Abstract
目的
探讨自噬在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的人肺泡上皮A549细胞炎症反应中的作用及机制。
方法
用LPS刺激A549细胞建立炎症反应模型，按浓度（0、1、5、10 μg/mL）和时间（0、4、8、12、24 h）分组（各组n=3）。用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）处理细胞，分为对照组、LPS组、3-MA组、3-MA+LPS组（各组n=3）；用自噬激动剂雷帕霉素（rapamycin，RAPA）处理细胞，分为对照组、LPS组、RAPA组、RAPA+LPS组（各组n=3）。通过Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）过表达质粒和siRNA转染A549细胞，实验分为两部分，每部分各分4组（各组n=3）：TLR4过表达对照组、TLR4过表达组、TLR4过表达对照+LPS组、TLR4过表达+LPS组；TLR4沉默对照组、TLR4沉默组、TLR4沉默对照+LPS组、TLR4沉默+LPS组。采用CCK-8法检测细胞存活率，免疫印迹法检测炎症指标（NLRP3、Caspase-1、ASC）、自噬指标（LC3B、Beclin-1、P62）、TLR4蛋白表达水平。
结果
1 μg/mL浓度的LPS刺激12 h后，炎症指标（NLRP3、Caspase-1、ASC）、自噬指标（LC3B、Beclin-1、P62）和TLR4蛋白表达均明显升高并达峰值（P<0.05）。与LPS组比较，3-MA+LPS组自噬相关蛋白表达降低，炎症相关蛋白表达升高，TLR4蛋白表达上调；RAPA+LPS组自噬相关蛋白表达升高，炎症相关蛋白表达降低，TLR4蛋白表达下调（P<0.05）。TLR4过表达+LPS组较TLR4过表达对照+LPS组自噬相关蛋白表达降低，炎症相关蛋白表达升高；TLR4沉默+LPS组较TLR4沉默对照+LPS组自噬相关蛋白表达升高，炎症相关蛋白表达降低（P<0.05）。
结论
在LPS诱导的人肺泡上皮A549细胞炎症反应中，自噬流对A549细胞具有一定保护作用；TLR4介导自噬流对LPS诱导的人肺泡上皮A549细胞炎症反应进行负向调控。
Keywords: 自噬, 炎症反应, 脂多糖, 人肺泡上皮A549细胞
Abstract
Objective
To study the role and mechanism of autophagy in lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammatory response of human alveolar epithelial A549 cells.
Methods
A549 cells were stimulated with LPS to establish a cell model of inflammatory response, and were then grouped (n=3 each) by concentration (0, 1, 5, and 10 μg/mL) and time (0, 4, 8, 12, and 24 hours). The A549 cells were treated with autophagy inhibitor 3-methyladenine (3-MA) to be divided into four groups (n=3 each): control, LPS, 3-MA, and 3-MA+LPS. The A549 cells were treated with autophagy agonist rapamycin (RAPA) to be divided into four groups (n=3 each): control, LPS, RAPA, and RAPA+LPS. The A549 cells were transfected with the Toll-like receptor 4 (TLR4) overexpression plasmid to be divided into four groups (n=3 each): TLR4 overexpression control, TLR4 overexpression, TLR4 overexpression control+LPS, and TLR4 overexpression+LPS. The A549 cells were transfected with TLR4 siRNA to be divided into four groups (n=3 each): TLR4 silencing control,TLR4 silencing, TLR4 silencing control+LPS, and TLR4 silencing+LPS. CCK-8 assay was used to measure cell viability. Western blot was used to measure the protein expression levels of inflammatory indicators (NLRP3, Caspase-1, and ASC), autophagic indicators (LC3B, Beclin-1, and P62), and TLR4.
Results
After stimulation with 1 μg/mL LPS for 12 hours, the levels of inflammatory indicators (NLRP3, Caspase-1, and ASC), autophagic indicators (LC3B, Beclin-1, and P62), and TLR4 increased and reached the peak (P<0.05). Compared with the LPS group, the 3-MA+LPS group had reduced expression of autophagy-related proteins and increased expression of inflammation-related proteins and TLR4, while the RAPA+LPS group had increased expression of autophagy-related proteins and reduced inflammation-related proteins and TLR4 (P<0.05). The TLR4 overexpression+LPS group had reduced autophagy-related proteins and increased inflammation-related proteins compared with the TLR4 overexpression control+LPS group, and the TLR4 silencing+LPS group had increased autophagy-related proteins and reduced inflammation-related proteins compared with the TLR4 silencing control+LPS group (P<0.05).
Conclusions
In the LPS-induced inflammatory response of human alveolar epithelial A549 cells, autophagic flux has a certain protective effect on A549 cells. TLR4-mediated autophagic flux negatively regulates the LPS-induced inflammatory response of A549 cells.
Keywords: Autophagy, Inflammatory response, Lipopolysaccharide, Human alveolar epithelial A549 cell
急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是机体在遭受各种病理刺激（如缺氧、感染、休克等）后发生的一种急性肺损伤（acute lung injury，ALI），是新生儿临床常见的危重症。其特征是肺泡-毛细血管膜屏障遭到破坏，从而增强炎症细胞的迁移能力和促炎细胞因子的产生，使炎症反应失控［1］。迄今为止，ARDS的发病率和病死率一直居高不下。因此，迫切需要阐明新生儿ARDS的发病机制以制订相应的防治措施。
自噬是一种古老的、进化保守的细胞内消化和再循环途径，主要包括巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬3种类型，对于维持细胞的正常功能及细胞稳态具有重要作用。巨自噬以其处理大型细胞内结构的能力著称，双膜囊泡结构的自噬体也成为其区别于另外两种自噬形式的特征。自噬参与人类多种疾病的发生、发展过程，本研究主要对巨自噬（以下简称“自噬”）进行研究。自噬被认为是应对炎症的一种基本细胞反应，其相关途径（如微管相关蛋白轻链3相关吞噬作用和非常规分泌等）是免疫和炎症的核心稳态机制［2］。一般来说，自噬有助于宿主激活免疫以控制感染，同时限制有害的、不受控制的炎症反应。在先天免疫系统中，Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）是一种重要的模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR），PRR通过识别病原体相关分子模式或危险相关分子模式，调节先天免疫或炎症过程［3］。TLR4也是第1个被证明参与自噬过程的受体［4］。TLR4经脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）激活后产生的细胞因子参与病原体的清除，对机体有益；但当该过程失调时，可能会导致危及生命的病理生理改变，如新生儿ARDS［5］。因此，TLR4被认为是一个重要的药理学靶点。目前有关自噬与新生儿ARDS发病关系的研究报道极少，自噬在新生儿ARDS炎症反应所致肺损伤中的作用与机制尚不明了。本实验利用LPS诱导人肺泡上皮A549细胞（简称“A549细胞”）炎症反应来模拟新生儿ARDS发病过程中失控的炎症反应与肺损伤变化，旨在探讨自噬在炎症反应导致肺损伤过程中的作用及其机制，为新生儿ARDS的防治提供新的途径和实验依据。
1. 材料与方法
1.1. 细胞和主要试剂
人肺泡上皮细胞株A549（上海中乔新舟生物科技有限公司）；DMEM高糖培养基（Gibco，美国）；磷酸缓冲盐溶液、内参β-actin（武汉赛维尔生物科技有限公司）；胎牛血清（PAN，德国）；LPS、兔抗LC3B、P62抗体（Sigma，美国）；兔抗Beclin-1抗体（Abcam，英国）；兔抗NLRP3、TLR4抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；兔抗Caspase-1、ASC抗体、内参GAPDH（武汉三鹰生物技术有限公司）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体（南京巴傲得生物科技有限公司）；3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）、雷帕霉素（rapamycin，RAPA）（MCE，美国）；CCK-8试剂盒（Dojindo，日本）；LipofectamineTM 2000（Invitrogen Life Technologies，美国）；人源TLR4过表达载体质粒、TLR4 siRNA（均由南京锐博生物科技有限公司设计）；RIPA裂解液（上海碧云天生物技术有限公司）。
1.2. A549细胞培养及实验分组
向人肺泡上皮细胞株A549细胞中施加含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。当细胞密度长至90%后弃培养液，磷酸缓冲盐溶液清洗2次，以0.25%EDTA胰酶消化细胞，调整细胞密度接种于细胞培养板中，培养至细胞稳定贴壁。
（1）浓度梯度分组：加入不同浓度（0、1、5、10 μg/mL）的LPS工作液，刺激12 h；时间梯度分组：加入浓度为1 μg/mL的LPS工作液，刺激不同的时间（0、4、8、12、24 h）。收样前0.5 h加入三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）（浓度为5 mmol/L）。收集各组细胞沉淀，用于后续蛋白检测。
（2）细胞自噬抑制实验分为：对照组、LPS组、3-MA组、3-MA+LPS组。3-MA组和3-MA+LPS组加入浓度为5 mmol/L的自噬抑制剂3-MA与细胞共培养12 h。细胞自噬激动实验分为：对照组、LPS组、RAPA组、RAPA+LPS组。RAPA组和RAPA+LPS组加入浓度为100 nmol/L的自噬激动剂RAPA与细胞共培养12 h。LPS的处理浓度为1 μg/mL，处理时间为12 h。收样前0.5 h加入ATP。收集各组细胞沉淀，用于后续蛋白检测。
（3）细胞转染实验分两部分，每部分各分4组：TLR4过表达对照组、TLR4过表达组、TLR4过表达对照+LPS组、TLR4过表达+LPS组；TLR4沉默对照组、TLR4沉默组、TLR4沉默对照+LPS组、TLR4沉默+LPS组。
1.3. 细胞转染
将细胞接种至6孔板中，待细胞密度长至40%~60%时进行转染。转染前2 h对细胞进行换液。通过构建质粒载体过表达TLR4，使用siRNA沉默TLR4，针对质粒和siRNA进行转染工作液的配制：将4 μg的TLR4过表达/空载质粒DNA和10 μL浓度为20 μmol/L的TLR4 siRNA及其对照siRNA加至250 μL的无血清培养基中，混匀，再将5~10 μL的LipofectamineTM 2000加至另外250 μL的无血清培养基中，混匀，室温静置5 min，再将两者混合，室温静置20 min。从每孔中吸出500 μL培养基弃去，再按每孔500 μL将上述配制的混合液加入，混匀，4~6 h后换液，转染48 h。收样前0.5 h加入ATP（浓度为5 mmol/L）。收集各组细胞沉淀，用于后续蛋白检测。
1.4. CCK-8法检测细胞存活率
将细胞接种于96孔板中培养12~24 h。以浓度为0、1、5、10 μg/mL的LPS刺激12 h；以浓度为1 μg/mL的LPS分别刺激0、4、8、12、24 h，收样前0.5 h加入ATP，后每孔加入10 μL的CCK-8溶液，1~4 h后应用酶标仪检测450 nm处各孔吸光度。实验独立重复3次。
1.5. Western blot法检测蛋白表达
采用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，并经二喹啉甲酸法测定蛋白质浓度。通过SDS-PAGE电泳分离蛋白后转移到PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，分别孵育相应抗体：微管相关蛋白1轻链3B（microtubule associated protein 1 light chain 3 beta，MAP1LC3B，LC3B）、Beclin-1、P62、NLRP3、Caspase-1、ASC、TLR4（均为1∶1 000配制），4℃过夜。TBST洗膜（10 min×3次），室温孵育二抗（1∶5 000）1 h，TBST洗膜（10 min×3次），用ECL发光剂荧光显色，在化学发光凝胶成像系统曝光观察蛋白条带。以GAPDH（1∶5 000）或β-actin（1∶1 000）作为内参，分析各条带灰度值。实验独立重复3次。
1.6. 统计学分析
采用GraphPad Prism 8.0进行分析和统计。正态分布的计量资料以均数±标准差（ ）表示，两组间比较采用两样本t检验，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t法。P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. LPS刺激对A549细胞存活率的影响
在培养的A549细胞中以不同浓度（0、1、5、10 μg/mL）的LPS刺激12 h，与0 μg/mL组（100.0%±0.0%）相比，1 μg/mL组（86.0%±1.2%），5 μg/mL组（72.8%±1.9%）和10 μg/mL组（63.6%±1.0%）的细胞存活率随LPS浓度的增加逐渐降低；以1 μg/mL的LPS在A549细胞中刺激不同的时间（0、4、8、12、24 h），与0 h组（100.0%±0.0%）相比，细胞存活率在4 h组（97.67%±0.23%）、8 h组（94.21%±0.65%）及12 h组（95.15%±0.59%）仅有轻微降低，24 h组（72.33%±1.59%）则明显降低，差异均有统计学意义（P<0.05），见图1。
图1. 不同LPS的刺激浓度和时间对A549细胞存活率的影响 A：不同浓度LPS刺激A549细胞存活率比较；B：不同LPS刺激时间A549细胞存活率比较。a示与0 μg/mL组比较，P<0.05；b示与0 h组比较，P<0.05。.
2.2. LPS对A549细胞炎症水平的影响
在培养的A549细胞中以不同浓度（0、1、5、10 μg/mL）的LPS刺激12 h，炎症指标NLRP3、Caspase-1和ASC蛋白表达水平在1 μg/mL组升高并达到高峰，与0 μg/mL组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；以1 μg/mL的LPS在A549细胞中刺激不同的时间（0、4、8、12、24 h），炎症指标NLRP3、Caspase-1和ASC蛋白表达水平均在12 h组升高并达到高峰，与0 h组比较，差异均有统计学意义（P<0.05），见图2及表1~2。
图2. LPS对A549细胞炎症蛋白表达的影响 a示与0 μg/mL组比较，P<0.05；b示与0 h组比较，P<0.05。.
表1.
不同浓度LPS刺激各组炎症及自噬相关蛋白表达的比较 （ ，n=3）
| 组别 | NLRP3 | Caspase-1 | ASC | LC3B-Ⅱ/Ⅰ | Beclin-1 | P62 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 0 μg/mL组 | 0.945±0.011 | 0.546±0.026 | 0.836±0.016 | 4.371±0.509 | 1.158±0.037 | 0.880±0.031 |
| 1 μg/mL组 | 1.046±0.022a | 1.033±0.051a | 1.113±0.044a | 6.395±0.036a | 1.464±0.085a | 1.258±0.044a |
| 5 μg/mL组 | 0.774±0.035 | 0.552±0.069 | 0.917±0.138 | 5.277±0.583 | 1.293±0.083 | 0.859±0.164 |
| 10 μg/mL组 | 0.557±0.006 | 0.848±0.038a | 0.603±0.112 | 4.592±0.115 | 1.090±0.088 | 0.636±0.098 |
| F值 | 96.67 | 24.16 | 5.26 | 5.40 | 4.70 | 6.78 |
| P值 | <0.001 | <0.001 | 0.027 | 0.025 | 0.036 | 0.014 |
注：a示与0 μg/mL组比较，P<0.05。
表2.
LPS刺激不同时间各组炎症及自噬相关蛋白表达的比较 （ ，n=3）
| 组别 | NLRP3 | Caspase-1 | ASC | LC3B-Ⅱ/Ⅰ | Beclin-1 | P62 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 0 h组 | 0.60±0.07 | 0.475±0.005 | 0.435±0.066 | 2.653±0.213 | 0.789±0.053 | 0.537±0.119 |
| 4 h组 | 0.75±0.09 | 0.661±0.105 | 0.502±0.109 | 3.033±0.624 | 0.750±0.121 | 0.949±0.070a |
| 8 h组 | 0.76±0.04 | 0.643±0.092 | 0.672±0.058 | 2.986±0.543 | 0.978±0.038a | 1.110±0.077a |
| 12 h组 | 1.07±0.04a | 1.002±0.123a | 0.949±0.022a | 5.079±0.182a | 1.045±0.036a | 1.263±0.018a |
| 24 h组 | 0.72±0.10 | 0.577±0.046 | 0.815±0.028a | 4.146±0.306a | 0.779±0.047 | 0.928±0.136 |
| F值 | 6.07 | 5.37 | 10.92 | 5.95 | 3.97 | 8.41 |
| P值 | 0.010 | 0.014 | 0.001 | 0.010 | 0.035 | 0.003 |
注：a示与0 h组比较，P<0.05。
2.3. LPS对A549细胞自噬水平的影响
在培养的A549细胞中以不同浓度（0、1、5、10 μg/mL）的LPS刺激12 h，自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1和P62的表达水平均在1 μg/mL组升高并达到高峰，与0 μg/mL组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；以1 μg/mL的LPS在A549细胞中刺激不同的时间（0、4、8、12、24 h），自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1和P62的表达水平均在12 h组升高并达到高峰，与0 h组比较，差异均有统计学意义（P<0.05），见图3及表1~2。
图3. LPS对A549细胞自噬相关蛋白表达的影响 a示与0 μg/mL组比较，P<0.05；b示与0 h组比较，P<0.05。.
2.4. LPS对A549细胞TLR4蛋白表达水平的影响
在培养的细胞中以不同浓度（0、1、5、10 μg/mL）的LPS刺激12 h，TLR4蛋白表达水平在1 μg/mL组（0.585±0.054）升高并达到高峰，与0 μg/mL组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；以1 μg/mL的LPS在A549细胞中刺激不同的时间（0、4、8、12、24 h），TLR4蛋白表达水平在12 h组（1.090±0.031）升高并达到高峰，与0 h组比较，差异有统计学意义（P<0.05），见图4。
图4. LPS对A549细胞TLR4蛋白表达的影响 A：不同浓度LPS刺激TLR4蛋白表达变化；B：不同LPS刺激时间TLR4蛋白表达变化。a示与0 μg/mL组比较，P<0.05；b示与0 h组比较，P<0.05。.
2.5. 自噬对炎症的影响
2.5.1. 自噬抑制剂3-MA对炎症及自噬相关蛋白表达水平的影响
在自噬抑制剂3-MA的处理下，自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平明显降低，P62蛋白表达水平明显升高；而炎症指标NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表达水平明显升高，与对照组比较，差异均具有统计学意义（P<0.05）。经LPS（1 μg/mL，12 h）刺激后，3-MA+LPS组自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达仍呈降低趋势，P62蛋白表达进一步升高；炎症指标NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表达水平则进一步升高，与LPS组比较，差异均具有统计学意义（P<0.05），见图5和表3。
图5. 自噬抑制剂/激动剂对炎症及自噬蛋白表达的影响 A：自噬激动剂3-MA干预后各组炎症及自噬相关蛋白表达电泳图；B：自噬激动剂RAPA干预后各组炎症及自噬相关蛋白表达电泳图。.
表3.
自噬抑制剂3-MA干预后炎症及自噬蛋白表达的比较 （ ，n=3）
| 组别 | NLRP3 | Caspase-1 | ASC | LC3B-Ⅱ/Ⅰ | P62 |
|---|---|---|---|---|---|
| 对照组 | 0.604±0.050 | 0.616±0.015 | 0.395±0.045 | 1.109±0.036 | 0.790±0.120 |
| LPS组 | 0.825±0.008a | 0.855±0.029a | 0.806±0.075a | 1.317±0.057a | 1.210±0.046a |
| 3-MA组 | 0.956±0.108a | 0.687±0.006a | 0.839±0.109a | 0.645±0.073a | 1.550±0.064a |
| 3-MA+LPS组 | 1.201±0.032b | 1.030±0.040b | 1.194±0.060b | 0.926±0.055b | 1.497±0.088b |
| F值 | 16.29 | 50.51 | 18.35 | 25.28 | 17.10 |
| P值 | 0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 |
注：a示与对照组比较，P<0.05；b示与LPS组比较，P<0.05。［LPS］脂多糖；［3-MA］3-甲基腺嘌呤。
2.5.2. 自噬激动剂RAPA对炎症及自噬相关蛋白表达水平的影响
在自噬激动剂RAPA的处理下，自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达水平明显升高，P62蛋白表达水平明显降低；而炎症指标NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表达水平明显降低，与对照组比较，差异均具有统计学意义（P<0.05）。经LPS（1 μg/mL，12 h）刺激后，RAPA+LPS组自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达进一步升高，P62蛋白表达则仍然是降低的；炎症指标NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表达水平仍呈降低趋势，与LPS组比较，差异均具有统计学意义（P<0.05），见图5和表4。
表4.
自噬激动剂RAPA干预后炎症及自噬蛋白表达的比较 （ ，n=3）
| 组别 | NLRP3 | Caspase-1 | ASC | LC3B-Ⅱ/Ⅰ | P62 |
|---|---|---|---|---|---|
| 对照组 | 0.525±0.057 | 0.795±0.031 | 0.722±0.027 | 2.111±0.078 | 0.906±0.026 |
| LPS组 | 0.735±0.022a | 0.948±0.018a | 0.944±0.027a | 4.845±0.446a | 1.066±0.029a |
| RAPA组 | 0.143±0.017a | 0.570±0.075a | 0.247±0.038a | 11.700±0.507a | 0.432±0.109a |
| RAPA+LPS组 | 0.358±0.013b | 0.573±0.085b | 0.349±0.065b | 8.001±0.621b | 0.452±0.142b |
| F值 | 59.26 | 9.61 | 58.79 | 80.56 | 12.29 |
| P值 | <0.0001 | 0.005 | <0.0001 | <0.0001 | 0.0023 |
注：a示与对照组比较，P<0.05；b示与LPS组比较，P<0.05。［LPS］脂多糖；［RAPA］雷帕霉素。
2.5.3. 自噬抑制/激动剂对TLR4蛋白表达水平的影响
在自噬抑制剂3-MA的处理下，3-MA组（0.531±0.036）较对照组（0.325±0.042）TLR4蛋白表达上调；经LPS（1 μg/mL，12 h）刺激后，3-MA+LPS组（0.620±0.018）较LPS组（0.475±0.032）TLR4蛋白表达水平进一步增加，差异有统计学意义（P<0.05）；在自噬激动剂RAPA的处理下，RAPA组（0.392±0.088）较对照组（0.825±0.039）TLR4蛋白表达下调；经LPS（1 μg/mL，12 h）刺激后，RAPA+LPS组（0.445±0.129）较LPS组（1.003±0.046）TLR4蛋白表达水平降低，差异有统计学意义（P<0.05），见图6。
图6. 自噬抑制/激动剂对TLR4蛋白表达的影响 A：自噬抑制剂3-MA处理后各组TLR4蛋白表达电泳图；B：自噬激动剂RAPA处理后各组TLR4蛋白表达电泳图。.
2.6. TLR4对A549细胞炎症及自噬水平的影响
2.6.1. 过表达TLR4对A549细胞炎症及自噬水平的影响
过表达TLR4后，自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达明显降低，P62蛋白表达明显升高；炎症指标Caspase-1、ASC的蛋白表达水平呈升高趋势，与TLR4过表达对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。经LPS（1 μg/mL，12 h）刺激后，TLR4过表达+LPS组自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达仍是降低的，P62蛋白表达则进一步升高；炎症指标Caspase-1、ASC蛋白表达水平进一步升高，与TLR4过表达对照+LPS组比较，差异均具有统计学意义（P<0.05），见图7和表5。
图7. TLR4过表达/沉默对A549细胞中炎症及自噬蛋白表达的影响 A：TLR4过表达后各组炎症及自噬相关蛋白表达电泳图；B：TLR4沉默后各组炎症及自噬相关蛋白表达电泳图。.
表5.
TLR4过表达后炎症及自噬相关蛋白表达的比较 （ ，n=3）
| 组别 | TLR4 | Caspase-1 | ASC | LC3B-Ⅱ/Ⅰ | P62 |
|---|---|---|---|---|---|
| TLR4过表达对照组 | 0.552±0.014 | 0.425±0.030 | 0.662±0.017 | 6.075±0.321 | 0.198±0.004 |
| TLR4过表达组 | 0.634±0.020a | 0.512±0.009a | 0.920±0.089a | 4.962±0.196a | 0.233±0.008a |
| TLR4过表达对照+LPS组 | 0.951±0.072a | 0.623±0.063a | 0.739±0.013a | 7.597±0.433a | 0.843±0.046a |
| TLR4过表达+LPS组 | 1.236±0.056b | 0.869±0.048b | 0.980±0.063b | 5.153±0.519b | 1.011±0.033b |
| F值 | 44.39 | 20.40 | 7.29 | 9.68 | 211.90 |
| P值 | <0.001 | <0.001 | 0.011 | 0.005 | <0.001 |
注：a示与TLR4过表达对照组比较，P<0.05；b示与TLR4过表达对照+LPS组比较，P<0.05。［LPS］脂多糖；［TLR4］Toll样受体4。
2.6.2. 沉默TLR4对A549细胞炎症反应及自噬水平的影响
沉默TLR4后，自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达升高，P62蛋白表达下降；而炎症指标Caspase-1、ASC蛋白表达水平明显降低，与TLR4沉默对照组比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。经LPS（1 μg/mL，12 h）刺激后，TLR4沉默+LPS组自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表达进一步升高，P62蛋白表达水平降低；炎症指标Caspase-1、ASC的蛋白表达水平进一步降低，与TLR4沉默对照+LPS组比较，差异均具有统计学意义（P<0.05），见图7和表6。
表6.
TLR4沉默后炎症及自噬相关蛋白表达的比较 （ ，n=3）
| 组别 | TLR4 | Caspase-1 | ASC | LC3B-Ⅱ/Ⅰ | P62 |
|---|---|---|---|---|---|
| TLR4沉默对照组 | 0.831±0.038 | 1.024±0.026 | 0.612±0.037 | 4.185±0.155 | 0.842±0.009 |
| TLR4沉默组 | 0.563±0.087a | 0.900±0.023a | 0.369±0.058a | 8.890±1.185a | 0.699±0.020a |
| TLR4沉默对照+LPS组 | 0.990±0.040a | 1.107±0.009a | 0.794±0.037a | 11.660±0.723a | 0.997±0.040a |
| TLR4沉默+LPS组 | 0.756±0.062b | 0.982±0.042b | 0.560±0.026b | 30.010 ±5.661b | 0.765±0.031b |
| F值 | 8.63 | 9.93 | 18.07 | 15.05 | 21.75 |
| P值 | 0.007 | 0.005 | <0.001 | 0.001 | <0.001 |
注：a示与TLR4沉默对照组比较，P<0.05；b示与TLR4沉默对照+LPS组比较，P<0.05。［LPS］脂多糖；［TLR4］Toll样受体4。
3. 讨论
ALI/ARDS的病理生理特点是破坏肺泡毛细血管膜屏障，导致过度炎症反应和肺功能障碍［6］。因此，抑制炎症对ALI/ARDS至关重要。LPS是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，可刺激机体产生一系列炎症反应。特别是当LPS影响肺部时，会诱发ALI，严重时可发展为ARDS。因此，LPS被广泛用于ALI/ARDS临床相关动物或细胞模型的建立［7-8］。Ⅱ型肺泡上皮细胞的炎症损伤是ALI/ARDS发病过程中的主要病理生理变化，LPS暴露可导致这一变化［9］。而人肺泡上皮细胞株A549与Ⅱ型肺泡上皮细胞特征最为相似，是体外构建ALI/ARDS炎症模型使用最为广泛的细胞系［10-11］。因此，本实验采用A549细胞培养模拟LPS诱导的炎症反应及肺损伤，是常用的替代原代细胞培养的方法。
在本研究中，A549细胞经LPS（1 μg/mL，12 h）刺激后，炎症指标NLRP3、Caspase-1和ASC蛋白表达水平均升高并达到高峰。这些结果表明由LPS诱导的A549细胞炎症反应模型成功建立。同样条件下，自噬指标LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1和P62蛋白表达水平也升高达到高峰，这表明LPS虽然诱导自噬产生，但自噬流受到阻滞。自噬过程涉及几个步骤：启动和成核、扩增、自噬体形成、自噬体-溶酶体融合和降解。成核阶段磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）复合物的核心成分Beclin-1被激活以调节自噬体的大小和数量［12］。成核后，LC3-Ⅰ与磷脂酰乙醇胺结合，形成仅在成熟的自噬体上表达的LC3-Ⅱ形式。LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化的增加是自噬体形成的指标［13］。自噬体与溶酶体的融合是自噬货物降解的关键事件［14］。P62/SQSTM1作为一种机制来传递泛素化的蛋白质，通过与LC3相互作用靶向物质于自溶酶体处降解［15］。当自噬被抑制时P62会积累，而当自噬被诱导时可以观察到P62水平降低。因此，P62常用作研究动态自噬流的标志物。自噬流始于自噬体的形成，并以溶酶体的底物降解结束，LC3B代表自噬流启动，而P62代表自噬流终止，完整通畅的自噬流才能使自噬真正发挥作用，达到降解物质的目的。本研究CCK-8实验结果显示，LPS浓度过高或者刺激时间过长都会对细胞造成较大的损害，影响各实验指标的表达。因此，结合上述实验结果，我们认为1 μg/mL浓度的LPS刺激12小时是诱导A549细胞炎症反应模型，探究自噬作用的最适条件。
为进一步探究自噬和炎症反应之间的关系，我们选择在细胞模型上调节自噬来观察炎症反应的变化。3-MA是一种PI3K抑制剂，通过阻止PI3KC3与beclin-1结合形成自噬体来抑制自噬，是常用的自噬抑制剂。RAPA通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）复合物的活性来激活自噬，是常用的自噬激动剂。在3-MA（5 mmol/L，12 h）的处理下，LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达减少，P62表达增加，自噬受到抑制且自噬流受阻，而炎症指标NLRP3、Caspase-1和ASC蛋白表达水平升高；在此基础上，LPS的刺激使P62蛋白表达水平进一步升高，自噬流进一步受到阻滞，同时，NLRP3、Caspase-1和ASC蛋白表达水平也进一步升高。而当RAPA激活自噬后，自噬流恢复通畅，炎症反应减轻。这些结果说明自噬流对炎症反应起到负调控的作用。这与许多研究结果一致，表明维持正常的自噬流具有潜在的抗炎作用，比如谷胱甘肽S-转移酶P1通过抑制PI3K-Akt-mTOR通路促进自噬流通畅对LPS诱导的炎症反应发挥保护作用［16］；雌激素相关受体α通过增加自噬流和控制宿主肠道微生物群来改善结肠炎症反应，从而充当肠道稳态的关键调节剂［17］；LPS可诱导自噬流阻塞而促发炎症反应，褪黑激素通过促进自噬流而具有有效的抗炎作用［18］。这也说明，维持一定水平的自噬是必要的，自噬在炎症反应中可起到一定的细胞保护作用。
TLR4被称为自噬的环境传感器［19］。在本研究中，LPS的刺激和3-MA的自噬阻断均可引起TLR4蛋白表达上调，而RAPA的自噬激活则引起TLR4蛋白表达下调。为了确定TLR4对自噬及炎症反应的影响，我们使用TLR4过表达/空载质粒和针对TLR4的siRNA/阴性对照siRNA转染A549细胞，用LPS处理细胞并评估自噬流。研究结果显示，TLR4过表达组，LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达减少，P62表达升高，自噬水平降低，自噬流阻滞；TLR4沉默组，LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达升高，P62表达减少，自噬水平升高，自噬流通畅，表明TLR4对自噬流具有负调控作用。在LPS的刺激下，TLR4过表达+LPS组LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达仍是降低的，P62表达则进一步升高，自噬流进一步受到阻滞；而沉默TLR4+LPS组自噬水平进一步升高，自噬流通畅，说明LPS经TLR4对自噬流具有负调控作用。同时我们发现，当自噬流阻滞时，炎症反应进一步升高；当自噬流通畅时，炎症反应减轻。自噬被认为是炎症反应的主要负调节因子［20］。本研究证明TLR4介导自噬流在LPS诱导的A549细胞炎症反应中发挥负调控作用。自噬对细胞的保护作用是建立在自噬流通畅的基础上，自噬流的通畅性抑制了LPS引起的炎症级联反应，这可能为ARDS有效的抗炎治疗提供一种新方法。
本实验仍有不足之处。在细胞系选择方面，没有使用原代肺泡上皮细胞，研究的借鉴意义相对受限，另外尚未进行在体动物实验验证，有待下一步深入研究。自噬流的检测方法除了免疫印迹法，还有自噬mRFP-GFP-LC3双标示踪法等，均有待后续补充。本研究中，我们对自噬的研究着眼于自噬流这一关键点，初步阐述自噬对ARDS中炎症反应的调控机制，这可能仅仅是自噬复杂调控网络中的一小部分，关于肺上皮细胞自噬的上游信号或调节因子我们依然知之甚少。自噬在肺损伤中扮演着“双刃剑”的角色，值得我们进行更多地探索。新生儿作为一个特殊的阶段，新生儿疾病的防治一直在不断更新与完善。通过自噬来了解和重新认识新生儿ARDS是一个新角度，可能为新生儿ARDS防治找到新的突破口，为降低新生儿疾病的发生率、病死率等作出贡献。
基金资助
国家自然科学基金项目（81571476；81741086）；江苏省自然科学基金项目（BK20141080）；张家港科技计划项目（ZKS1512）。
利益冲突声明
所有作者均声明不存在利益冲突。
参 考 文 献
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