基因多态性对中国汉族女性乳腺癌遗传易感性的影响

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，影响乳腺癌发生风险的因素有遗传因素及非遗传因素两大类。目前已经证实生殖因素(初潮年龄、绝经年龄、初产年龄、生育次数、人工终止妊娠等)、社会因素(生活饮食习惯、精神状态、生活压力等)和一些特殊暴露史(口服避孕药、放射线、烟草、乙醇等)等非遗传因素与乳腺癌的发病风险相关^[1]，但在同等暴露环境下，个体之间的发病风险不同，提示遗传背景的差异影响了乳腺癌的易感性。

由于不同地域及不同人种之间遗传背景的差异很大，针对西方人群的遗传因素与乳腺癌易感性的关联分析结果不一定适用于中国人群，因此，针对中国女性的基因多态性与乳腺癌易感性关联分析的研究势在必行。在过去的十多年里，我们团队对中国汉族女性乳腺癌的遗传易感性进行了深入研究，为乳腺癌的个体化风险评估提供了一系列分子遗传标记物，本文将结合我们的研究工作，对这一领域的研究进展给予评述。

1. 影响乳腺癌易感性的遗传因素

乳腺癌遗传因素根据其外显率的不同，可进一步分为高外显率胚系基因突变、中外显率胚系基因突变及低外显率遗传变异。高外显率胚系基因突变主要有BRCA1、BRCA2、PTEN、TP53、CDH1和STK11等易感基因，其中BRCA1和BRCA2是最早被报道与乳腺癌以及卵巢癌密切相关的易感基因，主要参与了细胞DNA损伤的同源重组修复过程。中外显率胚系基因突变主要发生在CHEK2、ATM、BRIP1和PALB2等易感基因，这些易感基因同样也参与了DNA损伤修复相关的通路，并与乳腺癌易感性密切相关^[2]，但目前的研究表明，高、中外显率胚系基因突变仅仅能解释大约5%的总体乳腺癌患者病例，以及30%~40%的具有家族背景的遗传性乳腺癌病例^[3]。目前被广泛接受的“常见疾病-常见变异”假说认为，在人群中普遍存在的大量常见低外显率遗传变异在决定疾病易感性方面起了重要的作用^[4]。

低外显率遗传变异主要有单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)、插入/缺失(insertion/deletion，Indel)多态、基因拷贝数变异(copy number variation，CNV)等。虽然这些低外显率遗传变异的单个位点的作用是微弱的，但是多个位点的叠加或协同效应，对乳腺癌的发生风险起着至关重要的作用。

SNP是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，且在人群中发生频率大于1%。通常将次要等位基因频率(minor allele frequency, MAF)>5%的变异，称为常见变异; MAF 1%~5%的变异，称为低频变异; MAF < 1%的变异，称为基因突变。SNP在人类基因组中非常常见，通过千人基因组的研究，大约每500~1 000 bp就会出现一个SNP位点^[5]，但是，只有少数SNP位点可能通过影响蛋白质氨基酸序列或蛋白表达量，从而影响蛋白质结构和功能以及疾病易感性，这些SNP位点被称为功能性SNP或致病性SNP位点(图 1)。

图 1.

功能性SNP可以影响该基因编码蛋白的结构或表达水平

红色“∣”，SNP位点。

2. 中国汉族女性乳腺癌遗传易感性的研究进展

我们研究团队以1 100~1 300例中国汉族女性的乳腺癌患者为研究对象，以1 100~1 500名正常女性为对照，探讨了DNA损伤修复基因(BRCA1)、中心体复制调控基因(AURKA、CENTROBIN、NEK2、PLK1)、细胞周期调控基因(CCNE1、CDK2、CCNB1、CDK1)、肿瘤侵袭及转移相关基因(TGFB1、TGFBR1、CDH1、CTNNB1、SNAI1、TWIST1、PAI-1、NTN4)等的SNP与乳腺癌遗传易感性的相关性。从单个SNP位点、单体型、双体型与乳腺癌遗传易感性的相关性分析，到基因与环境共同作用的分层分析，再到功能性位点及新易感基因的鉴定和分子机制探索，为乳腺癌的个体化风险评估提供了一系列遗传标志物。

在最初进行基因多态性与乳腺癌遗传易感性的相关性研究时，研究人员仅仅关注基因编码序列上的几个错义SNP或可能影响基因功能的SNP，这就是候选SNP策略。鉴于一个基因上有数个、数十个甚至上百个SNP位点，候选SNP分析策略并不能反映整个基因所有SNP位点与乳腺癌遗传易感性的相关性，因此，候选基因分析的研究策略应运而生。

Gabriel等^[6]分析了来自于非洲、欧洲和亚洲的一些样本的51条常染色体的部分区域的单体型类型，研究显示，人类基因组可以划分为一连串的单体型区块^[6]。Daly等^[7]的研究揭示，一个单体型区块内的SNP倾向于作为一个整体共同遗传给后代，因此，在进行关联分析时，研究人员往往在一个单体型区块中选择若干个标签SNP位点，即单体型标签SNP(haplotype tagging SNP, htSNP)，代替位于该单体型区块的其余SNP位点进行检测^[8]，从而极大降低检测的SNP位点数量。一条染色体的一段区域内紧密连锁并共同遗传的SNP组合，称为单体型; 一对染色体上的两个单体型组合在一起，称为双体型。一旦某一单体型被鉴定出与乳腺癌发生风险相关，就可以进一步对该单体型内所有的SNP进行检测，以精确定位致病性SNP。

我们团队关于基因多态性与乳腺癌遗传易感性的系列研究，是根据国际人类基因组单体型图计划(简称HapMap计划)数据库中的中国北京人群的基因分型数据来建立单体型区块，通过选择htSNP、功能性SNP和研究热点SNP，确定每个候选基因上的待分型SNP位点，然后，采用TaqMan探针实时荧光定量PCR方法对各个SNP位点进行基因分型实验，在三种遗传模型(共显性模型、显性模型、隐性模型)假设下，应用卡方检验、逻辑回归等统计学方法，评价每个基因上单个SNP位点、单体型和双体型与乳腺癌遗传易感性的关联性，主要研究结果列于表 1。

表 1.

基因多态性与乳腺癌遗传易感性的相关性分析结果

基因名称	SNP位点	与乳腺癌易感性明显相关联的位点	参考文献
SNP, 单核苷酸多态性。
BRCA1	rs8176323, rs8176303, rs8176199, rs3737559, rs8067269, rs2070833	rs3737559(C>T)的TT/TC基因型携带者与CC基因型相比，发生乳腺癌风险增加35%	[9]
AURKA	rs6064391, rs911162, rs2298016, rs8117896, rs10485805, rs6024836, rs2273535, rs2064863	rs6024836(A>G)的GG基因型携带者与AG/AA基因型相比，发生乳腺癌的风险提高54%; rs2273535(T>A)的AA/TA基因型携带者与TT基因型相比，发生乳腺癌风险增加81%	[9]
CENTROBIN	rs4239115, rs4791987, rs11078719, rs11650083, rs4462665	rs11650083(A>C)的AC、CC基因型携带者与AA基因型相比，发生乳腺癌的风险分别降低19%、27%; CATCG [rs4239115 (C>T)+rs4791987(A>G)+rs11078719 (T>C)+rs11650083(A>C)+rs4462665(G>C)]单体型携带者与最常见单体型CATAG相比，发生乳腺癌的风险降低86%	[10]
CDK1	rs2448343, rs3213048, rs3213067, rs1871446, rs10711, rs1060373	rs2448343(G>A)的AA/AG基因型携带者与GG基因型相比，发生乳腺癌风险降低19%; 对于体重指数 < 23 kg/m2的女性，rs2448343(G>A)的AA/AG基因型携带者与GG基因型相比，发生乳腺癌风险降低42%; rs1871446(C>T)的TT基因型携带者与CT/CC基因型相比，发生乳腺癌的风险降低64%	[11]
TGFB1	rs1800469, rs2241716, rs4803455, rs747857, rs12983047, rs10417924, rs12981053	rs1800469(C>T)的TT/TC基因型携带者与CC基因型相比，发生乳腺癌风险降低24%; rs10417924(C>T)的TT/TC基因型携带者与CC基因型相比，发生乳腺癌的风险增加27%	[12]
CDH1	rs7200690, rs12185157, rs7198799, rs17715799, rs10431923, rs7186053, rs6499199, rs4783689, rs13689	rs13689(T>C)的CC基因型携带者与CT/TT基因型相比，发生乳腺癌的风险提高89%	[13]
PAI-1	rs2227631, rs6090, rs2227667, rs2227672, rs2227692, rs11178	rs2227672(G>T)的TT基因型携带者与GG/GT基因型相比，发生乳腺癌的风险提高1.52倍	[14]
NTN4	rs10859915, rs17356907, rs11836367, rs61938093,	rs11836367(C>T)的CT/TT基因型携带者与CC基因型相比，发生乳腺癌风险降低27%; rs61938093(C>T)的CT/TT基因型携带者与CC基因型相比，发生乳腺癌风险降低23%;rs17356907(A>G)的AG/GG基因型携带者与AA基因型相比，发生乳腺癌风险降低22%	[15]

2.1. BRCA1基因多态性与乳腺癌遗传易感性

关于BRCA1常见SNP位点与乳腺癌遗传易感性的相关性研究，有一部分研究整合了BRCA1内的所有SNP位点进行单体型关联分析，也有一些研究关注BRCA1上的错义SNP位点，但都没有获得能够得到公认的结果^[16]。我们利用HapMap数据库，分析了中国北京人群BRCA1基因及其上下游各10 kb的区域，共发现了55个MAF>5%的SNP位点，并且这些位点存在于1个单体型区块中。该结果显示，在中国人群中BRCA1相对保守，这与Bonnen等^[17]报道的结果一致。我们选定6个htSNPs(rs8176323、rs8176303、rs8176199、rs3737559、rs8067269和rs2070833)进行基因分型及乳腺癌相关性分析，发现rs3737559 (C>T)的TT/TC基因型携带者与CC基因型相比，发生乳腺癌风险增加35%，说明BRCA1基因多态性可以影响乳腺癌发生风险^[9]。

2.2. AURKA基因多态性与乳腺癌遗传易感性

AURKA定位于中心体和纺锤丝，主要参与中心体的成熟、分离和纺锤体形成。AURKA高表达可引起中心体异常扩增及异倍体产生。在乳腺癌中，普遍存在AURKA扩增或高表达现象^[18]。绝大多数的关于AURKA基因多态性与乳腺癌遗传易感性的研究，仅仅关注了基因编码序列上的两个错义SNP位点，即rs2273535(Phe31Ile)和rs1047972(Val57Ile)，对于整个基因范围内的所有其他SNP位点缺乏一个全面的评估。本研究团队在AURKA基因及其上游10 kb和下游2 kb这段区域中，选取了3个单体型区块的6个htSNP、1个错义SNP(rs2273535)和1个疑似阳性关联SNP(rs2064863)进行基因分型。研究结果显示，rs2273535(T>A)的AA/AT基因型携带者与AA基因型相比，发生乳腺癌风险增加81%(OR=1.81，95%CI=1.09-3.00)。Sun等^[19]在一项包含520名乳腺癌病例和520例对照的研究中得到类似结果。Lo等^[20]也在我国台湾人群中发现rs2273535(T>A)的AT基因型与乳腺癌遗传易感性呈强相关。另外，我们还发现AURKA rs6024836 (A>G)的GG基因型携带者与AG/AA基因型相比，发生乳腺癌的风险提高54%(OR=1.54，95%CI=1.18-2.00)^[9]。

2.3. CENTROBIN基因多态性与乳腺癌遗传易感性

CENTROBIN(centrosomal BRCA2 interacting protein，CNTROBIN)是在2002年被克隆的一个新基因，其编码的蛋白与BRCA2的羧基末端结合，定位于中心体，对调节中心体的复制，保持中心体的完整性及胞质分裂起重要作用^[21]。CENTROBIN基因及其上下游5 kb区域内，共有常见SNP位点20个，这些SNP位点都位于1个单体型区块之内。从这个区块内，我们筛选出2个htSNP(rs4239115、rs4791987)进行基因分型。另外，我们还选择了3个位于外显子区域的SNP，分别是rs11078719 (T>C, 位于第8外显子，为同义SNP)、rs11650083 (A>C, 位于第12外显子，为引起Pro578Gln的错义SNP)和rs4462665 (G>C, 位于第13外显子, 为同义SNP)。我们的研究结果显示，rs11650083 (A>C)的AC、CC基因型携带者与AA基因型相比，发生乳腺癌的风险分别降低19%、27%; CATCG [rs4239115 (C>T)+rs4791987 (A>G)+rs11078719 (T>C)+rs11650083 (A>C)+rs4462665 (G>C)]单体型携带者与最常见单体型CATAG相比，发生乳腺癌的风险降低86%^[10]。

在高加索人群中，Olson等^[22]研究了101个中心体相关基因的常见SNP与乳腺癌遗传易感性的相关性，其中包括CENTROBIN的2个SNP(rs7217194和rs4462665)。他们在进行单个SNP分析时，这2个SNP位点与乳腺癌易感性的相关性不明显，但是，如果把同1个信号通路上的多个SNP放在一起进行分析，rs7217194却能降低乳腺癌的发病风险。我们对HapMap数据库进行分析，结果显示，rs7217194与rs11650083是高度连锁的(r²=0.922，D’=1.0)，这说明我们的研究结果与Olson等^[22]的研究结果相互支持。CENTROBIN在细胞分裂间期对中心体内微管的锚定起着非常重要的作用，而rs11650083位于CENTROBIN微管聚合作用最强的区域(445~903 bp)^[23]。这些发现不仅说明CENTROBIN的这个区域与乳腺癌遗传易感性的降低有着密切的相关性，同时也为以后的功能研究提供了方向。

2.4. TGFB1基因多态性与乳腺癌遗传易感性

在乳腺癌的发生与发展过程中，转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)信号通路发挥了重要作用。对于TGFB1基因，我们分析了7个htSNPs(rs1800469、rs2241716、rs4803455、rs747857、rs12983047、rs10417924和rs12981053)，结果显示，携带rs1800469(C>T)次要等位基因的女性，发生乳腺癌的风险降低24%(显性模型: aOR=0.76，95%CI=0.64-0.91)，而rs10417924(C>T)则与乳腺癌患病风险增高相关(显性模型: aOR=1.27，95%CI=1.06-1.52)。Quan等^[24]在美籍非裔女性(458例乳腺癌与406例对照)中，分析了TGFB1 rs1800469与乳腺癌遗传易感性的相关性，结果显示: 在显性模型下，rs1800469是一个保护性位点(OR=0.74，95%CI=0.59~0.97)，尤其可以保护美籍非裔女性罹患雌激素受体阴性乳腺癌(OR=0.64，95%CI=0.40~1.00)。Cox等^[25]对白种女性(1 311例乳腺癌与1 760例正常对照)的分析结果显示，TGFB1基因rs1800469的TT基因型携带者发生乳腺癌的风险明显降低(OR=0.63，95%CI=0.43~ 0.92)。这些研究结果与我们的结果一致，都说明TGFB1基因rs1800469位点可以影响乳腺癌发病风险。

rs1800469位于TGFB1基因5′端调控区，在此区域存在4个与rs1800469(-1347 C>T)高度连锁的多态性位点，即rs2317130 (-2725 G>A)、rs4803457 (-2410 A>G)、rs11466313(-2389_-2391 Del/AGG，位于增强子区)、rs1800468(-1638 G>A，位于增强子区)。Healy等^[26]采用MalInspector软件预测这些SNP的次要等位基因对转录因子结合位点的影响，并采用凝胶电泳迁移率分析证实，rs1800469(-1347 C>T)、rs11466313(-2389_-2391 Del/AGG)、rs2317130(-2725 G>A)的次要等位基因会影响TGFB1基因5′端调控区与转录因子结合能力，因此，我们推测rs11466313(-2389_-2391 Del/AGG)也是影响乳腺癌遗传易感性的功能性位点。

我们采用聚合酶链反应-单链构象多态性方法，对524例乳腺癌病例及691例女性对照样本进行rs11466313基因分型，首次发现与rs11466313 AGG/AGG基因型相比，携带Del/AGG基因型和Del/Del基因型的女性，她们罹患乳腺癌的风险分别降低27%和43%。我们进一步采用荧光素酶实验证实，在MCF-10A和MCF7细胞中，与主要等位基因相比，TGFB1的rs1800469和rs11466313的次要等位基因可以明显降低其启动子活性。我们进一步证实了rs11466313(-2389_-2391 Del/AGG)也是影响乳腺癌遗传易感性的功能性位点^[12]。

3. SNP位点及靶基因影响乳腺癌遗传易感性的功能分析

随着HapMap计划的推进和高通量SNP检测技术的成熟，全基因组关联研究(genome-wide association study, GWAS)成为疾病遗传易感性分析的高效策略。这种方法有助于发现新的疾病相关基因，也对未知新基因的功能鉴定有一定帮助。大规模的GWAS研究已经发现了200多个影响乳腺癌遗传易感性的SNP位点^[27]，但是，这些SNP位点仅仅只是潜在功能区域(单体型区块)的标签SNP，并且绝大多数位于基因组的非编码区域中。如何找到真正具有生物学功能的SNP位点以及相关的靶基因，并揭示它们影响乳腺癌风险的机制，是“后GWAS”时代面临的挑战及主要研究方向。

已有的研究表明，大部分的GWAS SNP位点位于转录调控元件中，例如启动区、增强子等区域，其中以增强子居多^[28]。增强子中的SNP位点由于远离所调控的靶基因或可被多个基因所包围，从而难以发现其具体调控的靶基因以及作用机制。

为探究增强子中GWAS SNP在乳腺癌发生发展中的作用机制，本研究团队利用生物信息学对位于增强子中的乳腺癌GWAS SNP位点进行深入分析，关注到一个被多项GWAS研究所报道的SNP位点rs17356907(A>G)，其位于12q22区域中一个非编码区^[29]。Michailidou等^[27]在欧洲人群中首次通过两阶段GWAS研究，发现携带rs17356907次要等位基因G的女性与携带主要等位基因A的女性相比，发生乳腺癌的风险明显降低。此外，在之后的多项GWAS以及meta分析研究中，均验证了rs17356907位点在欧洲以及亚洲人群中与乳腺癌风险的相关性^[30]。另外，研究人员通过生物信息学分析初步发现，rs17356907位点与NTN4基因的表达相关。Michailidou等^[27]通过TCGA数据进行表达数量性状基因座分析，发现rs17356907与NTN4基因的表达量相关。Ferreira等^[31]通过建立INQUISIT分析方法，也推测rs17356907调控NTN4基因的表达。以上的研究提示，rs17356907是一个确切的乳腺癌遗传易感性SNP位点，并推测其可能影响NTN4基因表达，但关于rs17356907位点是如何调控NTN4基因表达、并影响乳腺癌风险的机制研究却罕有报道。

我们研究团队通过对乳腺癌遗传易感性SNP位点GWAS rs17356907进行精细分型和实验验证，发现了一个与其高度连锁的新功能位点rs11836367(C>T)。研究显示，rs11836367位于NTN4基因下游非编码区域的一个增强子中，并且相较于rs11836367的主要等位基因C，rs11836367的次要等位基因T可增加NTN4基因的表达并降低乳腺癌风险(OR = 0.92，95%CI=0.91~0.93)^[15]。进一步研究发现，rs11836367位于GATA3转录因子结合基序中，rs11836367的次要等位基因T与GATA3结合能力更强，并能提高增强子活性。为了阐明rs11836367调控的靶基因NTN4对乳腺癌发生发展的影响及机制，我们利用Ntn4基因敲除小鼠和乳腺癌自发成瘤模型(MMTV-PyMT模型)，以及内源性条件过表达及敲低NTN4的人乳腺癌细胞系进行了深入研究。研究发现，Ntn4能够抑制小鼠乳腺癌发生及转移，NTN4还能抑制人乳腺癌细胞系的迁移、侵袭、干性等肿瘤相关生物学行为。机制探索显示，NTN4可通过其N端的层黏连蛋白_N结构域与细胞外的Wnt配体结合，抑制乳腺癌细胞中Wnt信号通路的活性，继而发挥抑癌作用^[15]。我们团队的该项研究，揭示了乳腺癌遗传易感位点rs11836367-靶基因NTN4 -乳腺癌发生发展之间的生物学联系及机制，不仅为乳腺癌风险评估提供了一个可靠的遗传易感位点，也为乳腺癌预防和治疗提供了新的靶基因。

目前为止，已阐明及揭示了20多个乳腺癌遗传易感性SNP位点的生物学功能及机制^[32]。Ghoussaini等^[33]发现，与雌激素受体阳性乳腺癌相关的SNP位点rs4442975位于一个增强子区域中，并可以与IGFBP5基因的启动子区域存在相互作用。rs4442975位点可通过影响FOXA1转录因子结合以及染色质互作，进而调控IGFBP5基因表达。Quigley等^[34]发现，MRPS30基因启动子区域rs7716600位点的风险等位基因可以增加转录因子与该启动子结合能力，并激活MRPS30基因启动子的活性及提高MRPS30基因表达量，最终增加携带该风险等位基因人群的乳腺癌遗传易感性。Lawrenson等^[35]发现，位于19p13区域中的功能性SNP位点rs56069439，可以通过影响ANKLE1以及ABHD8基因表达，进而影响肿瘤细胞运动、侵袭表型以及与细胞增殖相关通路，从而影响乳腺癌的遗传易感性。

4. SNP位点的临床意义及展望

基于遗传背景来预测个体的乳腺癌发病风险，是遗传易感性SNP位点的潜在临床应用方向。多基因风险评分是评判多基因效应对疾病贡献的参数，该参数通过整合多个遗传变异的微小效应，从而对疾病风险进行评估。Wen等^[36]构建了包含88个遗传变异位点的乳腺癌多基因风险评分模型，并利用该模型将亚洲女性划分为高风险人群和低风险人群。该研究发现，高风险人群发生乳腺癌的风险增加了2.26倍。Mavaddat等^[37]利用305个遗传变异位点构建了乳腺癌多基因风险评分模型，并利用该模型对美国高加索女性进行划分，发现高风险人群相较于低风险人群，其乳腺癌风险增加了4.37倍。另外，多基因风险评分对现有的乳腺癌评估模型，有一定的优化作用。Diet等^[38]的研究表明，将多基因风险评分引入已有的乳腺癌风险评估模型(BCRAT、BRCAPRO、IBIS以及BOADICEA模型)中，均可以进一步增加各个模型的准确度。

随着对于中国女性乳腺癌相关基因多态性的深入研究及验证，以及对多基因风险评分的优化，对于中国女性人群乳腺癌的风险评估将变得更加可靠，从而为早期干预乳腺癌的发生提供科学依据。

Biography

方伟岗，病理学博士，教授，博士生导师，北京大学临床研究所所长。历任中华医学会病理学分会常务委员、国际病理学会中国分部主席、吴阶平医学基金会病理学部副主任委员、中国研究型医院学会移动医疗专业委员会主任委员、中国抗癌协会肿瘤转移专业委员会主任委员、中华医学会医学科研管理学分会主任委员、中华医学科技奖评审委员会委员、华夏医学科技奖理事会常务理事、教育部科学技术委员会第五届学部委员等，并担任多个国内外期刊的副主编或编委，受聘澳大利亚Monash大学客座教授。主持国家重点研发计划、国家重点基础研究发展计划(973计划)课题、国家自然科学基金等30余项国家/省部级研究课题。研究成果以第一或责任作者在国内外杂志发表论文80余篇(其中SCI论文30余篇)，获得教育部“跨世纪优秀人才”“北京青年五四奖章”“卫生部有突出贡献中青年专家”等荣誉，享受国务院特殊津贴。 从事肿瘤转移机制研究30余年，在国际上首次发现ATP能够抑制激素非依赖型人前列腺癌细胞的体外生长，发现ATP对肿瘤细胞的作用具有多样性，首次提出肿瘤微环境中ATP是重要促侵袭因子的假说并予以证实，为肿瘤侵袭发生的机制及调控提供了新的依据。运用单核苷酸多态性及单体型相关性分析对较大样本量中国汉族妇女中某些热点基因的遗传学多态性与乳腺癌易感性、肿瘤演进及生存的关系进行了研究，为相关领域的研究提供了有益的数据

Funding Statement

国家自然科学基金(81872382、81672790、81171961)

Supported by the National Natural Science Foundation of China (81872382, 81672790, 81171961)