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. 2022 Jul 28;119(4):544–550. [Article in Portuguese] doi: 10.36660/abc.20210797
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O Nível de Endocan Sérico pode ser Usado como Biomarcador para Prever Aterosclerose Subclínica em Pacientes Pré-Diabéticos?

Yucel Arman 1, Adem Atici 2, Ozgur Altun 1, Remzi Sarikaya 3, Sengül Aydin Yoldemir 4, Murat Akarsu 5, Orkide Kutlu 1, Guzin Zeren Ozturk 6, Pinar Demir 1, Mustafa Ozcan 1, Recep Yilmaz Bayraktarli 7, Tufan Tukek 8
PMCID: PMC9563878  PMID: 35946756

Resumo

Fundamento

Pacientes pré-diabéticos têm um risco aumentado de doença cardiovascular aterosclerótica, e, portanto, a detecção precoce é importante.

Objetivo

Nosso estudo teve o objetivo de revelar a usabilidade dos níveis de endocan sérico como biomarcador no diagnóstico de aterosclerose subclínica em pacientes pré-diabéticos, com base em medições de EIMC.

Métodos

Os participantes foram classificados de acordo com a presença (n=42) ou ausência (n=42) de pré-diabetes. Os valores de endocan sérico, glicemia em jejum, insulina em jejum e hemoglobina glicada (HbA1c) dos pacientes foram examinados e a EIMC foi medida. O nível de significância para a análise estatística foi 0,05.

Resultados

Apesar de se ter determinado que os níveis de endocan sérico são mais baixos em pacientes pré-diabéticos em comparação com o grupo de controle (p=0,042), determinou-se que os valores de EIMC são mais altos (p=0,046). A avaliação do endocan sérico por análise regressiva multivariada detectou que seu nível estava associado à EIMC, independentemente de outros parâmetros (p=0,007). Encontramos uma correlação negativa entre insulina plasmática em jejum e níveis de endocan (r=-0,320, p=0,001).

Conclusões

Este estudo demonstrou que a espessura íntima-média de carótida é mais alta e o nível de endocan sérico é mais baixo em pacientes pré-diabéticos. Os níveis de endocan sérico diminuídos em pacientes pré-diabéticos podem ser um fator que contribui para os mecanismos de formação de aterosclerose.

Keywords: Aterosclerose, Espessura Íntima-Media Carotídea, Estado Pré-Diabético

Introdução

O pré-diabetes, definido como os níveis entre índices glicêmicos normais e diabéticos, está aumentando rapidamente em todo o mundo. Aproximadamente 38% da população adulta no Estados Unidos da América1 e cerca de 50% da população chinesa têm pré-diabetes.2 O pré-diabetes é importante devido ao aumento do risco de complicações microvasculares e macrovasculares e o avanço para o diabetes tipo 2 em um curto período. É sabido que os altos níveis de glicemia plasmática são um importante fator de risco de doença cardiovascular aterosclerótica.3 Além disso, a resistência à insulina pode estar associada à aterosclerose devido a piores perfis lipídicos,4 estado pró-inflamatório5 e disfunção endotelial.6

A detecção de doença cardiovascular aterosclerótica nesse período inicial é importante para o acompanhamento e o tratamento. A espessura íntima-média da carótida (EIMC) é usada para detectar aterosclerose subclínica nos estágios iniciais e demonstrou prever eventos cardiovasculares.7 - 10 Cada 0,1 mm de aumento na EIMC aumenta o risco de infarto do miocárdio em 10-15% e de acidente vascular cerebral em 13-18%.11 Ela é muito apropriada para uso em estudos populacionais de grande escala, pois é não invasiva e pode ser obtida com uma medição simples.

Além de métodos não invasivos para determinar o desenvolvimento da aterosclerose, sabe-se que vários biomarcadores também são incluídos nas previsões. A molécula-1 específica da célula endotelial (ESM-1), chamada de endocan, é um proteoglicano liberado pelas células endoteliais sob o controle de citocinas inflamatórias. O endocan ativa compostos garantindo o substrato necessário para coleta, adesão e transmigração de leucócitos no endotélio ativado.12 Estudos anteriores determinaram que os níveis de endocan sérico eram maiores em pacientes com diabetes tipo 2 e síndrome coronária aguda em comparação com os grupos de controle.13 , 14 Estudos demonstraram que os níveis de endocan sérico estavam associados à gravidade da doença.10 - 12

Existem estudos que avaliam os níveis de endocan sérico em pacientes pré-diabéticos e com resistência à insulina. Entretanto, não é claro se as alterações nos níveis de endocan sérico são uma causa ou uma consequência, especialmente no caso de eventos ateroscleróticos. Quando os níveis de endocan sérico foram comparados entre grupos de pacientes e grupos de controle, diferentemente dos valores altos do diabetes tipo 2, determinou-se que eles eram baixos ou inalterados no grupo de pré-diabéticos.15 , 16 Embora a tendência a aterosclerose aumente nos pacientes pré-diabéticos e diabéticos, as diferenças nos níveis de endocan sérico são notáveis. Existem estudos que avaliam os níveis de endocan nos eventos ateroscleróticos e vasculares em pacientes com diabetes tipo 2. Entretanto, não foi possível encontrar nenhum estudo na literatura que avaliasse os níveis de endocan em pacientes pré-diabéticos com aterosclerose.

Nosso estudo teve o objetivo de revelar o papel dos níveis de endocan sérico na previsão de aterosclerose subclínica baseado em pacientes pré-diabéticos em EIMC.

Métodos

Nosso estudo está em conformidade com a Declaração de Helsinki e foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa do hospital Prof Dr Cemil Tascioglu City (aprovação número 525). Os participantes assinaram um termo de consentimento informado. Este estudo transversal foi realizado no ambulatório de medicina interna de nosso hospital de cuidado terciário entre junho e agosto de 2021. Foram incluídos no estudo 84 participantes, com mais de 18 anos de idade, dos quais 42 eram pacientes pré-diabéticos e 42 eram normoglicêmicos (o IMC, a idade e o sexo eram semelhantes).

De acordo com os critérios da American Diabetes Association (ADA), pessoas com índices glicêmicos em jejum entre 100-125 mg/dL (tolerância à glicose prejudicada (IGT)) ou HbA1c 5,7-6,4%, ou níveis de glicemia plasmática de 2 horas durante o teste oral de tolerância à glicose (TOTG) a 75 g entre 140 e 199 mg/dL (tolerância à glicose prejudicada (IGT)), foram incluídas no grupo dos pré-diabéticos.17 Participantes normoglicêmicos com valores mais baixos foram incluídos no grupo de controle. Os indivíduos nos grupos normoglicêmico e pré-diabético não estavam fazendo uso de medicamentos antidiabéticos.

Indivíduos com histórico de infarto do miocárdio ou revascularização coronária, eventos cerebrovasculares, diagnóstico prévio de doença cardiovascular ou insuficiência cardíaca sistólica, doença valvar grave, cardiomiopatia hipertrófica, angina pectoris, variações da onda ST-T no eletrocardiograma, ondas Q, bloqueio do ramo esquerdo, doença hepática ou renal crônica, malignidade ativa, hipertensão, doenças inflamatórias, doença do sistema respiratório, doença arterial periférica, tabagismo, ou que se recusaram a participar, foram excluídos do estudo.

A pressão arterial dos participantes foi medida, e o IMC foi calculado medindo sua altura e peso (peso/altura ao quadrado, kg/m2). Depois de jejum noturno, foram analisados glicemia, insulina HbA1c, níveis lipídicos (colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL-C), colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-C) e triglicérides), proteína C-reativa (PCR), creatinina, e endocan sérico. Os valores do modelo de avaliação da homeostase da resistência à insulina (HOMA-IR) foram calculados com a fórmula, (glicemia em jejum x níveis de insulina em jejum)/405.

Medições de endocan sérico

Após o jejum noturno, foram coletados 10 ml de sangue venoso dos participantes. As amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 1700 rpm. O soro foi armazenado a -80 ℃ até a análise. Os níveis de endocan sérico foram medidos com um kit de ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) de acordo com o protocolo do fabricante (Human Endocan Elisa Kit; lote nº: 201506, Nº cat.: E3160Hu, Sunred Biological Technology, Xangai, China). Os resultados são apresentados em ng/L. O intervalo de medição do kit é 31-2000 ng/L.

Avaliação da espessura da íntima-média da artéria carótida

A EIMC foi medida usando-se um transponder de gama linear multifrequência (12 MHz) (Samsung HS50 GE Ultrasound). Todas as medições foram feitas em imagens de modo B de alta resolução. Para as medições de EIMC, os pacientes foram colocados em posição supina com a cabeça virada a 45º na direção oposta ao lado da medição. Imagens de modo B da extensão do segmento distal da artéria carótida principal direita foram obtidas para três seções em sequência da parede mais distante da artéria carótida principal. Em seguida, a distância entre as interfaces entre sangue-íntima e média-adventícia foi medida para cada seção. A EIMC foi calculada pela média dos valores das medições.

Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o software SPSS, versão 26.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, EUA). Média e desvio padrão foram usados para variáveis contínuas com distribuição normal, e mediana e faixa interquartil foram usadas para as sem distribuição normal. Variáveis categóricas são expressas como números absolutos e porcentagens. A distribuição das variáveis foi avaliada com o teste Kolmogorov–Smirnov. As variáveis contínuas foram comparadas usando-se o teste T (não pareado) de duas amostras independentes ou o teste U de Mann-Whitney, de acordo com sua distribuição. O teste qui-quadrado foi usado para variáveis categóricas. Os testes de Pearson ou Spearman foram usados para análise de correlação dependendo se as variáveis eram paramétricas ou não paramétricas. A análise regressiva linear multivariada foi usada para avaliar as determinantes da EIMC. A distribuição normal de todos os parâmetros é necessária para a análise regressiva linear multivariada. Obtivemos a distribuição normal a partir dos logaritmos do endocan sérico e dos níveis de triglicérides. O nível de significância estatística foi definido em p <0,05.

Reprodutibilidade

Considerando que a concordância entre intraobservador e interobservador é 0,75, o tamanho mínimo da amostra (considerando Erro de tipo de 0,05, Erro de tipo III de 0,20 e Poder de 0,80) é n=13. Considerando as possibilidades de perdas por qualquer motivo, 15 pessoas foram incluídas no estudo.

Análise de poder

A análise de poder foi realizada com o programa G-power. Com base em dados anteriores na literatura, para tamanho de efeito 0,57, a parcela de 5% do erro alfa e o poder de 80% de representar a população, o menor tamanho para cada grupo amostral foi calculado como 39.

Resultados

Idade, sexo e valores de IMC dos grupos pré-diabético e normoglicêmico foram semelhantes (p>0,05).

Os níveis de endocan sérico foram significativamente mais baixos no grupo pré-diabético do que no grupo de controle (p=0,042), e os valores de EIMC foram mais altos (p=0,046) ( Tabela 1 ).

Tabela 1. Características demográficas e achados laboratoriais em pacientes pré-diabéticos e de controle.

  Grupo de controle n=42 Grupo de pacientes pré-diabéticos n=42 p
Idade (anos) 47,8±9,7 49,9±8,5 0,112
Sexo (F/M) 28/14 30/12 0,814
IMC (kg/m2) 33,8±4,1 32,2±8,8 0,066
Endocan (ng/L) * 138 (84-300) 120 (65-185) 0,042
FPI (µU/ml) 11,2±5,3 20,1±8,8 <0,001
FPG (mg/dL) 87±5,3 103±9,7 <0,001
2-h GP durante 75-g TOTG (mg/dL) 101±19 141±34 <0,001
HOMA-IR 2,4±1,1 5,2±2,3 <0,001
HbA1c (%) 5,5 ±0,3 5,9±0,5 0,039
PCR (mg/dL) 4,9± 2,6 5,1±2,9 0,245
Colesterol total (mg/dL) 188±32 206±33 0,020
Colesterol LDL (mg/dL) 110±31 120±26 0,107
Colesterol HDL (mg/dL) 53±11 49±13 0,103
TG (mg/dL)* 108 (79-133) 152 (95-257) 0,002
EIMC (mm) 0,67±0,16 0,74±0,17 0,046
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IMC: índice de massa corporal; FPI: insulina plasmática em jejum; FPG: glicemia plasmática em jejum; GP: glicemia plasmática; TOTG: teste oral de tolerância à glicose; HOMA-IR: modelo de avaliação da homeostase da resistência à insulina; HbA1c: hemoglobina glicada; PCR: proteína C reativa; LDL: lipoproteína de baixa densidade; HDL: lipoproteína de alta densidade; TG: triglicérides; EIMC: espessura íntima-média da carótida.

Houve uma correlação significativa entre o valor de EIMC e idade e níveis de triglicérides de todos os participantes ( Tabela 2 ). A análise regressiva linear multivariada de idade, endocan, HbA1c, FPI, FPG, e valores de triglicérides foi realizada com EIMC. O logaritmo dos valores de endocan sérico e triglicérides foram obtidos para garantir a distribuição normal. Detectou-se que o nível de endocan sérico estava associado à EIMC, independentemente de outros parâmetros (p=0,007) ( Tabela 3 ). Apesar de não haver correlação entre os níveis de endocan sérico e as medições de EIMC no grupo pré-diabético (r=0,104 p=0,514) ( Figura 1 ), foi encontrada uma correlação positiva no grupo sem pré-diabetes (r=0,340, p=0,028) ( Figura 2 ).

Tabela 2. Correlações entre EIMC e outros parâmetros.

  Todos os participantes (n=84) Grupo de controle (n=42) Grupo de pacientes pré-diabéticos (n=42)
 
  r p r p r p
Endocan (ng/L) * 0,206 0,060 0,340 0,028 0,104 0,514
Idade (anos) 0,363 0,001 0,490 0,001 0,215 0,172
IMC (kg/m2) -0,015 0,895 -0,009 0,956 0,034 0,833
FPI (µU/ml) 0,180 0,104 0,360 0,021 0,020 0,900
FPG (mg/dL) 0,195 0,075 0,212 0,178 0,119 0,454
2-h GP (TOTG) 0,166 0,131 0,080 0,485 0,164 0,300
HOMA-IR 0,180 0,102 0,379 0,013 0,004 0,982
HbA1c (%) 0,242 0,080 0,349 0,143 0,199 0,260
PCR (mg/dL) 0,077 0,520 0,063 0,694 0,065 0,730
C Total (mg/dL) -0,015 0,895 -0,076 0,632 -0,015 0,927
LDL-C (mg/dL) -0,031 0,781 -0,093 0,557 -0,192 0,223
HDL-C (mg/dL) -0,111 0,313 0,032 0,839 0,227 0,149
TG (mg/dL)* 0,257 0,018 0,306 0,030 0,342 0,027
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IMC: índice de massa corporal; FPI: insulina plasmática em jejum; FPG: glicemia plasmática em jejum; GP: glicemia plasmática; TOTG: teste oral de tolerância à glicose; HOMA-IR: modelo de avaliação da homeostase da resistência à insulina; HbA1c: hemoglobina glicada; PCR: proteína C reativa; C Total: colesterol total; LDL-C: colesterol de lipoproteína de baixa densidade; HDL-C, colesterol de lipoproteína de alta densidade; TG: triglicérides; EIMC: espessura íntima-média da carótida. *Teste de correlação de Spearman, outros: Teste de correlação de Pearson.

Tabela 3. Análise regressiva linear multivariada mostrando os preditores de EIMC.

  Beta IC 95% p
Inferior Superior
Idade 0,525 0,004 0,016 0,002
FPI 0,324 -0,001 0,016 0,068
Log TG -0,142 -0,381 0,154 0,396
Log (Endocan) 0,435 0,056 0,336 0,007
HbA1c 0,181 -0,053 0,219 0,222
PCR 0,024 -0,019 0,022 0,862
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FPI: insulina plasmática em jejum; Log: logaritmo; TG: triglicérides; HbA1c: hemoglobina glicada; PCR: proteína C reativa.

Figura 1. Correlação entre níveis de endocan plasmático e valores de EIMC no grupo de pacientes pré-diabéticos. (r=0,104, p=0,514).

Figura 1

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Figura 2. Correlação entre níveis de endocan plasmático e valores de EIMC no grupo de controle (r=0,340, p=0,028).

Figura 2

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As correlações entre os parâmetros da Tabela 1 e os níveis de endocan sérico foram examinadas. Desses parâmetros, apenas a insulina em jejum foi correlacionada aos níveis de endocan. Essa correlação foi negativa (r=-0,320, p=0,001) ( Figura 3 ).

Figura 3. Correlação entre níveis de endocan sérico e insulina plasmática em jejum (r=-0,320, p=0,001).

Figura 3

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Reprodutibilidade

Um total de 15 pacientes foram selecionados aleatoriamente para análise de variabilidade inter- e intraobservador. A compatibilidade entre os valores de EIMC intra- e interobservador foi calculada. Os coeficientes de correlação intraclasse para variabilidade intraobservador e interobservador foram, respectivamente: 0,93 (IC 95%, 0,87–0,97) e 0,90 (IC 95%, 0,85–0,95) para EIMC.

Discussão

Nosso estudo teve o objetivo de explicar o papel dos níveis de endocan na previsão da aterosclerose subclínica em pacientes pré-diabéticos com base em medições de EIMC. Os níveis de endocan plasmático foram mais baixos no grupo de pacientes pré-diabéticos do que no grupo de controle. Em contraste, os valores de EIMC foram mais altos em pacientes pré-diabéticos. Em nosso estudo, não houve correlação entre valores de EIMC e níveis de endocan sérico. Quando os grupos foram avaliados separadamente, a correlação entre medições de EIMC e níveis de endocan foi detectada no grupo normoglicêmico, mas não no grupo pré-diabético. Entretanto, dependendo dos resultados da análise regressiva, os níveis de endocan sérico explicaram significativamente o valor de EIMC.

Muitos estudos mostram que o pré-diabetes pode causar doenças cardiovasculares.3 - 6 Além disso, a carga de aterosclerose coronária em pacientes pré-diabéticos é mais alta do que em pessoas normais. Especificamente, a carga de aterosclerose precede os sintomas de diabetes tipo 2. Em nosso estudo, os valores de EIMC foram altos em pacientes pré-diabéticos, o que é compatível com estudos usando a EIMC como marcador de aterosclerose subclínica.18 , 19

Pacientes pré-diabéticos têm hiperinsulinemia devido à resistência à insulina, e os resultados de nosso estudo são compatíveis com isso. Uma correlação negativa foi confirmada entre insulina plasmática em jejum e níveis de endocan. Pode-se dizer que os níveis de endocan sérico são baixos em pacientes pré-diabéticos devido o estado hiperinsulinêmico.

A relação entre hiperinsulinemia e aterosclerose foi demonstrada por estudos anteriores. A resistência à insulina despertou grande interesse nas comunidades médica e científica devido a sua associação a doenças cardiovasculares. Entretanto, o mecanismo molecular que liga a resistência à insulina ao desenvolvimento e/ou avanço da aterosclerose continua a ser um enigma. Alguns mecanismos se destacam em relação a essa situação. A sinalização de insulina desempenha um papel crítico na ativação da sintase de óxido nítrico, que regula a produção de óxido nítrico.20 , 21 O óxido nítrico é um vasodilatador e um agente antiaterogênico potente.20 A deficiência de óxido nítrico ativa várias vias envolvidas na aterogênese.22 , 23 Portanto, um defeito na sinalização de insulina além de prejudicar a utilização da glicose também causa hipertensão e aterosclerose acelerada. É difícil distinguir o efeito da resistência à insulina da hiperinsulinemia compensatória que sempre a acompanha. Já se sugeriu que, se o efeito prejudicial da resistência à insulina é resultado da diminuição da ação da insulina, a hiperinsulinemia compensatória pode ser apenas um observador inocente. Inversamente, se certos aspectos da ação da insulina não são afetados pela diminuição da potência da insulina, a presença de hiperinsulinemia compensatória pode ter seu efeito próprio. Consequentemente, a hiperinsulinemia compensatória pode estimular ou até superestimular certos aspectos da ação da insulina em várias células e tecidos. Portanto, o ponto crítico no entendimento do papel da resistência à insulina é determinar se a ação reduzida da insulina (efeito da resistência à insulina) coexiste com a ação normal ou até aumentada da insulina (efeito da hiperinsulinemia) dentro do mesmo tecido e da mesma célula. Essa tarefa é possibilitada pela revelação da cadeia de sinalização intracelular da insulina. A hiperinsulinemia é um fator de crescimento potente,24 - 28 cujos efeitos de promoção de crescimento são mediados pela via da proteína quinase ativada por mitógenos (MAP).29 Após a interação entre o substrato 1 do receptor de insulina (IRS-1) e proteína transformadora contendo domínios com homologia a Src 2 (SH2), a quinase regulada por sinal extracelular (ERK) é ativada,30 , 31 transloca-se para o núcleo e catalisa a fosforilação de fatores de transcrição que promovem o crescimento celular, a proliferação celular e a diferenciação celular.30 Portanto, essa via tem um papel importante na aterogênese.

Além de sua função nos mecanismos ateroscleróticos, já se relatou que a insulina atenua a resposta inflamatória sistêmica induzida por endotoxina diminuindo a expressão do TNF-α e aumentando a cascata anti-inflamatória.26 , 32 A expressão do endocan é regulada diferencialmente por citocinas. O TNF-α e a interleucina-1 beta (IL-1β) regula para cima e o interferon-gama (IFN-γ) regula para baixo a secreção do endocan.33 O efeito redutor da hiperinsulinemia no TNF-α pode explicar a diminuição dos níveis de endocan sérico. Além disso, Janke et al. demonstraram que o endocan é expresso por adipócitos humanos e que a administração de insulina reduz a produção do endocan em adipócitos. Por esse motivo, já se sugeriu que a secreção de endocan por adipócitos pode afetar significativamente os níveis de endocan locais ou sistêmicos.34 Em nosso estudo, o efeito supressor da insulina nos adipócitos pode ser outro fator efetivo nos baixos níveis de endocan plasmático no grupo de pacientes pré-diabéticos.

Menon et al. pesquisaram o papel do endocan durante a formação de lesão aterosclerótica em ratos homozigotos para ApoE e identificaram altos índices de expressão de placas ateroscleróticas. No estudo, a expressão de endocan tinha níveis baixos no endotélio quiescente, ao mesmo tempo em que se mostrava regulada para cima no endotélio ativado.35 Os sujeitos em nosso grupo de estudo foram selecionados entre pessoas sem doença vascular conhecida ou qualquer outra situação que causasse inflamação. Por esse motivo, há uma probabilidade alta de que tanto os sujeitos do grupo de controle quanto os pacientes pré-diabéticos tinham endotélio quiescente. Nesse caso, pode-se dizer que, em nosso grupo de pacientes, o efeito da aterosclerose subclínica na secreção de endocan pelo endotélio pode ser limitado. Consideramos que o efeito da insulina no TNF-α e tecido adiposo é mais dominante e causa uma diminuição do nível de endocan sérico.

Já se demonstrou que os níveis de endocan plasmático aumentam dependendo da gravidade da doença em pacientes com aterosclerose, inflamação vascular e síndrome coronária aguda. Determinou-se que o aumento no nível de endocan sérico está associado com doenças cardíacas ateroscleróticas, mas um valor de corte ainda não foi determinado.36 , 37 Esse aumento no nível de endocan sérico é aceito como preditor de aterosclerose em muitos estudos. Já foi sugerido que o endocan seja um inibidor funcional do antígeno 1 associado à função do linfócito (LFA-1) e da interação com a molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1), sugerindo seu papel anti-inflamatório, pela inibição do rolamento, da adesão ou da transmigração de leucócitos.12 O efeito benéfico obtido in vivo pelo bloqueio da adesão a mAbs em camundongos e em outros modelos animais demonstra claramente que o LFA-1 e a ICAM-1 estão envolvidos em inflamação aguda,38 lesão por isquemia/reperfusão,39 rejeição de aloenxerto40 - 42 e imunidade antitumoral. Portanto, pode-se dizer que o endocan é secretado do endotélio em resposta a inflamação aguda e desempenha um papel regulatório com seu efeito anti-inflamatório. Em nosso estudo, demonstramos que os níveis de endocan sérico diminuíram em pacientes pré-diabéticos, provavelmente devido à hiperinsulinemia. Podemos concluir que o endocan tem um papel inibidor na interação entre LFA-1 e ICAM-1. Um aumento na atividade da ICAM-1 é esperado com a diminuição dos níveis de endocan. O aumento da atividade da ICAM-1 pode levar à inflamação vascular. A ICAM-1 é uma molécula bem conhecida que está envolvida na patogênese da placa aterosclerótica.43 , 44

Em estudos com grupos sem pré-diabetes ou resistência à insulina, os níveis de endocan sérico foram elevados, possivelmente em resposta à inflamação no vaso aterosclerótico. Entretanto, nosso estudo mostrou que essa resposta era insuficiente e que os níveis de endocan sérico diminuíram em pacientes com pré-diabetes e aterosclerose, especialmente devido à hiperinsulinemia. Níveis baixos de endocan sérico podem estar envolvidos nos mecanismos de formação da aterosclerose. São necessários estudos abrangentes sobre esse assunto.

Limitações do estudo

Há algumas limitações neste estudo. A principal limitação é o número baixo de pacientes e o fato de o estudo ser realizado em um centro único. Segundo, as medições de EIMC foram usadas ao avaliar a aterosclerose subclínica. Por fim, outra limitação é que não sabemos há quanto tempo nossos pacientes eram pré-diabéticos.

Conclusões

Nossos resultados demonstram que a hiperinsulinemia causa uma redução nos níveis de endocan. Entretanto, não há valor-limiar para prever a aterosclerose. A redução nos valores de endocan sérico medidos periodicamente no acompanhamento dos pacientes com pré-diabetes pode dar mais informações sobre o desenvolvimento da aterosclerose. É necessário realizar estudos prospectivos para este fim.

Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

Fontes de financiamento: O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

Referências

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Can the Serum Endocan Level Be Used as a Biomarker to Predict Subclinical Atherosclerosis in Patients with Prediabetes?

Yucel Arman 1, Adem Atici 2, Ozgur Altun 1, Remzi Sarikaya 3, Sengül Aydin Yoldemir 4, Murat Akarsu 5, Orkide Kutlu 1, Guzin Zeren Ozturk 6, Pinar Demir 1, Mustafa Ozcan 1, Recep Yilmaz Bayraktarli 7, Tufan Tukek 8

Abstract

Background

Patients with prediabetes have an increased risk of atherosclerotic cardiovascular disease; therefore, early detection is important.

Objective

The present study aimed to reveal the usability of serum endocan levels as a biomarker in the diagnosis of subclinical atherosclerosis in patients with prediabetes, based on CIMT measurements.

Methods

Participants were classified according to the presence (n=42) or absence (n=42) of prediabetes. Serum endocan, fasting blood sugar, fasting insulin, and glycated hemoglobin (HbA1c) values of patients were examined, and CIMT was measured. The level of significance for statistical analysis was 0.05.

Results

While serum endocan levels were found to be lower in patients with prediabetes, when compared to the control group (p=0.042), CIMT values were found to be higher (p=0.046). When evaluated by multivariate regression analysis, the serum endocan level was found to be associated with CIMT, regardless of other parameters (p=0.007). A negative correlation was found between plasma fasting insulin and endocan levels (r=-0.320, p=0.001).

Conclusions

Carotid intima media thickness was found to be high and the serum endocan level was low in patients with prediabetes. Decreased serum endocan levels in patients with prediabetes may be a contributing factor to atherosclerosis formation mechanisms.

Keywords: Atherosclerosis, Carotid Intima-Media Thickness, Prediabetic State

Introduction

Prediabetes, defined as levels between normal and diabetic blood sugar, is rapidly increasing around the world. Nearly 38% of the adult population in the United States of America1 and nearly 50% of the Chinese population have prediabetes.2 Prediabetes is important because of the increased risk of microvascular and macrovascular complications and progression to type 2 diabetes in a short time. High plasma glucose levels are known to be a major risk factor for atherosclerotic cardiovascular disease.3 Additionally, insulin resistance may be connected to atherosclerosis due to worse lipid profiles,4 proinflammatory state,5 and endothelial dysfunction.6

Detection of atherosclerotic cardiovascular disease in the early period is important for follow-up and treatment. Carotid intima media-thickness (CIMT) is used to detect subclinical atherosclerosis in the early stages and was able to predict cardiovascular events.7 - 10 Each 0.1 mm increase in CIMT increases the risk of myocardial infarction by 10-15% and stroke by 13-18%.11 It is very appropriate for use in large-scale population studies, as it is non-invasive and can be obtained with a simple measurement.

In addition to non-invasive methods to determine atherosclerosis development, a variety of biomarkers are known to be included in predictions. Endothelial specific molecule-1 (ESM-1), called endocan, is a proteoglycan released from endothelial cells under the control of inflammatory cytokines. Endocan activates compounds ensuring the necessary substrate for collection, adhesion, and transmigration of leukocytes along activated endothelium.12 In previous studies, serum endocan levels were found to be higher in patients with type 2 diabetes and acute coronary syndrome compared to control groups.13 , 14 Studies showed that serum endocan levels were associated with the severity of disease.10 - 12

There are studies assessing serum endocan levels in patients with prediabetes and insulin resistance. However, it is unclear whether changes in serum endocan levels are a cause or a consequence, particularly in atherosclerotic events. When serum endocan levels were compared in these patient groups with control groups, contrary to high values in type 2 diabetes, they were found to be low or unchanged in group with prediabetes.15 , 16 Although the tendency toward atherosclerosis increases in both prediabetes and diabetes patients, the differences in serum endocan levels are remarkable. There are studies evaluating endocan levels in atherosclerosis and vascular events in type 2 diabetes patients. However, we could not find any study in the literature that evaluated endocan levels in prediabetes patients over atherosclerosis.

Therefore, the present study sought to reveal the role of serum endocan levels in predicting subclinical atherosclerosis based on prediabetes patients on CIMT.

Methods

The present study complied with the Declaration of Helsinki, and approval was obtained from the hospital research ethics committee Prof Dr Cemil Tascioglu City (approval number 525). An informed consent form was signed by the participants. This cross-sectional study was conducted in the internal medicine outpatient clinic of our tertiary care hospital between June and August 2021. A total of 84 participants over the age of 18 were included in the study, of which 42 were patients with prediabetes and 42 were normoglycemic (BMI, age, and gender are similar).

According to the American Diabetes Association (ADA) criteria, those with fasting blood glucose levels between 100-125 mg/dL (impaired glucose tolerance (IGT)) or HbA1c 5.7-6.4%, or 2nd hour plasma glucose during 75g oral glucose tolerance test (OGTT) levels between 140 and 199 mg/dL (impaired glucose tolerance (IGT)), were included in the group with prediabetes.17 Normoglycemic participants with lower values were included in the control group. Individuals in the normoglycemic and prediabetes groups were not using any antidiabetic drugs.

Those with a history of myocardial infarction or coronary revascularization, cerebrovascular events, a previous diagnosis of cardiovascular disease or systolic heart failure, severe valve disease, hypertrophic cardiomyopathy, angina pectoris, ST-T wave variations on electrocardiogram, Q waves, left branch block, chronic liver or kidney disease, active malignancy, hypertension, inflammatory diseases, respiratory system disease, peripheral artery disease, smokers, or those who refused to participate were excluded from the study.

The blood pressure of participants was measured, and their BMI was calculated by measuring their height and weight (weight/square of height, kg/m2). After overnight fasting, blood sugar, insulin HbA1c, lipid levels (high density lipoprotein cholesterol (HDL-C), low density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and triglycerides), c-reactive protein (CRP), creatinine, and serum endocan were analyzed. Homeostasis model assessment-estimated insulin resistance (HOMA-IR) values were calculated with the formula (fasting blood sugar x fasting insulin level)/405.

Serum endocan measurements

After overnight fasting, 10 ml of venous blood was collected from the participants. The samples were centrifuged for 10 minutes at 1700 rpm. The serum was stored at -80℃ until analysis. Serum endocan levels were measured with an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit according to the manufacturer’s protocol (Human Endocan Elisa Kit; lot no:201506, cat. No: E3160Hu, Sunred Biological Technology Shanghai, China). Results are given as ng/L. The measurement interval of the kit is 31-2000 ng/L.

Assessment of carotid intima-media thickness

CIMT was measured using a multifrequency (12 MHz) linear array transponder (Samsung HS50 GE Ultrasound). All measurements were taken on high-resolution B-mode images. For CIMT measurements, patients were placed in the supine position, with their heads turned 45° away from the measurement side. B-mode images of the extension of the distal segment of the right main carotid artery were obtained for three sequential sections of the far wall of the main carotid artery. The distance between the blood intima and media-adventitia interfaces was then measured for each section. CIMT was calculated by taking the average of the measurement values.

Statistical analysis

Statistical analyses were performed using SPSS version 26.0 (SPSS Inc, Chicago, Illinois). Mean and standard deviation were used for continuous variables with normal distribution, and median and interquartile ranges were used for those without normal distribution. Categorical variables are shown as absolute numbers and percentages. Distribution of variables was assessed with the Kolmogorov–Smirnov test. Continuous variables were compared using independent two sample t-test (unpaired) or Mann-Whitney U tests according to their distribution. The chi-square test was used for categorical variables. Pearson or Spearman tests were used for correlation analysis according to whether the variables were parametric or nonparametric. Multivariate linear regression analysis was used to evaluate the CIMT determinants. Normal distribution of all parameters is required for multivariate lineer regression analysis. Normal distribution was obtained by taking the logarithm of serum endocan and triglyceride levels. The statistical significance level was determined as P < 0.05.

Reproducibility

Considering that the intra-observer and inter-observer agreement is 0.75, the minimal sample size (assuming Type error 0.05, Type II error 0.20 Power 0.80) is n=13. Considering the possible losses for any reason, 15 people were included in the study.

Power analysis

Power analysis was performed using the G-power program. Based on previous data in the literature, for effect size 0.57, alpha error share 5%, and 80% power to represent the population, the smallest size for each sample group was calculated as 39.

Results

Age, gender, and BMI values of the group with prediabetes and normoglycemia were similar (p>0.05).

Serum endocan levels were significantly lower in the group with prediabetes than in the control group (p=0.042), while CIMT values were higher (p=0.046) ( Table 1 ).

Table 1. Demographic Features and Laboratory Findings in Patients with Prediabetes and in Controls.

  Control Group n=42 Patient group with prediabetes n=42 p
Age (year) 47.8±9.7 49.9±8.5 0.112
Sex (F/M) 28/14 30/12 0.814
BMI (kg/m2) 33.8±4.1 32.2±8.8 0.066
Endocan (ng/L) * 138 (84-300) 120 (65-185) 0.042
FPI (µU/ml) 11.2±5.3 20.1±8.8 <0.001
FPG (mg/dL) 87±5.3 103±9.7 <0.001
2-h PG during 75-g OGTT (mg/dL) 101±19 141±34 <0.001
HOMA-IR 2.4±1.1 5.2±2.3 <0.001
HbA1c (%) 5.5 ±0.3 5.9±0.5 0.039
CRP (mg/L) 4.9± 2.6 5.1±2.9 0.245
Total Cholesterol (mg/dL) 188±32 206±33 0.020
LDL-Cholesterol (mg/dL) 110±31 120±26 0.107
HDL-Cholesterol (mg/dL) 53±11 49±13 0.103
TG (mg/dL)* 108 (79-133) 152 (95-257) 0.002
CIMT (mm) 0.67±0.16 0.74±0.17 0.046
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BMI: body mass index; FPI: fasting plasma insulin; FPG: fasting plasma glucose; PG: plasma glucose; OGTT: oral glucose tolerance test; HOMA-IR: homeostasis model assessment-estimated insulin resistance; HbA1c: glycated hemoglobin; CRP: C-reactive protein; LDL: low-density lipoprotein; HDL: high-density lipoprotein; TG: triglycerides; CIMT: carotid intima-media thickness.

There was a significant correlation between CIMT values and age and triglyceride levels of all participants (Table-2). Multivariate lineer regression analysis of age, endocan, HbA1c, FPI, FPG, and triglyceride values was performed with CIMT. The logarithm of serum endocan and triglyceride values were taken to ensure normal distribution. The serum endocan level proved to be associated with CIMT, regardless of other parameters (p=0.007) ( Table 3 ). While there was no correlation between serum endocan levels and CIMT measurements in the group with prediabetes (r=0.104 p=0.514) ( Figure 1 ), a positive correlation was found in the group without prediabetes (r=0.340, p=0.028) ( Figure 2 ).

Table 2. Correlations between CIMT and other parameters.

  All participants (n=84) Control Group (n=42) Patient group with prediabetes (n=42)
r p r p r p
Endocan (ng/L) * 0.206 0.060 0.340 0.028 0.104 0.514
Age (Year) 0.363 0.001 0.490 0.001 0.215 0.172
BMI (kg/m2) -0.015 0.895 -0.009 0.956 0.034 0.833
FPI ((µU/mL) 0.180 0.104 0.360 0.021 0.020 0.900
FPG (mg/dL) 0.195 0.075 0.212 0.178 0.119 0.454
2-h PG (OGTT) 0.166 0.131 0.080 0.485 0.164 0.300
HOMA-IR 0.180 0.102 0.379 0.013 0.004 0.982
HbA1c (%) 0.242 0.080 0.349 0.143 0.199 0.260
CRP (mg/L) 0.077 0.520 0.063 0.694 0.065 0.730
Total-C (mg/dL) -0.015 0.895 -0.076 0.632 -0.015 0.927
LDL-C (mg/dL) -0.031 0.781 -0.093 0.557 -0.192 0.223
HDL-C (mg/dL) -0.111 0.313 0.032 0.839 0.227 0.149
TG (mg/dL)* 0.257 0.018 0.306 0.030 0.342 0.027
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BMI: body mass index; FPI: fasting plasma insulin; FPG: fasting plasma glucose; PG: plasma glucose; OGTT: oral glucose tolerance test; HOMA-IR: homeostasis model assessment-estimated insulin resistance; HbA1c: glycated hemoglobin; CRP: C-reactive protein; Total-C: Total cholesterol; LDL-C: low density lipoprotein-cholesterol; HDL-C: high density lipoprotein-cholesterol; TG: triglycerides; CIMT: carotid intima-media thickness.*Spearman correlation test, others: Pearson correlation test.

Table 3. Multivariate lineer regression analysis showing CIMT predictors.

  Beta IC 95% p
Inferior Superior
Age 0.525 0.004 0.016 0.002
FPI 0.324 -0.001 0.016 0.068
Log (TG) -0.142 -0.381 0.154 0.396
Log (Endocan) 0.435 0.056 0.336 0.007
HbA1c 0.181 -0.053 0.219 0.222
CRP 0.024 -0.019 0.022 0.862
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FPI: fasting plasma insulin; Log: logarithm; TG: triglycerides; HbA1c: glycated hemoglobin; CRP: C-reactive protein.

Figure 1. Correlation between plasma endocan levels and CIMT values in the patient group with prediabetes. (r=0.104, p=0.514).

Figure 1

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Figure 2. Correlation between plasma endocan levels and CIMT values in the control group (r=0.340, p=0.028).

Figure 2

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Correlations between the parameters in Table 1 and serum endocan levels were examined. Of these parameters, only fasting insulin was correlated with endocan levels. This correlation was negative (r=-0.320, p=0.001) ( Figure 3 ).

Figure 3. Correlation between serum endocan levels and fasting plasma insulin (r=-0.320, p=0.001).

Figure 3

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Reproducibility

A total of 15 patients were chosen at random for inter- and intra-observer variability analysis. The compatibility of intra- and inter-observer CIMT values was calculated. The intra-class correlation coefficient for intra-observer and inter-observer variability was, respectively: 0.93 (95% CI, 0.87–0.97) and 0.90 (95% CI, 0.85–0.95) for CIMT.

Discussion

The present study attempted to explain the role of endocan levels in predicting subclinical atherosclerosis in patients with prediabetes based on CIMT measurements. Plasma endocan levels were lower in the prediabetes patient group than in the control group. By contrast, CIMT values were higher in patients with prediabetes. In our study, there was no correlation between CIMT values and serum endocan levels. When the groups were evaluated separately, the correlation between CIMT measurements and endocan levels was found in the normoglycemic group but not in the group with prediabetes. However, according to the results of the regression analysis, serum endocan levels significantly explained the CIMT value.

Many studies show that prediabetes can cause cardiovascular disease.3 - 6 In addition, the burden of coronary atherosclerosis in patients with prediabetes is higher than in normal people. In particular, the burden of atherosclerosis precedes the clinical symptoms of type 2 diabetes. In our study, CIMT values were high in patients with prediabetes, which is consistent with studies using CIMT as a subclinical atherosclerosis marker.18 , 19

Patients with prediabetes have hyperinsulinemia as a result of insulin resistance, and the results of our study are consistent with this. A negative correlation was confirmed between plasma insulin and endocan levels. It can be said that serum endocan levels are low in patients with prediabetes due to the hyperinsulinemic state.

The relationship between hyperinsulinemia and atherosclerosis has been demonstrated by previous studies. Insulin resistance has elicited great interest in medical and scientific communities because of its association with cardiovascular disease. However, the molecular mechanisms linking insulin resistance to the development and/or progression of atherosclerosis remains enigmatic. Some mechanisms come to the fore regarding this situation. Insulin signaling plays a critical role in activating nitric oxide synthase, which regulates nitric oxide production.20 , 21 Nitric oxide is a potent vasodilator and anti-atherogenic agent.20 Nitric oxide deficiency activates multiple pathways involved in atherogenesis.22 , 23 Thus, a defect in insulin signaling not only impairs glucose use, but also causes hypertension and accelerated atherosclerosis. It is difficult to distinguish the effect of insulin resistance from the compensatory hyperinsulinemia that always accompanies insulin resistance. It has been suggested that if the detrimental effect of insulin resistance is a result of diminished insulin action, compensatory hyperinsulinemia may be just an innocent bystander. Conversely, if certain aspects of insulin action are not affected by the decreased potency of insulin, the presence of compensatory hyperinsulinemia may have its own effect. Consequently, compensatory hyperinsulinemia can stimulate or even overstimulate certain aspects of insulin action in various cells and tissues. Thus, the primary critical point in understanding the role of insulin resistance is to determine whether reduced insulin action (effect of insulin resistance) will coexist with normal or even increased insulin action (effect of hyperinsulinemia) within the same tissue and within the same cell. This task was made possible by unraveling the intracellular insulin signaling chain. Hyperinsulinemia is a potent growth factor,24 - 28 whose growth-promoting effects are mediated via the mitogen-activated protein (MAP) kinase pathway.29 After the interaction between insulin receptor substrate-1 (IRS-1) and src homology 2 domain-containing (SHC) transforming protein, extracellular regulated kinase (ERK) is activated,30 , 31 translocates into the nucleus and catalyses phosphorylation of transcription factors that promote cell growth, cell proliferation, and cell differentiation.30 Thus, this pathway plays an important role in atherogenesis.

In addition to its role in atherosclerotic mechanisms, insulin has been reported to ameliorate the endotoxin-induced systemic inflammatory response by decreasing TNF-α expression and increasing the anti-inflammatory cascade.26 , 32 The expression of endocan is differentially regulated by cytokines. TNF-α and interleukin-1 beta (IL-1β) up-regulate and interferon-gamma (IFN-γ) down-regulates the secretion of endocan.33 The lowering effect of hyperinsulinemia on TNF-α may explain the decrease in serum endocan levels. Janke et al. also showed that endocan is expressed by human adipocytes and that insulin administration reduces endocan production in adipocytes. As a result, it has been suggested that endocan secretion from adipocytes may significantly affect local or systemic endocan levels.34 In our study, the suppressive effect of insulin on adipocytes may be another effective factor in the low plasma endocan levels in the patient group with prediabetes.

Menon et al. researched the role of endocan during atherosclerotic lesion formation in ApoE null mice and identified high rates of expression in atherosclerotic plaques. In the study, endocan expression was at low levels in quiescent endothelium, while they showed it was up-regulated in activated endothelium.35 The subjects in our study group were chosen from people without known vascular disease or any other situation causing inflammation. For this reason, there is a high probability that both controls and patients of prediabetes had quiescent endothelium. In this case, it can be said that, in our patient group, the effect of subclinical atherosclerosis on endocan secretion from the endothelium may be limited. It is our opinion that the effect of insulin on TNF-α and adipose tissue is more dominant and causes a decrease in the serum endocan level.

It has been shown that plasma endocan levels increase depending on the severity of the disease in patients with atherosclerosis, vascular inflammation, and acute coronary syndrome. This increase in the serum endocan level has proven to be associated with atherosclerotic heart diseases, but a cut-off value has not been determined.36 , 37 This increase in the serum endocan level has been accepted as a predictor of atherosclerosis in many studies. Endocan has been suggested as a functional inhibitor of the lymphocyte function-associated antigen 1 (LFA-1) and intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) interaction, suggesting its anti-inflammatory role, through the inhibition of leukocyte rolling, adhesion, or transmigration.12 The beneficial effect obtained in vivo by blocking adhesion with mAbs in mice and in other animal models clearly demonstrates that LFA-1 and ICAM-1 are involved in acute inflammation,38 ischemia/reperfusion injury,39 allograft rejection,40 - 42 and antitumor immunity. Therefore, it can be said that endocan is secreted from the endothelium in response to acute inflammation and plays a regulatory role with its anti-inflammatory effect. The present study showed that serum endocan levels were decreased in patients with prediabetes, most likely due to hyperinsulinemia. It can be concluded that endocan plays an inhibitory role on the interaction between LFA-1 and ICAM-1. An increase in ICAM-1 activity is expected with decreasing endocan levels. The increase in ICAM-1 activity may cause vascular inflammation. ICAM-1 is a well-known molecule involved in the pathogenesis of atherosclerotic plaque.43 , 44

In studies with groups without prediabetes or insulin resistance, serum endocan levels were high, possibly in response to inflammation in the atherosclerotic vessel.35 , 36 However, our study showed that this response was insufficient and that serum endocan levels decreased in patients with prediabetes and subclinical atherosclerosis, especially due to hyperinsulinemia. Low serum endocan levels may be involved in atherosclerosis formation mechanisms. Comprehensive studies are needed on this subject.

Study limitations

There are some limitations to our study. The main limitation is the low number of patients and the study being performed in a single center. Secondly, only CIMT measurements were used when assessing subclinical atherosclerosis. Finally, another limitation is that we do not know how long our patients had been prediabetic.

Conclusions

Our results show that hyperinsulinemia causes a decrease in endocan levels. However, there is no threshold value to predict atherosclerosis. The decrease in serum endocan values measured periodically in the follow-up of patients with prediabetes may give more information about the development of atherosclerosis. Prospective studies are needed for this purpose.

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

Sources of Funding: There were no external funding sources for this study.

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