1 732例儿童血清维生素K₂临床分析及其与骨代谢标志物关系的研究

Abstract

Objective

To study the level of serum vitamin K₂ (VitK₂) and its association with bone metabolism markers osteocalcin (OC), type I procollagen amino-terminal peptide (PINP), and type I collagen carboxy-terminal peptide (CTX) in children.

Methods

A prospective analysis was performed on 1 732 children who underwent routine physical examination from October 2020 to October 2021. The serum levels of VitK₂ and 25-hydroxy vitamin D [25(OH)D] were measured. According to age, they were divided into four groups: <1 year, 1-3 years group, >3-6 years group, and >6-14 years. A total of 309 children with 25(OH)D≥50 nmol/L were screened out, and serum levels of OC, PINP, and CTX were measured to investigate the correlation of the serum levels of OC, PINP, and CTX with serum VitK₂ levels in different age groups.

Results

The prevalence rate of serum VitK₂ deficiency was 52.31% (906/1 732). The VitK₂ deficiency group had higher prevalence rates of overweight/obesity and growth pain (≥3 years of age) than the normal VitK₂ group (P<0.05). There were differences in the prevalence rate of serum VitK₂ deficiency (P<0.0083) and the serum level of VitK₂ (P<0.05) between the 1-3 years group and the >6-14 years group. The <1 year group had a higher serum level of CTX and a lower serum level of PINP than the >3-6 years group and the >6-14 years group (P<0.05). The <1 year group had a lower serum level of OC than the >6-14 years group (P<0.05). Serum VitK₂ level was positively correlated with OC level (r_s =0.347, P<0.01), and CTX level was negatively correlated with PINP level (r_s =-0.317, P<0.01).

Conclusions

Serum VitK₂ deficiency may be associated with overweight/obesity. Serum VitK₂ may affect the level of OC and even bone health.

维生素K₂（vitamin K₂，VitK₂）广泛存在于发酵食品或动物来源的食品中，主要由细菌合成，因多种侧链结构不同，被命名为四烯甲萘醌-n（menatetrenone，MK-n），其中较为重要的是MK-4和MK-7^［1-2］。VitK₂作为γ-谷氨酸羧化酶的辅酶^［3］，参与骨相关维生素K（vitamin K，VitK）依赖性蛋白质羧化的生理过程，而骨钙素（osteocalcin，OC）作为骨相关VitK依赖蛋白质中最重要的一种，能直接反映成骨细胞和破骨细胞活性，是成骨细胞功能和骨质矿化的特殊标志物。目前国际推荐同时测量骨形成标志物和骨吸收标志物，可更好地协助临床医生判断人体内骨代谢的变化，预测骨丢失情况，评估治疗疗效。其中Ⅰ型前胶原氨基端前肽（type Ⅰ procollagen amino-terminal peptide，PINP）及Ⅰ型胶原交联羧基末端肽（type Ⅰ collagen carboxy-terminal peptide，CTX）分别为国际上推荐的首选骨形成标志物及骨吸收标志物^［4］。

van Summeren等^［5］随机对照试验研究中，给55例健康儿童补充MK-7，发现在不影响凝血功能的情况下，适量MK-7的补充可以增加OC的羧化，促进儿童骨骼健康发育。随着对骨健康研究的深入，发现儿童晚期和青春期是骨骼积累的关键时期，此期可以达到峰值骨量的95%^［6］，如果在青春期末未达到其峰值，不仅影响儿童本身的生长发育，同时，成年以后患病理性骨折和骨质疏松的风险明显提升，所以儿童时期的骨骼健康至关重要^［7］。国内外关于VitK与骨代谢标志物的关系研究多基于成人（绝经期妇女、中老年），而国内关于儿童的临床研究较少，如胡雪松等^［8］研究用VitK治疗儿童失用性骨质疏松对骨生化指标及骨代谢标志物的影响，未明确区分VitK₁和VitK₂，故本研究通过测定VitK₂和骨代谢标志物水平，了解儿童VitK₂的营养分布状况，及其血清VitK₂和骨代谢标志物（OC、PINP、CTX）相关性，以期为预防VitK₂的缺乏和促进儿童的骨骼健康提供科学参考和建议。

1. 资料与方法

1.1. 研究对象

前瞻性选取2020年10月至2021年10月于沈阳市儿童医院儿童保健科门诊常规体检的儿童1 732例为研究对象，测定血清VitK₂、25羟维生素D［25-hydroxyvitamin D，25(OH)D］水平。纳入标准：（1）0~14岁常规体检儿童；（2）身高、体重达到标准的儿童；（3）家属同意并签署知情同意书。排除标准：（1）有明确先天性代谢病和内分泌疾病者（如低磷抗D佝偻病、甲状腺疾病、糖尿病、肝肾疾病）等；（2）患严重呼吸系统、消化系统、心血管系统、泌尿系统疾病患儿；（3）长期服用糖皮质激素或其他影响骨代谢药物（如噻嗪类利尿剂、肝素、抗惊厥药物、重组人甲状旁腺素）等。将受试者按年龄段分为<1岁组、1~3岁组、>3~6岁组、>6~14岁组；根据血清VitK₂水平分为VitK₂正常组和VitK₂缺乏组，分析各组间临床特征。

为排除维生素D对骨代谢的影响，将25(OH)D<50 nmol/L儿童排除，同时剔除采血不足和资料不完整者，最终剩余309例儿童，测定血清OC、PINP、CTX水平，分析不同年龄段骨代谢标志物水平及其与血清VitK₂的相关性。

本研究已获得沈阳市儿童医院医学伦理委员会的批准（2019001）。

1.2. 相关定义

参考德国柏林医学诊断检验中心实验室标准，将血清VitK₂<0.1 ng/mL定义为缺乏。体重指数（body masss index，BMI）=体重（kg）/身高（m²），参考中国0~18岁儿童、青少年BMI的生长曲线^［9］，BMI≥85百分位数（或+SD）为超重，BMI≥95百分位数（或+2 SD）为肥胖。参考美国医学研究院报告^［10］将血清25(OH)D<50 nmol/L定义为缺乏。

1.3. 血清VitK₂和25(OH)D测定

1 732例儿童于早晨空腹状态下采集静脉血2 mL，离心取血清1 mL，送至儿童神经康复实验室检测。采用高效液相色谱串联质谱法测定血清VitK₂和25(OH)D，仪器型号为美国AB 4500MD，标准品均购自美国Sigma-Aldrich检验所，实验用水采用德国默克Milli-Q Diret8 60 LITER PE TANK纯水化系统制备。

1.4. 骨代谢标志物测定

309例儿童测骨代谢标志物，于清晨空腹抽静脉血4 mL，以3 000 r/min离心5 min，分离出血清，置于-20℃冰箱低温保存待测。采用双抗夹心酶联免疫吸附测定法测定OC、PINP和CTX，通过绘制标准曲线计算样品所测指标浓度。酶标仪型号为日本BIORAD iMark，试剂盒均购自北京索莱宝公司。

1.5. 统计学分析

采用SPSS 26.0统计软件进行统计学分析。正态分布计量资料用均数±标准差（ $\overline{x}$ ±s），多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用SNK-q检验；非正态分布计量资料用中位数（四分位数间距）［M（P ₂₅，P ₇₅）］表示，两组间比较用Mann-Whitney U检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，组间两两比较用Nemenyi检验。计数资料用例数和百分率（%）表示，率的比较用 $\chi ²$ 检验，多个样本率的两两比较用Bonferroni法。相关性分析用Spearman秩相关。以α=0.05为检验水准，其中Bonferroni法以（α'=α/比较次数）为检验水准。

2. 结果

2.1. 1 732例儿童血清VitK₂临床资料分析

1 732例儿童中，中位年龄为7.3（3.8，10.7）岁，血清VitK₂缺乏率为52.31%（906/1 732），睡眠不实、超重/肥胖、生长痛（≥3岁）发生率分别为33.78%（585/1 732）、15.65%（271/1 732），29.97%（519/1 732）。男童睡眠不实、超重/肥胖、生长痛（≥3岁）发生率高于女童（P<0.05），见表1。

表1.

男童和女童临床资料比较

项目	男童(n=905)	女童(n=827)	Z/ ${\chi }^2$ 值	P值
年龄 [M(P 25, P 75), 岁]	7.8(3.3, 11.1)	8.1(4.4, 10.2)	-0.041	0.967
血清VitK2[M(P 25, P 75), ng/mL]	0.1(0.1, 0.2)	0.1(0.1, 0.2)	-0.115	0.908
无症状者 [n(%)]	169(18.7)	177(21.4)	2.013	0.156
睡眠不实 [n(%)]	348(38.5)	237(28.7)	18.536	<0.001
食欲缺乏 [n(%)]	148(16.4)	134(16.2)	0.007	0.932
超重/肥胖 [n(%)]	163(18.0)	108(13.1)	8.028	0.005
生长痛 (≥3岁) [n(%)]	309(34.1)	210(25.4)	15.767	<0.001
血清VitK2缺乏 [n(%)]	477(52.7)	429(51.9)	0.120	0.729

注：［VitK₂］维生素K₂。

VitK₂缺乏组年龄大于VitK₂正常组，食欲缺乏、超重/肥胖、生长痛（≥3岁）发生率高于VitK₂正常组（P<0.05）。2组间无症状者比例、睡眠不实发生率差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2.

VitK₂正常组和VitK₂缺乏组临床资料比较

项目	VitK2正常组(n=826)	VitK2缺乏组(n=906)	Z/ ${\chi }^2$ 值	P值
年龄 [M(P 25, P 75), 岁]	7.6(3.3, 10.4)	8.1(4.2, 10.8)	-2.550	0.011
无症状者 [n(%)]	160(19.4)	186(20.5)	0.363	0.547
睡眠不实 [n(%)]	285(34.5)	300(33.1)	0.374	0.541
食欲缺乏 [n(%)]	109(13.2)	173(19.1)	11.030	0.001
超重/肥胖 [n(%)]	114(13.8)	157(17.3)	4.073	0.044
生长痛 (≥3岁) [n(%)]	217(26.3)	302(33.3)	10.268	0.001

注：［VitK₂］维生素K₂。

2.2. 1 732例儿童血清VitK₂水平分析

1 732例儿童中位血清VitK₂水平为0.1（0.1，0.2）ng/mL，不同年龄段间血清VitK₂缺乏率、血清VitK₂水平差异有统计学意义（P<0.05）。经两两比较，>6~14岁组血清VitK₂缺乏率高于1~3岁组（P<0.0083），血清VitK₂水平低于1~3岁组（P<0.05）。见表3。

表3.

不同年龄段血清VitK₂的水平

组别	例数	男童[n(%)]	血清VitK2缺乏[n(%)]	血清VitK2水平[M(P 25, P 75), ng/mL]
<1岁组	116	67(57.8)	63(54.3)	0.08(0.05, 0.14)
1~3岁组	255	146(57.3)	114(44.7)	0.11(0.15, 0.18)
>3~6岁组	377	204(54.1)	182(48.3)	0.10(0.05, 0.17)
>6~14岁组	984	488(49.6)	547(55.6)a	0.08(0.05, 0.15)b
${\chi }^2$ /H值		7.278	12.798	16.345
P值		0.064	0.005	0.001

注：a示与1~3岁组比较，P<0.0083；b示与1~3岁组比较，P<0.05。［VitK₂］维生素K₂。

2.3. 309例儿童骨代谢标志物水平分析

>3~6岁组和>6~14岁组儿童血清CTX水平低于<1岁组，>3~6岁组儿童血清CTX水平低于1~3岁组（P<0.05）；>6~14岁组儿童血清OC水平高于<1岁组（P<0.05）；>3~6岁组和>6~14岁组儿童血清PINP水平高于<1岁组，>6~14岁组儿童血清PINP水平高于1~3岁组（P<0.05）。见表4。

表4.

不同年龄段骨代谢标志物的水平

组别	例数	男童[n(%)]	CTX[M(P 25, P 75), ng/mL]	OC[M(P 25, P 75), ng/mL]	PINP( $\overline{x}\pm s$ , ng/mL)
<1岁组	70	27(38.6)	3.8(1.9, 6.3)	3.5(1.7, 7.0)	0.11±0.07
1~3岁组	86	46(53.5)	0.9(0.8, 1.4)	8.9(4.9, 33.3)	0.13±0.07
>3~6岁组	77	45(58.4)	0.7(0.6, 0.7)a,b	17.8(5.0, 66.5)	0.19±0.08a
>6~14岁组	76	37(48.7)	0.7(0.6, 0.9)a	49.7(7.6, 149.0)a	0.24±0.11a,b
${\chi }^2$ /H/F值		6.320	168.869	52.227	41.946
P值		0.097	<0.001	0.012	<0.001

注：a示与<1岁组比较，P<0.05；b示与1~3岁组比较，P<0.05。［CTX］Ⅰ型胶原交联羧基末端肽；［OC］骨钙素；［PINP］Ⅰ型前胶原氨基端前肽。

2.4. VitK₂与骨代谢标志物的相关性分析

经Spearman秩相关分析表明，年龄与血清VitK₂、OC、PINP水平呈正相关（分别r_s =0.136、0.433、0.415，P<0.05）。年龄与血清CTX水平呈负相关（r_s =-0.488），血清VitK₂与OC水平呈正相关（r_s =0.347），血清CTX与PINP水平呈负相关（r_s =-0.317），差异均有统计学意义（P<0.01），而血清VitK₂与血清CTX、PINP无相关性（P>0.05）。见表5。

表5.

各指标间的相关性

指标	年龄	VitK2	OC	CTX	PINP
年龄	1
VitK2	0.136*	1
OC	0.433**	0.347**	1
CTX	-0.488**	-0.070	-0.012	1
PINP	0.415**	0.060	-0.014	-0.317**	1

注：*示P<0.05；**示P<0.01。［VitK₂］维生素K₂；［CTX］Ⅰ型胶原交联羧基末端肽；［OC］骨钙素；［PINP］Ⅰ型前胶原氨基端前肽。表中数据为相关系数。

3. 讨论

VitK₂作为人类所必需的天然营养素，在体内广泛分布，其与γ-谷氨酰羧化酶具有高度亲和性，可利用氢醌的活化形式激活凝血因子、OC和基质Gla蛋白发挥促进凝血、参与骨代谢、调节糖脂代谢、预防血管硬化等生理过程^［11-12］。本研究中，超重/肥胖儿童血清VitK₂缺乏率升高，这与国外研究^［13］表明VitK₂具有降脂作用一致。Sogabe等^［13］用MK-4对雌性大鼠进行为期3个月的喂养发现，与对照组相比，MK-4的加用显著降低了总脂肪积累，且血清三酰甘油降低了29%。

由于血液中VitK₂浓度低，其脂溶性易受脂质的干扰，因此测定血液中VitK₂比较困难，国内外也没有儿童VitK₂营养分布状况的确切数值，相关文献报道健康人群血VitK₂水平高于绝经期女性和骨质疏松人群；日本人群高于欧洲人群，考虑与饮食和个体因素（如健康状态、年龄段、人种等）有关^［14-17］。本研究中1 732例儿童血清VitK₂水平的中位数为0.1（0.1，0.2）ng/mL，血清VitK₂缺乏率为52.31%，不同年龄段儿童血清VitK₂水平中位数均处于较低水平，这与我国饮食结构中普遍缺乏VitK₂直接相关^［18］。1~3岁组和>6~14岁组血清VitK₂缺乏率、血清VitK₂水平差异有统计学意义，考虑到>6~14岁组是生长发育的高峰期，此期对营养素需求量较大有关；另一方面，人们对VitK₂与骨骼健康相关认知较少，只注重维生素D、钙的补充，忽视VitK₂营养状况有关，因此我们要重视VitK₂日常监测与补充。但目前研究多基于VitK的膳食补充，也未有VitK₂的儿童推荐补充剂量。国外的MK-7临床试验不良反应中，Ozdemir等^［19］对20例3~18岁地中海贫血的骨病患儿进行为期1年的含有MK-7和骨化三醇膳食补充的过程中，未观察到不良反应，且依从性良好。根据美国药典委员会发表的对MK-7安全性评价，认为MK-7作为食品添加剂，儿童每日摄入量可高达1.5 μg/(kg·d)而对凝血功能没有不良影响^［20］。上述结果皆表明VitK₂作为食品补充是安全的，暂未有严重不良事件的发生，VitK₂缺乏儿童可通过此方法补充。

维生素D与VitK₂共同参与调节骨代谢，维生素D可在基因转录水平影响OC的合成，且OC合成与维生素D水平有关，多项研究报道维生素D与PINP、CTX水平的相关性，但结论尚未统一。洪维等^［21］在一项以1 389例体检人群为对象的研究中，发现25(OH)D与PINP呈负相关，且仅在25(OH)D严重减低时，PINP水平出现有统计学意义的升高，但与CTX无明显相关性，且CTX水平在不同维生素D水平间的差异无统计学意义。但另一项以2 798例德国学龄儿童为对象的研究中，发现外周循环中维生素D浓度越高，反映骨吸收水平的CTX浓度越低^［22］。由此可得出骨代谢标志物与维生素D含量相关，故将25(OH)D<50 nmol/L的儿童剔除，控制维生素D缺乏对试验研究的影响。

VitK₂作为非肝组织中VitK最丰富的形式，参与骨相关VitK依赖性蛋白质的羧化。当机体中的成骨细胞进行成熟分化时，可表达出一种特异性的非胶原蛋白，即OC。OC不仅可以调节骨吸收，而且在骨基质矿化和成骨细胞分化中起到关键作用。血清OC水平的升高提示骨形成速率加快，儿童时期骨代谢水平活跃，骨组织的形成大于吸收，从而实现骨量的积累，故儿童生长期血清OC水平多升高。本研究中，血清OC水平与血清VitK₂、年龄呈正相关，<1岁组儿童血清OC水平远低于>6~14岁组，这与金轶^［23］研究得出>3个月至1岁儿童VitK缺乏严重，易发生骨代谢异常结论一致。>6~14岁组血清OC呈较高水平，此现象考虑与青春期生长发育高峰骨代谢旺盛，骨形成速率加快有关。此外，还发现生长痛患儿VitK₂缺乏率升高，血清VitK₂又与血清OC呈正相关，考虑VitK₂缺乏可能是儿童骨痛产生的原因之一。国内外的多项研究也表明体内良好的VitK₂状态有利于骨健康，对骨代谢异常疾病有一定的治疗作用。如康丽娟等^［24］发现VitK可提高佝偻病患儿OC的羧化率，对佝偻病有一定的治疗作用；Nicolaidou等^［25］发现对囊性纤维化儿童补充VitK可改善患儿的整体骨健康状态。

CTX作为Ⅰ型胶原降解产物，主要反映骨吸收的状态，检测血清CTX水平可以预测骨转换的活跃程度，<1岁组儿童血清CTX水平明显高于>3~6岁组和>6~14岁组，提示<1岁组骨转换水平活跃，符合婴儿期的生长发育规律。PINP由成骨细胞分泌，反映骨形成状态，是新骨形成的特异性敏感指标，<1岁组儿童血清PINP水平低于>3~6岁组和>6~14岁组年龄组，血清PINP水平与年龄呈正相关，提示随着年龄的增长实现骨量积累，促进其生长发育。骨代谢包括骨吸收和骨形成过程，破骨细胞吸收旧骨，成骨细胞生成新骨取代以完成骨转换，不同时期骨转换水平不同，本研究发现血清CTX与PINP水平呈负相关，提示CTX与PINP间存在相互转换、相互博弈现象，符合骨代谢的病理生理过程。在相关性分析中未发现血清VitK₂与血清CTX、PINP的关联性，考虑两指标只受维生素D的影响，也可能与本研究纳入样本量较小有关。

综上所述，VitK₂与OC存在相关性，可通过作用于OC来调节骨代谢影响骨健康。血清VitK₂缺乏组超重/肥胖发生率高于正常组，提示VitK₂缺乏可能与超重/肥胖有关，建议临床医生及家长应高度重视超重/肥胖儿童VitK₂的营养状况。本研究虽验证了VitK₂与骨代谢标志物的相关性，但未对VitK₂缺乏儿童进行相关研究，存在一定的不足。另外纳入本研究对象为我院门诊常规体检儿童，存在一定的选择偏倚，仍需大量前瞻性、多中心基于儿童的临床试验研究来获得VitK₂的营养分布状况，并发布相应的临床预防及补充方案。

基金资助

国家卫生健康委医药卫生科技发展研究中心课题（WA2020HK15）。

利益冲突声明

所有作者声明不存在利益冲突关系。