～14 μm，并被截成 200 μm 厚的薄片。它提供了一个非常合适的三维结构，细胞可在此环境里进行增殖、迁移、分化及执行各种生物学功能。细胞保持三维形态，并与相邻细胞建立更紧密的相互联系。

既往研究表明，高表达的 SDF-1 是新生血管形成的必要条件^[12-13]。因此，我们采用了退变 NPCs 和 HMEC-1 体外共培养的方式，研究退变 NPCs 中高表达 SDF-1 对于 HMEC-1 的细胞增殖影响。结果表明 SDF-1 在慢病毒转染后，荧光明显且蛋白水平表达显著增高，说明慢病毒转染成功。Jia 等^[14] 研究报道在退变椎间盘组织中 SDF-1 和 VEGF 表达密切相关，均呈现高表达。而本研究在三维共培养条件下，当 NPCs 的 SDF-1 高表达后，培养液的 VEGF 水平明显增高，提示 SDF-1 可促进 VEGF 表达增高。Chang 等^[15] 研究表明，SDF-1 在糖尿病新生血管化的发病机制中可有效促进 VEGF 水平的表达增高。本研究进一步的 CCK-8 检测表明，SDF-1 高表达后使得 HMEC-1 增殖率显著升高。由此可见，在退变椎间盘组织中 SDF-1 的高表达同样是新生毛细血管长入的潜在原因。因此，通过抑制 SDF-1 的表达从而减少新生血管在退变椎间盘中的长入，进一步抑制炎性反应，成为今后一个有潜力的治疗椎间盘退行性疾病的手段。

本研究的不足之处在于对 SDF-1 对 VEGF 表达调控机制的研究过少，我们只探讨了 SDF-1 可促进 Akt 磷酸化水平的影响，而未探讨其上下游许多关键靶点的表达情况，如 PTEN、P53 等。但基于本研究发现 SDF-1 对 HMEC-1 有较强的促增殖作用，且可显著提高局部 VEGF 的表达水平，为后续实验奠定了一定基础。其次，本研究缺少体内实验数据，我们拟在下一步实验中选取退变椎间盘犬类模型，通过局部病毒感染方式观察 SDF-1 在体内对新生血管化的确切作用及其具体机制，为椎间盘退行性疾病的治疗提供新思路。

综上述，本研究通过慢病毒介导的过表达系统靶向调控退变 NPCs 的 SDF-1 表达，利用 alvetex® 三维培养支架对于 NPCs 进行体外三维培养后再与 HMEC-1 共培养，结果显示 SDF-1 过表达后可显著提高 VEGF 的表达量，从而进一步提高 HMEC-1 增殖率。这一调控机制或许与 SDF-1-Akt 信号通路密切相关。在今后实验中，我们将进一步研究是否能够通过抑制退变椎间盘中 SDF-1 的高表达，从而抑制新生血管的长入，进而避免局部炎性反应的发生，为揭示椎间盘退行性疾病的发病机制寻找新的治疗靶点和提供新的思路。

Funding Statement

国家自然科学基金面上项目资助（81372003）

National Natural Science Foundation of China (81372003)