Skip to main content
NCBI home page
Journal of Southern Medical University logoLink to Journal of Southern Medical University
. 2022 Sep 20;42(9):1324–1334. [Article in Chinese] doi: 10.12122/j.issn.1673-4254.2022.09.08

小鼠非酒精性脂肪性肝炎早期YAP活性变化特征及其与胆管反应的时空关系

Changes of YAP activity at the early stage of nonalcoholic steatohepatitis and its spatiotemporal relationship with ductular reaction in mice

Yaxue LIU 1,b, Jia'en LIANG 1,b, Weilan ZENG 1, Yan WANG 1,*
PMCID: PMC9550545  PMID: 36210705

Abstract

Objective

To explore the changes in Yes-associated protein (YAP) activity at the early stage of nonalcoholic steatohepatitis (NASH) and the spatiotemporal relationship between YAP and ductular reaction (DR).

Methods

Male C57BL/6J mouse models of NASH were established by feeding with a methionine- and choline-deficient (MCD) diet or a thioacetamide (TAA) diet for 12 weeks. At different time points during the feeding, liver histology of the mice was observed with HE and Masson trichrome staining. The mRNA expressions of YAP and its target genes (Ctgf, Cyr61, Acta2) were determined by qPCR, and the total protein expression level of YAP was measured with immunoblotting. The expression and distribution of YAP and the markers of DR (K19 and Sox9) were observed with immunohistochemical staining.

Results

At the early stage of NASH induced by MCD diet (1 to 4 weeks), the mRNA expression of YAP and its target genes and the total protein expression of YAP increased significantly (P < 0.01). The number of YAP-positive hepatocytes reached the peak level of 90.8 (cells per ×400 field of view) at week 2 and then decreased to 30.8 at week 4 (P < 0.001); YAP-positive ductular cells appeared near the portal area, where DR began to occur. From 8 to 12 weeks, numerous K19/Sox9-positive DR cells were observed in the hepatic lobules around the central vein (P < 0.01), while only a few YAP-positive hepatocytes were present in the liver tissue (P > 0.05), and the number of YAP-positive ductular cells gradually increased with time (P < 0.001). At the early stage of NASH induced by TAA diet (3 days to 2 weeks), the mRNA expression of YAP and its target genes and the total protein expression of YAP increased significantly (P < 0.05), and the number of YAP-positive hepatocytes reached the peak of 69.2 at week 2 and then decreased to 55.2 at week 4 (P < 0.001); YAP-positive ductular cells first appeared at the initial location of DR near the central vein. From 6 to 12 weeks, numerous K19/Sox9-positive DR cells occurred in the hepatic lobules around the central vein (P < 0.01). While the number of YAP-positive hepatocytes decreased (P < 0.001), the number of YAP-positive ductular cells continued to increase (P < 0.001).

Conclusion

During the development of NASH, YAP activation occurs earlier than DR but they are spatiotemporally correlated. YAP activation in hepatocytes may participate in DR by promoting hepatocyte dedifferentiation.

Keywords: YAP, nonalcoholic steatohepatitis, ductular reaction, spatiotemporal relationship

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是以肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的慢性肝病[1]。据报道全球约有25%人口诊断为NAFLD，其中约20%NAFLD患者可能进展为NASH[2]。目前NASH已在全球范围内造成了巨大的公共卫生负担[3]。因此，探究NASH发生发展过程中的病理生理机制至关重要。Yes-相关蛋白（YAP）作为Hippo信号通路的关键分子，是肝脏发育、修复、细胞命运决定和肿瘤发生的重要调节因子[4]。YAP活性的异常增加会诱发多种肝脏疾病的发生发展[5]。在四氯化碳诱导的慢性肝损伤小鼠模型以及NASH患者肝脏组织中，YAP/TAZ/CYR61的表达与疾病严重程度呈正相关；YAP下游靶基因CYR61表达增加可募集巨噬细胞，促进肝脏炎症和纤维化的发展[6]。并且YAP激活能够促进NASH相关肝细胞癌的发生[7]。因此YAP激活在NASH疾病进展过程中具有重要作用。但是目前尚不清楚NASH早期YAP的活性变化特点。

胆管反应（DR）是一种对肝胆细胞损伤的再生修复表现，主要表现为胆管细胞增殖所致的原始小胆管形成。目前认为角蛋白19（K19）、性别决定区Y框蛋白9（Sox9）等胆管细胞标志物在肝组织中的阳性表达是DR发生的标志[8, 9]。研究报道，NASH患者肝组织中DR发生程度与肝纤维化分期显著正相关[10, 11]，且临床观察发现，NASH肝损伤进展似乎可以诱导DR发生，从而促进肝纤维发生[12]。因此，了解DR发生的分子机制对于阐明NASH病理进程有重要的参考价值。DR发生依赖于胆管样细胞的增殖，探究胆管样细胞的来源是解决DR发生的关键所在。据报道在胆汁淤积性小鼠模型中YAP活性增加能够诱导肝细胞转分化为胆管样细胞，参与DR的发生[13]。然而，尚没有研究报道在NASH疾病早期YAP是否也发挥相似的作用，并参与DR发生。

因此，本研究拟采用两种不同致病机制的NASH小鼠模型，即蛋氨酸胆碱缺乏（MCD）、硫代乙酰胺（TAA）饮食模型，系统观察NASH发生早期YAP活性改变的特点以及其分布与DR发生分布的时空关系，为探寻NASH早期病理发生机制提供新线索。

1. 材料和方法

1.1. 材料

1.1.1. 实验动物

6~8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠72只（广东省医学实验动物中心）。所有实验动物均置于SPF级环境饲养，自由进食和饮水，适应性喂养1周后开始造模实验。本研究实验动物的喂养和操作均遵循南方医科大学南方医院实验动物管理细则，并得到南方医科大学南方医院实验动物伦理委员会批准以及认可（NFYY-2020-0339）。

1.1.2. 主要试剂与仪器

蛋氨酸胆碱缺乏饲料（MCD，南通特洛菲）；硫代乙酰胺（TAA，Sigma）；苏木素伊红染色试剂盒（雷根）；YAP抗体、K19抗体、Sox9抗体（Abcam）；辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L）、DAB显色液（中杉金桥）；RNAiso Plus、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa）；5% BSA、RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂（PMSF）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天）。NanoDrop 2000紫外分光光度计（NanoDrop）；实时荧光定量PCR仪（罗氏）；组织研磨仪（上海净信）；Wes全自动蛋白质定量检测仪（ProteinSimple）；正置明场显微镜（Lecia）。

1.2. 方法

1.2.1. NASH小鼠模型建立

C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组、MCD组、TAA组。正常对照组：普通饲料和饮用水，分别于3 d、1周、2周、4周、6周、8周、12周随机选取3只收集肝组织；MCD组：蛋氨酸胆碱缺乏饲料（除蛋氨酸、胆碱缺乏外，含40%蔗糖和10%脂肪[14]）和饮用水，分别于1、2、4、8、12周随机选取3只收集肝组织；TAA组：普通饲料和含300 mg/L硫代乙酰胺[15]的饮用水，分别于3 d、1周、2周、4周、6周、12周随机选取3只收集肝组织。

1.2.2. 肝组织病理学评价

对正常对照组、MCD组、TAA组各时间点的肝组织进行常规的HE染色[16]和Masson染色[17]评估肝组织病理学改变以及纤维化情况；按照肝脏脂肪变性、活动度、纤维化评分系统（SAF）[18]和Ishak评分系统[19]，进行活动度（A）和纤维化（F）评分。肝纤维化是NASH进展期的标志。将A < 2且F≤1定义为NASH疾病早期，A≥2且F > 1定义为NASH疾病进展期[20]。肝组织学分析由两名专业的病理科医生完成。

1.2.3. 蛋白质免疫印迹

将20 mg肝组织置于1.5 mL离心管，加入200 μL裂解液（RIPA裂解液加入终浓度为1 mmol/L蛋白酶抑制剂PMSF），使用组织研磨仪匀浆（60 Hz，60 s，2次），4 ℃，12 000 r/min，离心15 min，吸取上清至新1.5 mL离心管；按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书测定样本蛋白浓度；使用WES全自动蛋白定量检测仪测定YAP蛋白表达量[21]。

1.2.4. 实时荧光定量PCR

使用RNAiso Plus试剂盒提取肝组织总RNA；使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒进行反转录反应；按照TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR检测YAP及其靶基因（Ctgf、Cyr61、Acta2）的mRNA水平。引物序列：YAP上游引物序列：5'-ACCCTCGTTTTGCCATGAAC-3'，下游引物序列：5'-TGTGCTGGGATTGATATTCCGTA-3'；Ctgf上游引物序列：5'-GACCCAAC TATGATGCGAGCC-3'，下游引物序列：5'-CCCATCCCACAGGTCTTAGAAC-3'；Cyr61上游引物序列：5'-CTGCGCTAAACAACTCAACGA-3'，下游引物序列：5'-GCAGATCCCTTTCAGAGCGG-3'；Acta2上游引物序列：5'-GTCCCAGACATCAGGGAGTAA-3'，下游引物序列：5'-TCGGATACTTCAGCGTCAGGA-3'。以上引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。以Gapdh为内参，采用2-△△Ct法计算目的基因相对表达量。

1.2.5. 免疫组化

免疫组化检测YAP、K19、Sox9的表达；其中K19和Sox9为DR鉴定标志物之一。步骤如下：肝组织石蜡切片4 μm，65 ℃烘箱烤片2 h；二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，枸橼酸盐溶液进行微波抗原修复；3%过氧化氢溶液浸泡10 min；5% BSA室温封闭1 h；滴加一抗抗体（YAP、K19和Sox9）；4 ℃过夜孵育。次日，PBS浸洗3次（3 min/次）；加入辣根过氧化酶标记的二抗，室温孵育1 h，PBS浸洗3次（3 min/次）；DAB显色；细胞核复染；明场显微镜下观察。肝细胞细胞核呈YAP阳性染色为YAP阳性肝细胞，胞质与胞核均呈YAP阳性染色且具有胆管样细胞形态的细胞为YAP阳性胆管样细胞，胞质与胞核均呈K19阳性染色和Sox9阳性染色的胆管细胞为K19阳性DR细胞、Sox9阳性DR细胞。每张切片随机选取3个视野（×400）后，用Image J图像处理软件计数该视野下YAP阳性肝细胞、YAP阳性胆管样细胞以及K19阳性、Sox9阳性DR细胞的个数[22]。

1.3. 统计学分析

利用GraphPad Prism 8.3软件进行数据分析以及可视化处理。每组实验动物的数量为3只，实验重复3次，所有实验数据用均数±标准差表示，组间差异比较采用t检验、One-way ANOVA和Two-way ANOVA等方法分析，组间多重比较在方差齐性时采用Bonferroni方法，方差不齐性时采用Dunnett T3方法。双侧P < 0.05为差异具有统计学意义。

2. 结果

2.1. NASH疾病模型的肝组织病理学改变

HE染色显示正常对照组小鼠肝组织形态结构正常，无明显肝细胞脂肪变性以及炎性细胞浸润（图 1A、2A）。MCD组1周表现NASH病理特点，小鼠肝组织中5%~33%肝细胞出现脂肪变（病理学评分为1.0）、少量肝细胞气球样变（病理学评分为0.6）并伴有炎症（病理评分为1.0）（图 1B、G）。与正常对照组相比，MCD组1、2、4周肝纤维化评分无显著性差异，8、12周出现明显的肝纤维化（P < 0.01，图 1B~H）。因此，划分MCD组1~4周为MCD组NASH疾病早期，8~12周为MCD组NASH疾病进展期。

图 1.

图 1

Open in a new tab

MCD组小鼠肝脏病理学改变以及病理评分

HE staining of mouse liver tissue in control group (A) and MCD (methionine- and choline-deficient) group at 1 week (B), 2 weeks (C), 4 weeks (D), 8 weeks (E), and 12 weeks (F) and histology score (G) and fibrosis score (H) of mice in MCD group (Green arrow: Steatosis; blue arrow: Hepatocyte ballooning; black arrow: Inflammation. Original magnification: ×200). **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control.

图 2.

图 2

Open in a new tab

TAA组小鼠肝脏病理学改变以及病理评分

HE staining of mouse liver tissue in control group (A) and TAA (thioacetamide) group at 3 days (B), 2 weeks (C), 4 weeks (D), 6 weeks (E), 12 weeks (F) and histology score (G) and fibrosis score (H) of mice in TAA group (Green arrow: Steatosis; Black arrow: Inflammation. ×200). **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control.

TAA组在第3天表现NASH病理特点，小鼠肝组织中央静脉区域33%以上肝细胞出现脂肪变（病理学评分为1.8）、少量肝细胞气球样变（病理学评分为0.4）并伴有较明显的炎性细胞浸润和坏死灶（病理评分为2.4）（图 2B、G）。与正常对照组相比，TAA组3 d~2周小鼠肝纤维化评分无显著性差异，4、6、12周均出现明显纤维化（P < 0.01，图 2B~H）。因此，划分TAA组3 d~2周为TAA组NASH疾病早期，4~12周为TAA组NASH疾病进展期。

2.2. NASH疾病早期肝组织中YAP表达和活性变化

免疫组化结果显示，正常对照组小鼠肝组织中除汇管区胆管上皮细胞内呈现YAP阳性染色以外，肝细胞内几乎没有YAP表达（图 3A、E；图 4A、E）。在MCD组和TAA组的NASH疾病早期小鼠肝组织中肝细胞内YAP活性显著增加，表现为YAP的表达量增多且多位于细胞核（图 3B~D、F；4B~D、F）。与正常对照组相比，MCD组NASH早期（1、2、4周）小鼠肝组织中YAP阳性肝细胞数量增加（P < 0.001），且在2周达到峰值后逐渐减少（图 3G）。与正常对照组相比，TAA组NASH早期（3 d、1周、2周）小鼠肝组织中YAP阳性肝细胞数量增加（P < 0.001），于2周时达到峰值（图 4G），并且YAP阳性染色范围由中央静脉区域向整个肝小叶逐渐扩大（图 4B~D）。

图 3.

图 3

Open in a new tab

MCD组NASH早期(1~4周)小鼠肝组织中YAP的表达与分布

Expression and distribution of YAP in the liver tissue of the mice at 1 week to 4 weeks of NASH development in MCD group. YAP immunohistochemical staining of the liver tissue in control group (A) and MCD group at 1 week (B), 2 weeks (C), and 4 weeks (D). G: Number of YAP-positive hepatocytes at the early stage (1-4 weeks) of NASH in MCD group (×100) (A-D), (×400) (E, F). ***P < 0.001 vs control.

图 4.

图 4

Open in a new tab

TAA组NASH早期(3 d~2周)小鼠肝组织中YAP的表达与分布

Expression and distribution of YAP in the liver tissue of the mice at the early stage (3 days to 2 weeks) of NASH in TAA group. YAP immunohistochemical staining of liver tissue in control group (A) and TAA group at 3 days (B), 1 week (C), and 2 weeks (D). G: Changes in the number of YAP-positive hepatocytes at the early stage (3 days to 2 weeks) of NASH in TAA group (×100) (A-D), (×400) (E, F). ***P < 0.001 vs control.

qPCR结果显示，与正常对照组相比，MCD组NASH早期（1、2、4周）小鼠肝组织中YAP及其下游靶基因的mRNA相对表达量增加（P < 0.01，图 5A）。TAA组NASH早期（1、2周）小鼠肝组织中YAP及其下游靶基因的mRNA相对表达量增加（P < 0.05，图 5B）。与正常对照组相比，两个模型组NASH疾病早期肝组织YAP及其下游靶基因mRNA水平均增加。

图 5.

图 5

Open in a new tab

NASH早期小鼠肝组织YAP及其靶基因mRNA表达水平

The mRNA expression levels of YAP and its target genes in the liver tissue of the mice at the early stage of NASH in MCD (A) and TAAgroup (B). *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control.

蛋白质免疫印迹结果显示，正常对照组小鼠肝组织YAP总蛋白表达量较低，其蛋白特征性峰面积为1385（图 6A、B）。在NASH早期诱导阶段，与正常对照组相比，MCD组1、2、4周小鼠肝组织YAP总蛋白表达量增加（P < 0.001），2周达到最高值后降低（图 6A）；与正常对照组相比，TAA组3 d、1周、2周小鼠肝组织YAP总蛋白表达量增加（P < 0.001，图 6B）。

图 6.

图 6

Open in a new tab

NASH疾病早期小鼠肝组织YAP总蛋白表达水平

Protein expression level of YAP in the liver tissue of the mice at the early stage of NASH in MCD (A) and TAAgroup (B). ***P < 0.001 vs control.

2.3. NASH小鼠模型肝组织表现出广泛的胆管反应

DR标志物分子（K19和Sox9）的免疫组化染色结果显示，在正常对照组小鼠肝组织中只有汇管区胆管上皮细胞呈现K19阳性染色和Sox9阳性染色，数量分别为18.8、30.17/×400视野（图 7A、E；图 8A、E）。在NASH疾病模型诱导阶段，MCD组4周小鼠肝组织汇管区周围K19/Sox9阳性DR细胞略有增加（图 7B、F），但与对照组相比差异无统计学意义（图 7I、J）；8周、12周肝组织中央静脉周围的肝小叶区域K19/Sox9阳性DR细胞数量以及管状结构显著增多（P < 0.01，图 7C、D、I，P < 0.001，图 7G、H、J）。

图 7.

图 7

Open in a new tab

MCD组NASH小鼠肝组织K19/Sox9阳性DR细胞的表达与分布

Expression and distribution of K19/Sox9-positive DR cells in the liver tissue of the mice in MCD group. K19/Sox9 immunohistochemical staining of liver tissue in control group (A, E) and MCD group at 4 weeks (B, F), 8 weeks (C, G), and 12 weeks (D, H). I, J: Changes of the number of K19/Sox9-positive DR cells in MCD group (×200). **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control.

图 8.

图 8

Open in a new tab

TAA组NASH小鼠肝组织K19/Sox9阳性DR细胞的表达与分布

Expression and distribution of K19/Sox9-positive DR cells in the liver tissue of the mice in TAA group. A-H: K19/Sox9 immunohistochemical staining of liver tissue in control group (A, E) and TAA group at 4 weeks (B, F), 6 weeks (C, G), 12 weeks (D, H). I, J: Number of K19/Sox9-positive DR cells in TAAgroup (×200). **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control.

TAA组4周小鼠肝组织中央静脉周围出现K19/Sox9阳性DR细胞（图 8B、F），但与正常对照组相比差异无统计学意义（图 8I、J）；6周、12周肝组织中的K19/Sox9阳性DR细胞数量以及管状结构不断增加分布于整个肝小叶中（P < 0.01，图 8C、D、I；P < 0.001，图 8G、H、J）。

2.4. NASH疾病模型早期YAP激活与DR发生的时空关系

通过比较MCD、TAA饮食诱导NASH疾病早期YAP激活时间以及DR发生时间，发现MCD组和TAA组小鼠肝组织中的YAP活性增加时间：MCD组1周、2周（图 3B、C、图 5A，图 6A），TAA组3 d、1周、2周（图 4B~D、图 5B、图 6B），均早于DR发生的时间：MCD组4周、8周、12周（图 7B~D、F~H），TAA组4、6、12周（图 8B~D、F~H）。

进一步观察MCD组和TAA组NASH疾病进展过程中肝细胞内YAP激活与DR发生的时空关系，发现正常对照组小鼠肝组织中只有汇管区胆管上皮细胞呈YAP阳性染色，数量为9.8/×400视野（图 9A、E；图 10A、E）。在NASH疾病早期诱导阶段，MCD组2周小鼠肝组织中YAP阳性肝细胞数量增加至峰值90.8/×400视野（P < 0.001）后持续减少（图 3C，9E），4周肝组织汇管区DR开始发生时，YAP阳性肝细胞数量减少（P < 0.001），并且在汇管区出现了YAP阳性胆管样细胞（图 9B、E）；NASH疾病进展期，8周、12周小鼠肝组织中央静脉周围的肝小叶区域表现出广泛的DR（图 7C、D、G、H），同时中央静脉周围的肝小叶区域的YAP阳性肝细胞继续减少，YAP阳性胆管样细胞数量进一步增加（P < 0.001），并且发现大量的由YAP阳性胆管样细胞组成的管状结构（图 9C~E）。

图 9.

图 9

Open in a new tab

MCD组NASH疾病进展过程中，YAP激活与DR发生的时空和数量关系

Spatiotemporal and quantitative relationship between YAP activation and DR during NASH development in MCD group. A-D: YAP immunohistochemical staining of the liver tissue in control group (A) and MCD group at 4 weeks (B), 8 weeks (C), and 12 weeks (D). E: The number of YAP-positive hepatocytes first increased and then decreased, followed by the amplification of YAP-positive ductular cells and the development of DR in MCD group. Black arrow: YAP-positive ductular cells (×200). **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control.

图 10.

图 10

Open in a new tab

TAA组NASH疾病进展过程中，YAP激活与DR发生的时空和数量关系

Spatiotemporal and quantitative relationship between YAP activation and DR during NASH development in TAA group. A-D: YAP immunohistochemical staining of the liver tissue in control group (A) and TAA group at 4 weeks (B), 6 weeks (C), and 12 weeks (D). E: Number of YAP-positive hepatocytes first increased and then decreased, followed by the amplification of YAP-positive ductular cells and the development of DR in TAA group. Black arrow: YAP-positive ductular cells (×200). **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control.

在NASH疾病早期诱导阶段，TAA组2周小鼠肝组织YAP阳性肝细胞数量增加至峰值69.2/×400视野（P < 0.001）后持续减少（图 4D；图 10E）；在NASH疾病进展期，TAA组4周小鼠肝组织中央静脉区域周围DR开始发生时，同样YAP阳性肝细胞数量开始减少（P < 0.001），并且在中央静脉区出现了YAP阳性胆管样细胞（图 10B、E）；6、12周小鼠肝组织整个肝小叶区域表现出广泛的DR时（图 8C、D、G、H），位于肝小叶区域YAP阳性肝细胞数量继续减少（P < 0.001），YAP阳性胆管样细胞数量进一步增加（P < 0.001），并且观察到大量的由YAP阳性胆管样细胞组成的管状结构（图 10C~E）。

3. 讨论

NASH作为一种严重的NAFLD形式已成为肝衰竭、肝移植的重要原因之一[23]。然而，目前美国食品药品监督管理局尚未批准用于治疗NASH的特定药物，部分原因是对NASH疾病各个时期潜在的病理生理机制不完全了解。因此，探索NASH疾病早期的病理特征，对NASH治疗或长期预后具有重要意义。YAP是一种具有高度保守性的转录共激活因子，由于缺少DNA结合结构域，YAP需与其他转录因子结合，共同调控下游靶基因的转录，从而促进细胞增殖以及减少细胞凋亡等[24]。生理条件下，肝组织中的YAP活性受到抑制，主要以磷酸化形式滞留在细胞质中或被降解，参与维持成年肝脏正常组织形态和生理功能[25, 26]。然而，在NAFLD疾病动物模型以及NASH患者肝脏中均发现YAP活性异常增加，并且YAP活性的增加与疾病的严重程度成正相关关系；如在高脂饮食诱导的NAFLD猴子肝组织中YAP主要在肝细胞以及胆管细胞的细胞核中表达，并且YAP活性增加与NAFLD活动度评分呈正相关[27]。在纤维化NASH患者肝组织中发现YAP在反应性管状细胞（RDC）的细胞核、细胞质中均有表达，但在细胞核的表达更显著，并且YAP表达水平与肝损伤指标（肝细胞气球样变、肝小叶炎症）呈正相关[28]。这些研究表明YAP活性的异常增加参与了NASH疾病的发生发展，然而在饮食诱导的NASH疾病早期中YAP活性变化及其特点尚未报道。本研究在组织学观察发现，与正常对照组相比，MCD组和TAA组NASH疾病早期小鼠肝组织中肝细胞内YAP的表达量明显增多且多位于细胞核。同时，这两种饮食诱导NASH早期小鼠肝组织中YAP及其下游靶基因（Ctgf、Cyr6和Acta2）的mRNA水平和YAP蛋白表达量显著增加。因此，这些结果提示YAP活性在MCD和TAA饮食诱导NASH疾病早期肝组织中均显著增加。

DR表现为表达胆管细胞标志物（如K19和Sox9等）的细胞从汇管区扩展到肝小叶中[9]。DR不仅常见于胆道疾病，也存在于包括NAFLD、肝细胞肝癌在内的各种肝脏疾病中[8]。在NASH患者中，DR程度与NAS评分、纤维化阶段和门静脉炎症程度密切相关[10, 12, 29]，提示DR与NASH的疾病进展之间存在相关性。此外，研究证实YAP活性的增加能够调控各类胆道疾病中DR的发生，如：在原发性硬化性胆管炎和原发性胆汁性肝硬化患者的肝脏中发现YAP在DR细胞中表达；并且肝脏特异性YAP基因的敲除可显著降低胆管结扎所致的胆汁淤积小鼠肝脏中的DR[30]。此外，有研究也发现肝细胞YAP基因特异性敲除可导致3，5-二乙氧基羰基-1，4-二氢可乐定（DDC）诱导的胆汁淤积性肝损伤小鼠肝组织中的DR显著减少[31]。这表明YAP活性是DR发生所必需的。然而在NASH早期病理生理条件下YAP激活与DR发生的关系目前尚不明确。

本研究采用免疫组化检测了DR相关的分子标志物K19和Sox9的表达，发现MCD和TAA小鼠肝组织YAP活性增加的初始时间（MCD组1周；TAA组3 d）早于DR发生的初始时间（MCD组4周；TAA组4周）。因此，我们推测YAP的激活可能是DR发生的关键。此外，对K19/Sox9和YAP免疫染色的时空分析表明，在MCD小鼠中，4周时YAP阳性胆管样细胞和DR细胞开始出现在汇管区，随后在8、12周时二者均扩散到中央静脉区域。在TAA小鼠中，4周时YAP阳性胆管样细胞和DR细胞开始出现在中央静脉区，随后在6、12周时二者向中央静脉周围的肝小叶延伸。因此，我们发现在MCD以及TAA饮食诱导的NASH疾病进展过程中，YAP阳性胆管样细胞和DR细胞几乎同时出现，并且分布区域高度重合。与我们的结果相似，有研究在四氯化碳诱导的肝损伤小鼠模型中观察到DR细胞以及YAP阳性细胞均分布在汇管区周围的肝小叶中[32]。有研究发现在NASH患者以及小鼠模型中，当DR由汇管区扩散到周围的肝小叶中时，YAP阳性RDC也出现在肝小叶中，并且YAP阳性RDC的数量与K19阳性细胞的数量密切相关[28]。提示在NASH疾病进展过程中YAP的活性变化特征及其分布与DR发生分布位置具有时空相关关系。

DR的细胞起源一直备受争议。胆管细胞的增殖、肝祖细胞的激活和增殖以及肝细胞的转分化均可为DR发生提供细胞来源。据报道，YAP通路参与调节DR细胞命运[33]。本研究发现YAP激活与DR具有时空相关性，这让我们思考YAP如何控制DR。在MCD饮食诱导的NASH早期，2周时YAP主要在肝细胞核中表达，4周时YAP阳性肝细胞开始逐渐减少，YAP阳性胆管样细胞首先出现在DR发生的初始位置，即汇管区周围；在NASH进展期（8~12周），YAP阳性肝细胞数量继续减少，而YAP阳性胆管样细胞数量进一步增加，并分布在中央静脉周围的肝小叶中，与DR细胞的分布一致。在TAA饮食诱导的NASH早期，2周时YAP主要在肝细胞核中表达；在NASH进展期（4~12周），4周时YAP阳性肝细胞开始逐渐减少，YAP阳性胆管样细胞首先出现在DR发生的初始位置，即中央静脉区域，6、12周时YAP阳性肝细胞数量继续减少，而YAP阳性胆管样细胞数量进一步增加，并分布在中央静脉周围的肝小叶中，与DR细胞的分布一致。提示在MCD以及TAA小鼠中，4周时肝细胞中的YAP激活可能会诱导肝细胞转分化胆管细胞并参与DR的发生发展。

与我们的结果相似，近年来肝细胞转分化被认为是DR的重要细胞来源。Nf2（YAP上游负性调控因子）肝细胞特异性敲除小鼠的谱系追踪显示，肝细胞内的YAP激活可诱导肝细胞转分化为YAP阳性胆管细胞[33]。在胆汁淤积性小鼠模型中YAP活性持续激活能够诱导肝细胞转分化为胆管样细胞，参与DR发生[13, 31]。此外，有研究发现在MCD饮食诱导的NASH小鼠模型中Notch通路的激活可介导肝细胞向胆管样细胞转化，促进DR发生[34]。而Notch信号通路可作为YAP的下游效应器调控肝细胞转分化为胆管样细胞[33]。因此，我们推测在MCD和TAA饮食诱导的NASH小鼠模型中，YAP在肝上皮细胞的活性改变特征及其分布与DR发生分布的这种时空关系可能为YAP激活介导肝细胞转分化为胆管样细胞并参与DR发生提供依据。

综上所述，本研究发现在NASH疾病早期肝细胞内YAP激活并早于DR发生；另外YAP在肝上皮细胞活性改变特点及其分布与DR发生分布具有时空相关关系，同时肝细胞内YAP的激活可能诱导肝细胞转分化为胆管样细胞，参与DR发生。但本研究仅在动物模型中研究NASH疾病早期YAP活性变化特征及其与DR的时空关系，还需结合体外实验确定肝细胞内YAP和DR表型分子的表达与分布情况，进一步探究这种时空关系演变的分子机制。

Biographies

刘雅雪，在读硕士研究生，E-mail: lyx13280555196@163.com

梁嘉恩，硕士，E-mail: 472719760@qq.com

Funding Statement

国家自然科学基金(82070589, 81670522); 南方医科大学南方医院院长基金(2018Z016), 深圳市三名工程项目(SZSM201911001)

Supported by National Natural Science Foundation of China (82070589, 81670522)

Contributor Information

刘 雅雪 (Yaxue LIU), Email: lyx13280555196@163.com.

梁 嘉恩 (Jia'en LIANG), Email: 472719760@qq.com.

汪 艳 (Yan WANG), Email: yanwang@smu.edu.cn.

References

  • 1.Sanyal AJ, Brunt EM, Kleiner DE, et al. Endpoints and clinical trial design for nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 2011;54(1):344–53. doi: 10.1002/hep.24376. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 2.Younossi ZM, Koenig AB, Abdelatif D, et al. Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment of prevalence, incidence, and outcomes. Hepatology. 2016;64(1):73–84. doi: 10.1002/hep.28431. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 3.Tian Y, Yang B, Qiu WN, et al. ER-residential Nogo-B accelerates NAFLD-associated HCC mediated by metabolic reprogramming of oxLDL lipophagy. Nat Commun. 2019;10(1):3391–8. doi: 10.1038/s41467-019-11274-x. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 4.Nguyen Q, Anders RA, Alpini G, et al. Yes-associated protein in the liver: Regulation of hepatic development, repair, cell fate determination and tumorigenesis. Dig Liver Dis. 2015;47(10):826–35. doi: 10.1016/j.dld.2015.05.011. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 5.Patel SH, Camargo FD, Yimlamai D. Hippo signaling in the liver regulates organ size, cell fate, and carcinogenesis. Gastroenterology. 2017;152(3):533–45. doi: 10.1053/j.gastro.2016.10.047. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 6.Mooring M, Fowl BH, Lum SZC, et al. Hepatocyte stress increases expression of yes-associated protein and transcriptional coactivator with PDZ-binding motif in hepatocytes to promote parenchymal inflammation and fibrosis. Hepatology. 2020;71(5):1813–30. doi: 10.1002/hep.30928. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 7.Jeong SH, Kim HB, Kim MC, et al. Hippo-mediated suppression of IRS2/AKT signaling prevents hepatic steatosis and liver cancer. J Clin Invest. 2018;128(3):1010–25. doi: 10.1172/JCI95802. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 8.Sato K, Marzioni M, Meng FY, et al. Ductular reaction in liver diseases: pathological mechanisms and translational significances. Hepatology. 2019;69(1):420–30. doi: 10.1002/hep.30150. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 9.Ko S, Russell JO, Molina LM, et al. Liver progenitors and adult cell plasticity in hepatic injury and repair: knowns and unknowns. Annu Rev Pathol. 2020;15:23–50. doi: 10.1146/annurev-pathmechdis-012419-032824. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 10.Gadd VL, Skoien R, Powell EE, et al. The portal inflammatory infiltrate and ductular reaction in human nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 2014;59(4):1393–405. doi: 10.1002/hep.26937. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 11.Zhao L, Westerhoff M, Pai RK, et al. Centrilobular ductular reaction correlates with fibrosis stage and fibrosis progression in non-alcoholic steatohepatitis. Mod Pathol. 2018;31(1):150–9. doi: 10.1038/modpathol.2017.115. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 12.Richardson MM, Jonsson JR, Powell EE, et al. Progressive fibrosis in nonalcoholic steatohepatitis: association with altered regeneration and a ductular reaction. Gastroenterology. 2007;133(1):80–90. doi: 10.1053/j.gastro.2007.05.012. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 13.Planas-Paz L, Sun TL, Pikiolek M, et al. YAP, but not RSPO-LGR4/5, signaling in biliary epithelial cells promotes a ductular reaction in response to liver injury. Cell Stem Cell. 2019;25(1):39–53. doi: 10.1016/j.stem.2019.04.005. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 14.Farrell G, Schattenberg JM, Leclercq I, et al. Mouse models of nonalcoholic steatohepatitis: toward optimization of their relevance to human nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 2019;69(5):2241–57. doi: 10.1002/hep.30333. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 15.Wallace MC, Hamesch K, Lunova M, et al. Standard operating procedures in experimental liver research: thioacetamide model in mice and rats. Lab Anim. 2015;49(1 Suppl):21–9. doi: 10.1177/0023677215573040. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 16.Fischer AH, Jacobson KA, Rose J, et al. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008;2008:4986–93. doi: 10.1101/pdb.prot4986. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 17.Xu AL, Zhong GZ, Wang JW, et al. microRNA 200a inhibits liver fibrosis of Schistosoma. Bioengineered. 2021;12(1):4736–46. doi: 10.1080/21655979.2021.1950441. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 18.Bedossa P, Poitou C, Veyrie N, et al. Histopathological algorithm and scoring system for evaluation of liver lesions in morbidly obese patients. Hepatology. 2012;56(5):1751–9. doi: 10.1002/hep.25889. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 19.Ishak K, Baptista A, Bianchi L, et al. Histological grading and staging of chronic hepatitis. J Hepatol. 1995;22(6):696–9. doi: 10.1016/0168-8278(95)80226-6. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 20.Bedossa P, Consortium FLIPP. Utility and appropriateness of the fatty liver inhibition of progression (FLIP) algorithm and steatosis, activity, and fibrosis (SAF) score in the evaluation of biopsies of nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 2014;60(2):565–75. doi: 10.1002/hep.27173. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 21.Wang JY, Valdez A, Chen YC. Evaluation of automated Wes system as an analytical and characterization tool to support monoclonal antibody drug product development. J Pharm Biomed Anal. 2017;139:263–8. doi: 10.1016/j.jpba.2016.12.024. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 22.Schindelin J, Arganda-Carreras I, Frise E, et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 2012;9(7):676–82. doi: 10.1038/nmeth.2019. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 23.Younossi Z, Stepanova M, Ong JP, et al. Nonalcoholic steatohepatitis is the fastest growing cause of hepatocellular carcinoma in liver transplant candidates. Clin Gastroenterol Hepatol. 2019;17(4):748–55. doi: 10.1016/j.cgh.2018.05.057. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 24.Johnson R, Halder G. The two faces of Hippo: targeting the Hippo pathway for regenerative medicine and cancer treatment. Nat Rev Drug Discov. 2014;13:63–79. doi: 10.1038/nrd4161. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 25.Dong JX, Feldmann G, Huang JB, et al. Elucidation of a universal size-control mechanism in Drosophila and mammals. Cell. 2007;130(6):1120–33. doi: 10.1016/j.cell.2007.07.019. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 26.Camargo FD, Gokhale S, Johnnidis JB, et al. YAP1 increases organ size and expands undifferentiated progenitor cells. Curr Biol. 2007;17(23):2054–60. doi: 10.1016/j.cub.2007.10.039. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 27.Chen P, Luo QH, Huang C, et al. Pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease mediated by YAP. Hepatol Int. 2018;12(1):26–36. doi: 10.1007/s12072-017-9841-y. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 28.Machado MV, Michelotti GA, Pereira TA, et al. Accumulation of duct cells with activated YAP parallels fibrosis progression in nonalcoholic fatty liver disease. J Hepatol. 2015;63(4):962–70. doi: 10.1016/j.jhep.2015.05.031. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 29.Carpino G, Nobili V, Renzi A, et al. Macrophage activation in pediatric nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) correlates with hepatic progenitor cell response via Wnt3a pathway. PLoS One. 2016;11(6):e0157246–53. doi: 10.1371/journal.pone.0157246. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 30.Bai HB, Zhang NL, Xu Y, et al. Yes-associated protein regulates the hepatic response after bile duct ligation. Hepatology. 2012;56(3):1097–107. doi: 10.1002/hep.25769. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 31.Pepe-Mooney BJ, Dill MT, Alemany A, et al. Single-cell analysis of the liver epithelium reveals dynamic heterogeneity and an essential role for YAP in homeostasis and regeneration. Cell Stem Cell. 2019;25(1):23–38. doi: 10.1016/j.stem.2019.04.004. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 32.Jin LF, Huang HR, Ni J, et al. Shh-Yap signaling controls hepatic ductular reactions in CCl4-induced liver injury. Environ Toxicol. 2021;36(2):194–203. doi: 10.1002/tox.23025. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 33.Yimlamai D, Christodoulou C, Galli GG, et al. Hippo pathway activity influences liver cell fate. Cell. 2014;157(6):1324–38. doi: 10.1016/j.cell.2014.03.060. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 34.Morell CM, Fiorotto R, Meroni M, et al. Notch signaling and progenitor/ductular reaction in steatohepatitis. PLoS One. 2017;12(11):e0187384. doi: 10.1371/journal.pone.0187384. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

Articles from Journal of Southern Medical University are provided here courtesy of Editorial Department of Journal of Southern Medical University

RESOURCES