Abstract
目的
牙周炎和非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发生发展与活性氧（ROS）的大量积累密切相关。ROS参与调控c-Jun氨基末端激酶（JNK）/核因子-κB（NF-κB）信号分子的激活，当该信号分子被ROS过度激活后可引发机体内环境紊乱。因此，本研究旨在探究ROS/JNK/NF-κB信号分子在牙周炎诱导肝损伤中的作用机制。
方法
将12只SPF级雄性Wistar大鼠随机分为对照组和牙周炎组，在牙周炎组大鼠双侧上颌第一磨牙颈部进行钢丝结扎构建牙周炎模型，8周后检查大鼠牙周临床指标并处死，Micro-CT重建牙槽骨三维结构并分析牙槽骨吸收情况，组织病理学分析牙周及肝组织的病理改变，MitoSOX red试剂检测肝组织中ROS含量，生化试剂盒检测肝功指标和氧化应激生物标志物，实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测肝组织中NF-κB、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、BCL2-Associated X的蛋白质（Bax）和B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）mRNA表达水平，蛋白免疫印迹（Western blot）法检测肝组织中磷酸化c-Jun氨基末端激酶（P-JNK）、JNK、NF-κB、Bax、Bcl-2和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）蛋白表达水平，末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色法检测肝细胞凋亡。
结果
Micro-CT结果显示，牙周炎组大鼠牙槽骨骨质吸收明显，且釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离明显大于对照组。组织病理学结果显示，牙周炎组大鼠牙周组织内可见大量炎症细胞浸润和牙槽骨明显吸收；肝组织结构破坏，可见大量气球样变和红色脂滴形成。MitoSOX red染色结果显示牙周炎组肝组织中ROS含量明显升高。生化检测结果显示，牙周炎组血清中谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）含量升高；肝组织中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）含量降低，丙二醛（MDA）含量升高。qRT-PCR和Western blot结果显示，牙周炎组肝组织中IL-6、TNF-α、Bax和NF-κB mRNA及P-JNK/JNK、NF-κB、Caspase-3和Bax蛋白表达水平较对照组显著上升，而Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平下降。TUNEL染色结果显示牙周炎组肝组织中凋亡细胞数量明显增多。
结论
ROS/JNK/NF-κB信号分子通过调控细胞凋亡参与牙周炎诱导肝损伤。
Keywords: 牙周炎, 肝损伤, 氧化应激, c-Jun氨基末端激酶, 核因子-κB, 凋亡
Abstract
Objective
The occurrence and development of periodontitis and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) are closely related to the accumulation of reactive oxygen species (ROS). ROS are involved in regulating the activation of c-Jun N-terminal kinase (JNK)/nuclear factor kappa-B (NF-κB) signaling molecules. When the signaling molecules are overactivated by ROS, the internal environment of the body can be disturbed. Therefore, this study aimed to explore the mechanism by which ROS/JNK/NF-κB signaling molecules are involved in periodontitis-induced liver injury.
Methods
Twelve SPF male Wistar rats were randomly divided into control and periodontitis groups. The periodontitis model of rats was established by wire ligation in the neck of bilateral maxillary first molars. After 8 weeks, the periodontal clinical indexes of the rats were examined, and the rats were sacrificed. Micro-CT reconstruction of a three-dimensional alveolar bone structure and analysis of alveolar bone absorption were conducted. Pathological changes in the periodontal and liver tissues were analyzed by histopathology. MitoSOX red reagent was used to detect the ROS content in liver tissue. Biochemical kits were used to detect liver function and oxidative stress biomarkers. The mRNA expression levels ofinterleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α), NF-κB, BCL2-associated X (Bax), and B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) in liver tissue were detected through quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). The protein expression levels of phosphorylated c-Jun N-terminal kinase (P-JNK), JNK, NF-κB, Caspase-3, Bax, and Bcl-2 in liver tissue were detected by Western blot. Apoptosis was detected by terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) staining.
Results
Micro-CT results showed that the mice in the periodontitis group had obvious alveolar bone resorption and significantly greater distance from the cemento-enamel junction to the alveolar bone crest than those in the control group. Histopathological results showed that a large number of inflammatory cells were infiltrated in the periodontal tissue of the periodontitis group. In addition, the resorption of alveolar ridge bone was obvious and liver tissue structure was destroyed, with balloon-like changes and red lipid droplets. MitoSOX red staining results showed that the ROS level was significantly higher in the liver tissue of the periodontitis group than in that of the control group. Biochemical test results showed that the aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) levels in the serum of the periodontitis group were higher than those in the serum of the control group. The levels of superoxide dismutase (SOD) and glutathione (GSH) in liver tissue decreased, whereas the that of malondialdehyde (MDA) increased. Western blot and qRT-PCR results revealed that the mRNA levels of IL-6, TNF-α, Bax, and NF-κB and the protein levels of P-JNK/JNK, NF-κB, Caspase-3, and Bax were significantly higher in the liver tissue of the periodontitis group than in that of the control group. Meanwhile, the mRNA and protein levels of Bcl-2 were lower in the periodontitis group than in the control group. TUNEL staining showed that the number of apoptotic cells was significantly higher in the periodontitis group than in the control group.
Conclusion
ROS/JNK/NF-κB signaling molecules are involved in periodontitis-induced liver injury by regulating apoptosis.
Keywords: periodontitis, liver injury, oxidative stress, c-Jun N-terminal kinases, nuclear factor kappa-B, apoptosis
牙周炎是破坏牙周支持组织的细菌感染性疾病，我国第四次口腔健康流行病学调查结果显示，约90%的成年人罹患牙周病，其中将近30%的成年人患有重度牙周炎[1]。重度牙周炎不仅危害局部口腔健康，而且与2型糖尿病、阿尔茨海默病和类风湿性关节炎等多种系统性疾病的发生和发展密切相关[2]。非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是最常见的慢性肝病之一，在全球范围内患病率约为25.2%[3]。近期一项流行病学调查研究发现，在1 226例患有NAFLD的成人人群中，牙周探诊深度（probing depth，PD）≥4 mm的比率显著，且NAFLD的发病率随牙周炎严重程度的增加而上升[4]。由此可见牙周炎与NAFLD关系密切，但其具体机制尚未明了。
氧化应激微环境是一系列慢性疾病的基础[5]，也是牙周炎和NAFLD共同致病因素。活性氧（reactive oxygen species，ROS）在氧化应激反应过程中发挥至关重要的作用，被认为是氧化应激反应的“马达”[6]。研究[7]表明，ROS作为丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的上游调节因子，参与调控该信号分子的表达。其中，c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）是MAPK家族成员之一，介导对外界应激信号做出反应的基本生物过程，被认为是炎症反应和先天免疫反应的重要调节因子[8]。当JNK信号分子被多种细胞应激活动如氧化应激、遗传毒性应激和渗透应激等激活后可促进炎症介质的释放，进而加剧胞内的炎症反应和凋亡，最终造成组织损伤[9]。此外，NF-κB作为JNK的下游信号因子，在传导细胞凋亡和炎症信号中亦发挥了关键作用[10]–[11]。由于JNK/NF-κB信号分子在多种细胞功能调节中发挥核心作用，因此当JNK/NF-κB信号分子被ROS过度激活后可引发机体内环境紊乱。
目前针对NAFLD的防治依旧缺乏有效的措施和特异性药物，未来以牙周炎为靶点可能为NAFLD的防治提供一种新的策略。因此，深入探讨牙周炎诱导NAFLD的相关机制，对于NAFLD的防治具有重要意义。综上，本研究旨在探讨ROS/JNK/NF-κB信号分子在牙周炎诱导肝损伤中的作用。
1. 材料和方法
1.1. 材料和设备
Micro-CT系统（SCANCO公司，瑞士）；油红O试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；MitoSOX red试剂（Thermo Fisher Science公司，美国）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）生化试剂盒（南京建成生物工程研究所）；Hoechst染液（Sigma公司，美国）；逆转录试剂盒（TaKaRa公司，日本）；引物由上海生工生物工程有限公司合成；抗体JNK、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（phosphorylation of c-Jun N-terminal kinase，P-JNK）、NF-κB、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）（Cell Signaling Technology公司，美国）；BCL2-Associated X的蛋白质（BCL2-Associated X，Bax）、B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、β-肌动蛋白（β-actin）、二抗（Proteintech公司，美国）；实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）仪、石蜡切片机（Thermo公司，美国）；实时荧光定量扩增仪（Agilent公司，美国）；RIPA裂解液、BCA试剂盒、末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL）试剂盒和电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）显色液（上海碧云天生物技术有限公司）；光学显微镜、荧光显微镜（Olympus公司，日本）；全自动化学发光凝胶成像显影仪（北京君意东方电泳设备有限公司）。
1.2. 方法
1.2.1. 大鼠牙周炎模型的构建
12只SPF级雄性Wistar大鼠（6周龄，200~220 g）随机分为对照组和牙周炎组，每组各6只（购于吉林大学动物实验中心）。牙周炎组大鼠在2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，采用0.2 mm正畸结扎丝在双侧上颌第一磨牙颈部结扎构建牙周炎模型。8周后检查牙周临床指标并处死，然后迅速采集上颌骨、肝脏和血液用于后续实验[12]。动物实验经吉林大学基础医学院伦理委员会批准（批准编号：2021年研审243号）。
1.2.2. 牙周临床指标检查
探查各组大鼠上颌第一磨牙牙龈状况，并记录牙周临床指标，具体如下。1）PD：用牙周探针在上颌第一磨牙颊腭侧的近远中及中央6个位点进行探诊，记录PD测量结果并取均值。2）牙齿动度（tooth mobility，TM）：用镊子检查上颌第一磨牙TM情况。评价标准为0：生理动度；1：仅颊腭向松动；2：颊腭及近远中向松动；3：颊腭、近远中向及垂直向均松动。3）出血指数（bleeding index，BI）：将牙周探针轻探入龈沟或袋底，取出探针30 s后，观察有无出血及出血程度，以Mazza出血指数为评价标准，0：牙龈健康，无炎症和出血；1：牙龈轻度水肿，探诊不出血；2：探诊后有点状出血；3：探诊后出血沿龈缘扩展；4：探诊后出血并溢出龈沟；5：自发性出血[13]。
1.2.3. Micro-CT分析
采用Micro-CT系统扫描上颌骨。Micro-CT系统设置参数为70 kV、200 mA和300 ms曝光时间（体素大小为10 µm×10 µm×10 µm），使用IPL软件进行图像处理并重建牙槽骨三维结构。Image J软件分析上颌第一磨牙近中、中央及远中釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离并取平均值。
1.2.4. 苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色
采集大鼠上颌骨及肝组织，上颌骨置于10%乙二胺四乙酸溶液中脱钙后，制作石蜡切片；肝组织经4%多聚甲醛溶液固定后制作石蜡切片。常规进行HE染色后镜下观察并拍照。
1.2.5. 油红O（oil red O）染色
采用油红O试剂盒对肝脏冰冻切片染色，以评估肝组织脂肪变性。4%多聚甲醛固定肝组织冰冻切片，冲洗后滴加油红O染液染色10 min，之后用60%异丙醇分化至间质清晰并流水冲洗，苏木精复染5 min，冲洗后甘油明胶封片，最后在光学显微镜下观察并拍照。采用Image-Pro Plus 6.0软件对图像进行分析并计算肝脏脂肪光密度总和。
1.2.6. MitoSOX red染色
4%多聚甲醛固定肝脏冰冻切片，冲洗后滴加MitoSOX red 试剂。在37 °C黑暗环境中孵育30 min，Hoechst染液对细胞核进行染色，最后在荧光显微镜下观察并拍照。
1.2.7. 肝功能和氧化应激指标的测定
采用商用生化试剂盒检测血清中肝功指标AST和ALT及肝组织中氧化应激指标SOD、MDA和GSH，实验步骤按照说明书指示进行。
1.2.8. qRT-PCR检测
Trizol试剂提取肝组织中总RNA，逆转录为cDNA后采用SYBRPrime-Script-TM qRT-PCR Kit试剂盒进行qRT-PCR反应，检测白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factorα-α，TNF-α）、NF-κB、Bax和Bcl-2 mRNA表达情况，引物序列见表1。采用2−ΔΔCt法计算基因相对表达量。
表 1. 基因序列.
Tab 1 Genetic sequence
| 基因 | 引物序列（5′—3′） | 碱基数/bp | 基因号 |
| IL-6[14] | F：ATTGTATGAACAGCGATGATGCAC | 20 | NM_012489.2 |
| R：CCAGGTAGAAACGGAACTCCAGA | 20 | ||
| TNF-α[14] | F：GGCGTGTTCATCCGTTCTC | 24 | NM_012675.3 |
| R：CTTCAGCGTCTCGTGTGTTTCT | 23 | ||
| NF-κB[14] | F：CGACGTATTGCTGTGCCTTC | 19 | NM_199267.2 |
| R：TTGAGATCTGCCCAGGTGGTA | 22 | ||
| Bax[15] | F：CCACCAAGAAGCTGAGCGA | 19 | NM_017059.2 |
| R：GCTGCCACACGGAAGAAGA | 19 | ||
| Bcl-2[15] | F：CTCTGTGGATGACTGAGTACCTG | 23 | NM_016993.2 |
| R：GAGCAGCGTCTTCAGAGACAG | 21 | ||
| β-actin[14] | F：GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA | 23 | NM_031144.3 |
| R：GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG | 24 |
注：F，上游引物；R，下游引物。
1.2.9. Western blot检测
RIPA裂解液提取新鲜肝组织总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度。10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，湿转法转移到聚偏二氟乙烯膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，TBST洗涤后加入抗体JNK（1∶2 000）、P-JNK（1∶2 000）、NF-κB（1∶2 000）、Caspase-3（1∶2 000）、Bax（1∶8 000）、Bcl-2（1∶2 000）、β-actin（1∶8 000）4 °C孵育过夜，TBST洗膜后与二抗（1∶8 000）室温孵育1 h，最后使用ECL显色并通过Image J软件分析灰度值。
1.2.10. TUNEL染色
根据TUNEL试剂盒说明书对肝组织石蜡切片进行染色，Hoechst染液对细胞核进行染色后，在荧光显微镜下观察细胞并拍照。
1.3. 统计学分析
利用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析，所有数据用x±s来表示，组间比较采用t检验分析，P<0.05则认为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1. 成功构建牙周炎模型
肉眼观察对照组牙龈呈粉红色，形态菲薄，质地坚韧（图1a）；而牙周炎组牙龈充血红肿，龈缘肥厚，质地松软（图1b）。牙周组织切片HE染色结果显示，与对照组相比，牙周炎组牙周组织上皮连续性破坏，固有层中有大量炎症细胞浸润，牙槽嵴吸收明显（图1c、d）。Micro-CT显示牙周炎组牙槽骨骨质较对照组吸收明显（图1e、f），且釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离（1.06 mm±0.09 mm）明显大于对照组（0.68 mm±0.02 mm）（t=3.934，P=0.017）。此外，牙周炎组牙周临床指标PD、BI和TM值均明显升高（表2）。以上结果表明，本研究成功构建牙周炎模型。
图 1. 成功构建牙周炎模型.
Fig 1 Successful establishment of the periodontitis model
a、b：大鼠口内照；c、d：牙周组织HE染色结果 × 40；e、f：牙槽骨Micro-CT重建图。M1：第一磨牙；黑色箭头示第一磨牙牙龈状况；黑色三角示牙槽嵴顶；红色箭头示牙槽骨。
表 2. 大鼠牙周临床指标.
Tab 2 Periodontal clinical indices of rats
| 牙周临床指标 | 对照组 | 牙周炎组 |
| PD/mm | 0.21±0.03 | 2.26±0.08*** |
| BI | 0.20±0.20 | 2.60±0.25*** |
| TM | 0.00±0.00 | 1.00±0.32* |
注：牙周炎组与对照组相比，差异有统计学意义，*P<0.05，***P<0.001。
x±s
2.2. 肝大体照及组织病理学检测结果
肉眼观察牙周炎组肝脏较对照组体积增大，颜色变浅，边缘圆钝（图2a、b）。肝组织HE染色结果显示，牙周炎组肝索排列紊乱，小叶内及汇管区可见炎症细胞浸润，肝细胞胞浆内可见白色脂肪空泡（图2c~f）。油红O染色结果显示，牙周炎组肝组织胞浆内红色脂滴明显多于对照组（图3）。以上结果表明牙周炎可诱导肝组织发生结构改变。
图 2. 肝大体照及HE染色结果.
Fig 2 Liver gross imaging and HE staining results
a、b：大鼠肝大体照；c~f：肝组织HE染色，c、d放大200倍，e、f放大400倍。黑色箭头示气球样变；黄色箭头示炎症细胞。
图 3. 油红O染色结果.
Fig 3 The results oil red O staining
左、中：油红O染色 × 200；右：肝脏脂肪光密度总和，牙周炎组与对照组相比差异有统计学意义，**P<0.01。
2.3. MitoSOX red染色结果
线粒体是产生ROS的主要场所，MitoSOX red试剂可靶向检测ROS含量。MitoSOX red是一种线粒体超氧化物荧光染料，被超氧化物氧化后可呈现红色荧光，从而评估ROS含量。实验结果示，牙周炎组肝组织中红色荧光强度较对照组明显增强，表明牙周炎组肝组织中ROS含量升高（图4）。
图 4. MitoSOX red染色结果 × 200.
Fig 4 The results of MitoSOX red staining × 200
MitoSOX染料标记肝细胞内ROS；Hoechest染料标记肝细胞细胞核；Merge表示将肝细胞内ROS和细胞核进行共定位。
2.4. 氧化应激标志物和肝功检测结果
SOD和GSH是生物体内重要的抗氧化剂，MDA是脂质过氧化的最终产物。AST和ALT是评价肝功能损伤的重要指标。结果显示，与对照组相比，牙周炎组肝组织中SOD、GSH含量显著降低，MDA含量升高。血清中AST、ALT含量升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。以上结果表明牙周炎可诱导肝组织中发生氧化应激反应且损害肝功能（表3）。
表 3. 生化指标检测结果.
Tab 3 Biochemical index test results
| 生化指标 | 对照组 | 牙周炎组 |
| SOD/（U·mgprot−1） | 83.27±3.72 | 67.10±2.22* |
| GSH/（µmol·gprot−1） | 63.78±3.22 | 31.26±5.34** |
| MDA/（nmol·mgprot−1） | 1.56±0.08 | 2.14±0.13* |
| AST/（U·L−1） | 36.00±1.29 | 63.57±1.94*** |
| ALT/（U·L−1） | 34.16±0.51 | 50.79±1.38*** |
注：牙周炎组与对照组相比差异具有统计学意义，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
x±s
2.5. qRT-PCR检测结果
qRT-PCR检测肝组织中IL-6、TNF-α、Bax、NF-κB和Bcl-2 mRNA表达水平。结果显示，与对照组相比，牙周炎组肝组织中IL-6、TNF-α、Bax和NF-κB mRNA表达水平显著升高，Bcl-2 mRNA表达水平显著下降，差异具有统计学意义（P<0.05）。以上结果表明牙周炎组肝组织中炎症介质和凋亡相关mRNA表达水平较对照组升高（图5）。
图 5. qRT-PCR检测结果.
Fig 5 qRT-PCR test results
牙周炎组与对照组相比差异有统计学意义，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
2.6. Western blot检测结果
提取肝组织总蛋白，Western blot 检测肝组织中P-JNK/JNK、NF-κB、Caspase-3、Bax和Bcl-2表达水平。与对照组相比，牙周炎组肝组织中P-JNK/JNK、NF-κB、Caspase-3、Bax表达水平明显增高，Bcl-2表达水平降低，Bax/Bcl-2比值升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。以上结果表明，与对照组相比，牙周炎组肝组织中JNK/NF-κB信号分子被激活，且凋亡相关蛋白表达水平显著升高（图6）。
图 6. Western blot检测结果及分析.
Fig 6 Western blot detection results and analysis
左：Western blot检测结果；中：Western blot灰度值分析结果；右：Bax/Bcl-2比值结果。牙周炎组与对照组相比差异具有统计学意义，*P<0.05，**P<0.01。
2.7. TUNEL染色结果
TUNEL染色可将凋亡细胞呈现绿色荧光。结果显示，牙周炎组肝组织中绿色荧光强度较对照组增强，表明牙周炎组肝组织中凋亡水平升高（图7）。
图 7. TUNEL染色结果 × 400.
Fig 7 TUNEL staining results × 400
黄色箭头示TUNEL阳性凋亡细胞。
3. 讨论
牙周炎和NAFLD均为慢性炎症性疾病，有共同的危险因素，两者间相互作用，均表现为组织内部发生氧化应激反应，然而牙周炎诱发肝损伤的具体机制尚不清楚。因此，本研究以氧化应激为切入点，探讨牙周炎诱导肝损伤的具体机制。
ROS在机体内发挥“双刃剑”作用：一方面ROS本身具有杀菌抗菌能力，在生理状态下可以帮助杀死入侵机体的病原菌。另一方面，当ROS被过度激活在体内大量积累会引起机体氧化-抗氧化失衡，导致机体内发生氧化应激反应，最终引起组织损伤[16]。Mohs等[17]研究报道，ROS的过度产生可导致脂质稳态的破坏，从而导致肝细胞内脂质的过度积累。因此，氧化应激是NAFLD发病和进展的重要因素之一。
流行病学调查结果发现，牙周炎患者龈沟液、唾液和血清中氧化应激生物标志物水平较牙周健康者显著升高[18]。而通过手术或非手术治疗等方式对牙周炎进行干预可有效降低全身氧化应激生物标志物水平[19]。基于以上研究猜测牙周炎不仅能改变牙周局部氧化应激水平，也可影响全身氧化还原状态。本研究根据肝组织病理学检测结果以及肝功指标水平变化发现牙周炎可诱导肝脏发生结构改变和功能障碍，表明本研究成功构建大鼠牙周炎相关肝损伤模型。在此模型基础上，通过MitoSOX red染色和检测肝组织中氧化应激生物标志物水平进一步证实我们的猜想。结果显示，牙周炎组肝组织中ROS含量升高，且氧化应激生物标志物SOD和GSH水平降低，MDA水平升高，表明牙周炎可诱导肝组织中发生氧化应激反应。
An等[7]研究发现，ROS大量积累可触发JNK/NF-κB信号分子的激活，进而引起一系列细胞反应。前文所述，由于JNK/NF-κB信号分子可参与多种信号的传导，当该通路被过度激活时可导致内环境紊乱。本研究结果显示，牙周炎组肝组织中JNK蛋白磷酸化水平和NF-κB基因及蛋白表达水平明显较对照组升高，表明JNK/NF-κB信号分子在牙周炎诱导肝损伤过程中可能发挥重要作用。因此，根据以上研究结果初步认为牙周炎可能通过诱导肝脏中ROS大量积累，导致肝组织内发生氧化应激反应，进而激活JNK/NF-κB信号分子，最终造成肝损伤。
细胞凋亡是机体的一种生理机制，在维持内环境稳态过程中发挥关键作用[20]。然而，当机体受到氧化应激等信号刺激导致凋亡水平上升时，巨噬细胞无法清除过多的凋亡细胞，未清除的凋亡细胞可加剧体内炎症反应[7]。Zhou等[21]研究发现，在NAFLD进展中伴随细胞凋亡水平增加。此外，Veskovic等[22]通过改善促凋亡和抗凋亡介质平衡可有效缓解肝脏炎症和损伤。由此可见NAFLD发病机制与细胞凋亡水平改变密切相关。本研究通过探讨JNK/NF-κB信号分子对细胞凋亡的调控作用，进一步揭示牙周炎诱导肝损伤的具体机制。目前研究[23]发现，JNK信号分子在细胞内源性和外源性凋亡途径中发挥至关重要的作用。激活后的JNK通过磷酸化14-3-3α或14-3-3ζ蛋白（bax的胞质锚定蛋白）介导bax活化并将其转位到线粒体，进而诱导线粒体外膜渗透。线粒体外膜渗透可导致细胞色素C和其他促凋亡蛋白从线粒体膜间空间释放，触发Caspase-9级联反应[24]。同时，JNK也可通过磷酸化Bim和Bmf蛋白，从而抑制Bcl-2及其同系物的抗凋亡活性，最终诱导细胞凋亡[20]。此外，NF-κB作为一种重要的转录因子，通过传导凋亡和炎症信号参与细胞损伤过程[11]。本实验结果显示牙周炎组肝组织中凋亡细胞数量明显增多，促凋亡介质Bax和Caspase-3表达水平显著升高，抗凋亡介质Bcl-2表达水平下降，且炎症因子表达水平亦明显上升。综上，牙周炎可能通过诱导肝组织中发生氧化应激反应，激活JNK/NF-κB信号分子，导致肝组织中细胞凋亡水平上升，促进炎症介质大量释放，最终引起肝损伤。
本研究存在一定的局限性，即未使用JNK/NF-κB信号分子的阻断药物观察牙周炎诱导的肝损伤是否得到有效缓解。然而大量研究证实，通过抑制JNK/NF-κB信号分子可有效减轻ROS大量积累对组织和细胞造成的氧化损伤。Chen等[25]研究发现，在心肌缺血-再灌注期间，ROS大量积累造成心肌细胞受损和功能障碍，而Zhou等[26]通过体内应用阻断药物抑制JNK/NF-κB信号通路可以有效减轻心肌组织功能障碍和免疫紊乱。由于氧化应激是缺血-再灌注损伤和牙周炎诱导的NAFLD的共同致病因素之一，上述结果在为后续通过使用阻断药物抑制JNK/NF-κB信号通路从而缓解牙周炎诱导的肝损伤的过程中提供强有力的理论支撑。
综上所述，本研究发现ROS/JNK/NF-κB信号分子可能在牙周炎诱导肝损伤过程中发挥了重要作用，未来可通过应用JNK和NF-κB的靶向药物做进一步研究。期待以牙周炎为靶点为NAFLD的防治提供新策略。
Funding Statement
[基金项目] 吉林省财政厅科技项目（JCSZ2021893-22）；吉林省科技发展计划项目（20190201058JC）
Supported by: Science and Technology Project of Jilin Provincial Department of Finance (JCSZ2021893-22); Science and Technology Development Plan Project of Jilin Province (20190201058JC).
Footnotes
利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。
References
- 1.Jiao J, Jing W, Si Y, et al. The prevalence and severity of periodontal disease in Mainland China: data from the Fourth National Oral Health Survey (2015—2016)[J] J Clin Periodontol. 2021;48(2):168–179. doi: 10.1111/jcpe.13396. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 2.Hajishengallis G, Chavakis T. Local and systemic mechanisms linking periodontal disease and inflammatory comorbidities[J] Nat Rev Immunol. 2021;21(7):426–440. doi: 10.1038/s41577-020-00488-6. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 3.Bui FQ, Almeida-Da-Silva CLC, Huynh B, et al. Association between periodontal pathogens and systemic disease[J] Biomed J. 2019;42(1):27–35. doi: 10.1016/j.bj.2018.12.001. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 4.Iwasaki T, Hirose A, Azuma T, et al. Correlation between ultrasound-diagnosed non-alcoholic fatty liver and periodontal condition in a cross-sectional study in Japan[J] Sci Rep. 2018;8(1):7496. doi: 10.1038/s41598-018-25857-z. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 5.Sczepanik FSC, Grossi ML, Casati M, et al. Periodontitis is an inflammatory disease of oxidative stress: we should treat it that way[J] Periodontol 2000. 2020;84(1):45–68. doi: 10.1111/prd.12342. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 6.Matyas C, Haskó G, Liaudet L, et al. Interplay of cardiovascular mediators, oxidative stress and inflammation in liver disease and its complications[J] Nat Rev Cardiol. 2021;18(2):117–135. doi: 10.1038/s41569-020-0433-5. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 7.An Y, Zhang H, Wang C, et al. Activation of ROS/MAPKs/NF-κB/NLRP3 and inhibition of efferocytosis in osteoclast-mediated diabetic osteoporosis[J] FASEB J. 2019;33(11):12515–12527. doi: 10.1096/fj.201802805RR. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 8.Chen L, Deng H, Cui H, et al. Inflammatory responses and inflammation-associated diseases in organs[J] Oncotarget. 2018;9(6):7204–7218. doi: 10.18632/oncotarget.23208. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 9.Li B, Zhou P, Xu K, et al. Metformin induces cell cycle arrest, apoptosis and autophagy through ROS/JNK signaling pathway in human osteosarcoma[J] Int J Biol Sci. 2020;16(1):74–84. doi: 10.7150/ijbs.33787. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 10.Kaltschmidt C, Greiner JFW, Kaltschmidt B. The transcription factor NF-κB in stem cells and development[J] Cells. 2021;10(8):2042. doi: 10.3390/cells10082042. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 11.Himaya SW, Ryu B, Qian ZJ, et al. Paeonol from Hippocampus kuda Bleeler suppressed the neuro-inflammatory responses in vitro via NF-κB and MAPK signaling pathways[J] Toxicol In Vitro. 2012;26(6):878–887. doi: 10.1016/j.tiv.2012.04.022. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 12.李 艳. 白藜芦醇通过改善氧化应激缓解大鼠牙周炎相关肝损伤的作用机制研究[D] 长春: 吉林大学; 2021. [Google Scholar]; Li Y. Study on the mechanism of resveratrol in alleviating periodontitis-related liver injury by ameliorating oxidative stress in rats[D] Changchun: Jilin University; 2021. [Google Scholar]
- 13.夏 博园, 李 艳, 丁 旭, et al. 过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α在牙周炎诱发大鼠肝损伤中的作用研究[J] 华西口腔医学杂志. 2021;39(5):518–523. doi: 10.7518/hxkq.2021.05.004. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]; Xia BY, Li Y, Ding X, et al. Effect of peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α on liver injury induced by periodontitis in rats[J] West China J Stomatol. 2021;39(5):518–523. doi: 10.7518/hxkq.2021.05.004. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 14.Yue Y, Liu X, Li Y, et al. The role of TLR4/MyD88/NF-κB pathway in periodontitis-induced liver inflammation of rats[J] Oral Dis. 2021;27(4):1012–1021. doi: 10.1111/odi.13616. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 15.杜 少博. 紫外线B辐照诱导大鼠角膜上皮细胞凋亡与枸杞多糖对凋亡的抑制作用及其机理研究[D] 兰州: 兰州大学; 2017. [Google Scholar]; Du SB. The study of ultraviolet B-induced apoptosis in rat corneal epithelial cells and the inhibition effect of Lycium barbarum polysaccharides on the apoptosis and its mechanism[D] Lanzhou: Lanzhou University; 2017. [Google Scholar]
- 16.Forman HJ, Zhang H. Targeting oxidative stress in disease: promise and limitations of antioxidant therapy[J] Nat Rev Drug Discov. 2021;20(9):689–709. doi: 10.1038/s41573-021-00233-1. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 17.Mohs A, Otto T, Schneider KM, et al. Hepatocyte-specific NRF2 activation controls fibrogenesis and carcinogenesis in steatohepatitis[J] J Hepatol. 2021;74(3):638–648. doi: 10.1016/j.jhep.2020.09.037. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 18.Altıngöz SM, Kurgan Ş, Önder C, et al. Salivary and serum oxidative stress biomarkers and advanced glycation end products in periodontitis patients with or without diabetes: a cross-sectional study[J] J Periodontol. 2021;92(9):1274–1285. doi: 10.1002/JPER.20-0406. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 19.Wang Y, Andrukhov O, Rausch-Fan X. Oxidative stress and antioxidant system in periodontitis[J] Front Physiol. 2017;8:910. doi: 10.3389/fphys.2017.00910. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 20.Singh R, Letai A, Sarosiek K. Regulation of apoptosis in health and disease: the balancing act of BCL-2 family proteins[J] Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20(3):175–193. doi: 10.1038/s41580-018-0089-8. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 21.Zhou T, Chang L, Luo Y, et al. Mst1 inhibition attenuates non-alcoholic fatty liver disease via reversing parkin-related mitophagy[J] Redox Biol. 2019;21:101120. doi: 10.1016/j.redox.2019.101120. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 22.Veskovic M, Mladenovic D, Milenkovic M, et al. Betaine modulates oxidative stress, inflammation, apoptosis, autophagy, and Akt/mTOR signaling in methionine-choline deficiency-induced fatty liver disease[J] Eur J Pharmacol. 2019;848:39–48. doi: 10.1016/j.ejphar.2019.01.043. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 23.Sui X, Kong N, Ye L, et al. p38 and JNK MAPK pathways control the balance of apoptosis and autophagy in response to chemotherapeutic agents[J] Cancer Lett. 2014;344(2):174–179. doi: 10.1016/j.canlet.2013.11.019. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 24.Dhanasekaran DN, Reddy EP. JNK-signaling: a multiplexing hub in programmed cell death[J] Genes Cancer. 2017;8(9/10):682–694. doi: 10.18632/genesandcancer.155. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 25.Chen X, Li X, Zhang W, et al. Activation of AMPK inhibits inflammatory response during hypoxia and reoxygenation through modulating JNK-mediated NF-κB pathway[J] Metabolism. 2018;83:256–270. doi: 10.1016/j.metabol.2018.03.004. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 26.Zhou Q, Song J, Wang Y, et al. Remifentanil attenuates cardiac dysfunction, lipid peroxidation and immune disorder in rats with isoproterenol-induced myocardial injury via JNK/NF-KB p65 inhibition[J] Ann Transl Med. 2020;8(8):551. doi: 10.21037/atm-20-3134. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]