Abstract
目的
探讨参白解毒方（SBJDF）对结直肠腺瘤形成及癌变的影响及其对PTEN/PI3K/AKT信号通路的调控作用。
方法
将4周龄的雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组（10只）、AOM/DSS模型组（20只）、参白解毒方低剂量组（14 g/kg，10只）和参白解毒方高剂量组（42 g/kg，10只）。除对照组外，其余各组采用AOM/DSS诱导小鼠结直肠腺瘤癌变模型，处理组于造模中给予参白解毒方灌胃干预。比较各组小鼠的生存率、体质量和生存状态，观察肠道组织腺瘤形成及癌变等病理情况，免疫组化检测肠道组织PTEN/PI3K/AKT信号通路相关分子的表达。
结果
参白解毒方干预后小鼠的肿瘤发生率、数量和体积均显著低于AOM/DSS模型组，且高剂量的参白解毒方抑制效果更佳。HE病理切片结果显示模型组已形成腺癌，而参白解毒方可以抑制腺瘤的形成及癌变，参白解毒方低剂量组小鼠肠道同时存在腺瘤低级别瘤变和高级别瘤变，参白解毒方高剂量组小鼠肠道以正常粘膜组织为主，仅发现局部少量腺瘤低级别瘤变。机制研究发现模型组血浆中miRNA-222表达高于空白组（P < 0.05），用药各组miRNA-222的表达量较模型组下调（P < 0.01）；小鼠肠道组织免疫组化结果显示，与AOM/DSS模型组相比，参白解毒方处理后PTEN、p-PTEN、GSK-3β表达上调，且在低剂量组、高剂量组表达有依次递增趋势；p-GSK-3β、PI3K、AKT、p-AKT、β-catenin、c-myc、CyclinD1、Survivin表达下调，且在低剂量组、高剂量组表达呈递减趋势。
结论
参白解毒方可以显著抑制小鼠结直肠腺瘤形成及癌变，其作用机制可能与调控miRNA-222及影响PTEN/PI3K/AKT信号通路有关。
Keywords: 参白解毒方, 结直肠腺瘤, 癌变, miRNA-222, PTEN/PI3K/AKT信号通路, AOM/DSS小鼠模型
Abstract
Objective
To observe the inhibitory effect of Shenbai Jiedu Fang (SBJDF, a compound recipe of traditional Chinese herbal drugs) on chemically induced carcinogenesis of colorectal adenoma in mice and explore the role of PTEN/PI3K/AKT signaling pathway in mediating this effect.
Methods
Four-week-old male C57BL/6 mice were randomly divided into control group (n=10), AOM/DSS model group (n=20), low-dose (14 g/kg) SBJDF group (n=10) and high-dose (42 g/kg) SBJDF group (n= 10). In the latter 3 groups, the mice were treated with azoxymethane (AOM) and dextran sodium sulphate (DSS) to induce carcinogenesis of colorectal adenoma. In the two SBJDF treatment groups, SBJDF was administered daily by gavage during the modeling. The survival rate, body weight, general condition of the mice, and intestinal adenoma formation and carcinogenesis were observed. The expressions of proteins associated with the PTEN/PI3K/AKT signaling pathway in the intestinal tissue were detected using immunohistochemistry.
Results
Compared with those in the model group, the mice treated with SBJDF, especially at the high dose, showed a significantly lower incidence of intestinal carcinogenesis and had fewer intestinal tumors with smaller tumor volume. Pathological examination showed the occurrence of adenocarcinoma in the model group, while only low-grade and high-grade neoplasia were found in low-dose SBJDF group; the mice treated with high-dose SBJDF showed mainly normal mucosal tissues in the intestines with only a few lesions of low-grade neoplasia of adenoma. Compared with those in the control group, the mice in the model group had significantly elevated plasma miRNA-222 level (P < 0.05), which was obviously lowered in the two SBJDF groups (P < 0.01). The results of immunohistochemistry revealed that compared with the model group, the two SBJDF groups, especially the high-dose group, had significantly up-regulated expressions of PTEN, P-PTEN and GSK-3β and down-regulated expressions of p-GSK-3 β, PI3K, AKT, P-AKT, β-catenin, c-myc, cyclinD1 and survivin in the intestinal tissues.
Conclusion
SBJDF can significantly inhibit colorectal adenoma formation and carcino-genesis in mice possibly through regulating miRNA-222 and affecting PTEN/PI3K/AKT signaling pathway.
Keywords: Shenbai Jiedu Fang, colorectal adenoma, carcinogenesis, miRNA-222, PTEN/PI3K/AKT signaling pathway, AOM/DSS murine mode
结直肠癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，据2020年全球癌症发病率和死亡率估计数据显示，其发病率位列全球第3，死亡率位列全球第2[1]，研究结直肠癌的发病机制对其预防、治疗及预后具有重要意义。结直肠癌发生机制较为复杂，其中腺瘤癌变是已被广泛认可的主要途径之一[2]。结直肠腺瘤是结直肠癌最主要的癌前病变，80%以上的结直肠癌系由结直肠腺瘤演变而来，从其形态学观察，可看到肠上皮异型增生、腺瘤及癌变3个阶段，这期间可涉及错配修复基因的突变、抑癌基因的失活（如P53、PTEN的失活）和缺如；以及癌基因的激活（如K-ras的激活）等机制[3]，但其详细机制仍待进一步研究。
关于结直肠腺瘤癌变的机制可概括为：腺瘤-癌序贯学说、炎症促息肉癌变学说[4]、包含磷酸-酰激转移酶-3-激酶（PI3K）、蛋白激酶（AKT）途径在内的信号通路学说[5]及其他机制，如近年来提出的肠道菌群失调引起的肠腺瘤癌变机制[6]。有研究发现PI3K p110α和PI3K p110β在绒毛状腺瘤、锯齿状腺瘤和癌变腺瘤中高表达，提示联合检测p110α和p110β有助于判断结直肠绒毛状腺瘤和锯齿状腺瘤的癌变潜能[7]。另有研究发现β-catenin、c-myc在结直肠腺瘤癌变组阳性表达率显著高于腺瘤组及正常组[8]。因PTEN具有PI3K活性，可以通过催化PIP3的3位脱磷酸下调PIP3的水平，从而拮抗PI3K的作用[9]，且有研究发现LncRNA GAS5通过与miR-222-3p竞争，上调PTEN的表达，从而促进细胞自噬和抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭[10]。然至今对结直肠腺瘤癌变的研究仍处于初期阶段，且近5年的研究较少，以上研究均缺乏系统性，目前的文献多仅观察到部分分子在腺瘤、腺癌中的表达差异，尚未有研究报道miR-222在结直肠腺瘤形成及癌变中的作用。鉴于前人研究发现β-catenin在大肠癌腺瘤癌变中有重要作用，PI3K/AKT通路的激活可以使GSK-3β失活，导致核内β-catenin累积，而PTEN可反向调控PI3K/AKT，结合miR-222可以抑制PTEN的表达[11]，从而激活PI3K/AKT信号通路[12]；结合动物实验预实验，本文提出假设，在结直肠腺瘤癌变过程中，miRNA-222可通过调控PTEN激活PI3K/AKT通路从而促进结直肠腺癌形成。
国内外尚没有公认的预防结直肠腺瘤再发、复发及癌变的有效治疗方案，近年来，随着中医“治未病”理论体系的创新发展，中医药在防治癌前病变方面发挥了重要作用。已有临床研究表明中医药能够抑制结直肠腺瘤再发、复发及癌变[13]。参白解毒方是岐黄学者程海波教授临床经验方，主要由白花蛇舌草、苦参、党参、黄连、乌梅等药物组成，治疗结直肠腺瘤湿热毒蕴证，具有清热燥湿、消癌解毒、健脾益气的功效。结合前期临床实践发现参白解毒方能够减少结直肠腺瘤性息肉术后再复发及疾病恶化（异型增生、癌变），我们通过动物实验进一步观察参白解毒方对AOM/DSS小鼠腺瘤形成及癌变的影响，并通过对miRNA-222及PTEN/PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin通路相关分子表达情况的分析，探索其较为系统的作用机制，对临床上中医药预防结直肠腺癌的发生，降低其发病率具有非常重要的意义。
1. 材料和方法
1.1. 动物
SPF级C57BL/6J小鼠，体质量20±2 g，4周龄，雄性。小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，于南京中医药大学实验动物中心饲养，动物中心相对湿度为（55±15）%，环境温度为23±3 ℃，昼夜明暗交替时间（h）12/12。由南京中医药大学实验动物中心提供饲料和垫料，小鼠均为普通饮食，饲料和水随时供应，每周更换2次垫料。
1.2. 伦理审查
本动物实验方案获得南京中医药大学实验动物伦理委员会审核，符合动物保护、动物福利和伦理原则等相关规定，获得批准（批准号：202006A006）。
1.3. 药物
参白解毒方全方中药由江苏省中医院提供，由南京中医药大学药学院宿树兰教授鉴定为正品，在南京中医药大学制药实验中心制成生药含量为2 g/mL的溶液，冰箱4 ℃保存。
1.4. 试剂
葡聚糖硫酸钠（DSS，36000-50000W，MP Biomedicals）；偶氮甲烷（AOM，Sigma-Aldrich）；免疫组化通用SP试剂盒（北京中杉金桥生物科技有限公司）；苏木素伊红（HE）染色试剂盒（碧云天生物技术公司）。Cham Universal SYBR qPCR Master Mix（南京诺唯赞生物科技有限公司）；Anti-PTEN单抗，Anti-pPTEN单抗，Anti-PI3K单抗，Anti-AKT单抗，Anti-pAKT单抗，Anti-c-myc单抗（CS）；Anti-GSK-3β单抗，Anti-p-GSK-3β单抗，Anti-β-catenin单抗，Anti-Survivin单抗（Santa Cruz）；Anti-CyclinD1单抗（Abcam）。
1.5. 仪器
XD202型倒置显微镜（Leica）；IP54型游标卡尺（广州广卓量具公司）；BSA323S-CW型电子秤（上海衡器总厂）；CS-VI型摊片烤片机（孝感市宏业医用仪器有限公司）；ES-QP-001型切片机（Leica）；P70D20TL-D4型微波炉（广东格兰仕公司）。
1.6. 动物造模及分组给药
4周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠适应性饲养1周后，将所有小鼠随机分为空白组（10只）、AOM/DSS模型组（20只）、参白解毒方低剂量组（14 g/kg，10只）、参白解毒方高剂量组（42 g/kg，10只）。参白解毒方（94 g）低、高剂量通过人体用药量与小鼠换算（小鼠给药剂量=人给药剂量×换算系数=94 g∙d-1÷60 kg×9.1≈14 g∙kg-1∙d-1，得出剂量设定为参白解毒方低剂量，3倍剂量42 g∙kg-1∙d-1为参白解毒方高剂量。AOM/DSS模型组：实验第1天给予AOM腹腔注射（15 mg/kg）1次（为第1周第0天），1周之后给予含5%DSS的水饮用2 d（第2周），次日起饮用纯净水3周；再次进行5% DSS的饮用2 d后（第5周），饮用纯净水3周；第3次循环同第2次循环，含5%DSS的水饮用2 d后（第8周），饮用纯净水至16周，结束实验；参白解毒方低、高剂量组：在第1次给予含5% DSS的水饮用当日开始灌胃给予参白解毒方，剂量分别为14 g/kg（低剂量组）和42 g/kg（高剂量组），空白组：小鼠与AOM/DSS模型组同时间灌胃给予等体积生理盐水，饮用纯净水；均每日1次灌胃，共14周，第16周实验结束。实验结束时由两位高年资主治医师根据消化系统肿瘤WHO的诊断标准确定AOM/DSS模型组结直肠腺瘤、腺癌形成情况，确定有腺瘤或腺癌形成则为造模成功。
1.7. 观察及检测指标
1.7.1. 小鼠体质量及生存状态
每周测量小鼠体质量1~ 2次，观察小鼠精神状态及粪便性状，并给予评分（精神状态好0分、一般1分、差2分/毛色暗淡+1/掉毛+1，否+ 0/进食饮水量明显减少+2，略有减少+1，正常饮水+0；腹泻轻度0分、中度1分、重度2分/伴有出血明显+2，轻微+ 1，无出血+0）。
1.7.2. 小鼠取材、肿瘤计数和病理观察
小鼠禁食1夜后，摘取眼球取血后脱颈处死，沿腹中线打开腹腔，剪取脾组织和自回盲部至直肠末端的肠段，用4 ℃预冷的PBS清洗脾脏、肠道，测量肠道长度，称量大肠重量及脾重。用眼科剪刀通过沿长轴方向剖开肠腔，拍照记录结肠及肿瘤生长位置，仔细观察并触摸肠腔表面有无肿瘤形成。如有发现肿瘤形成，则大体观测进行肿瘤位置、数量、大小的记录，并计算肿瘤体积。对于形成肿瘤的结直肠，观察并记录肿瘤的位置、大小、数量，测量并记录每个肿瘤的最长径和垂直短径。[肿瘤发生率、肿瘤体积、荷瘤小鼠平均成瘤数量和平均成瘤数量按下述公式计算：肿瘤发生率（%）=荷瘤小鼠数量/实验小鼠数量× 100%；肿瘤体积=（最长径×垂直短径2）/2；荷瘤小鼠平均成瘤数量=肿瘤数量/荷瘤小鼠数量；平均成瘤数量=肿瘤数量/实验小鼠数量]。取带有肿瘤的结肠组织置于10%甲醛溶液固定，石蜡包埋后切片，进行HE染色，置于显微境下进行病理学检查，观察各组腺瘤癌变情况，得出病理检查报告。肠道肿瘤组织石蜡包切片进行HE染色，置于显微境下做病理学检查，确定各组腺瘤、腺癌形成情况。结直肠腺瘤及腺癌形态评判标准如下：腺瘤定义为存在异型增生的上皮，可将异型增生分为低级别与高级别，其中低级别腺瘤的细胞不典型性表现为削尖的细胞核位于细胞质基底部；高级别腺瘤可见细胞显著异常和明显结构复杂的腺体。结直肠腺癌的定义：肿瘤浸润黏膜肌层，进人黏膜下层。所有切片均由两位高年资主治医师依据2012版消化系统肿瘤WHO的诊断标准，双盲形式阅片。
1.7.3. 分离血清方法及提取microRNA、qRT-PCR
小鼠处死前先摘除眼球，留取血液，将离心管中的血放置室温2 h；待血液凝固血块收缩后，4000 r/min离心10 min；取上清于干净的离心管中，保存于-80 ℃或直接进行后续。样品处理：每200 μL血清中加入等体积裂解液MZ，振荡器振荡混匀30 s；使用血浆外泌体microRNA试剂盒从动物血浆中提取miRNA。miRNA-222的PCR分析是在Agilent Mx3000P系统上进行的，使用ChamQ通用SYBR qPCR Master Mix Kit（Vazyme），总体积20 μL，按照制造商的协议进行。使用U6特异性引物进行验证，miRNA-222引物序列：Hsa-miR222-3p RT：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTC GCACTGGATACGACACCCAG，Hsa-miR222-3p F：GCCGCAGCTACATCTGGCTAC，Hsa-miR222-3p R：ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG。所有实验在3个重复中进行，以不含模板的反应作为阴性对照。使用2-ΔΔCt方法计算相对miRNA-222和mRNA表达水平。
1.7.4. 免疫组化检测
常规石蜡包埋福尔马林固定24 h以上的标本，将蜡块连续切片（3~5 μm），37 ℃水浴中展片，防脱玻片捞取，65 ℃烤箱中烘烤1 h；依次将切片放在二甲苯、无水乙醇中，各3 min×2次进行脱蜡，随后依次放入95%、80%、70%乙醇中各3 min；PBS冲洗切片2 min×3次，3%双氧水中孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶活性，浸入枸橼酸缓冲液（pH 6.0）中，微波炉内加热95 ℃以上持续10 min，室温冷却20 min，滴加山羊血清封闭液，37 ℃孵育15 min；滴加相应一抗（1∶200）4 ℃孵育过夜；PBS冲洗2 min×3次，滴加适量二抗（1∶100），37 ℃孵育20 min，滴加适量辣根酶标记的链霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min；PBS冲洗后DAB显色5 min，自来水冲洗20 min；苏木精中复染细胞核3 min，自来水冲洗10 min；浸入1%盐酸乙醇中分化30 s，自来水冲洗3 min以返蓝；依次置入70%、80%、95%乙醇中各1 min，侵入无水乙醇2 min×2次，最后置于二甲苯2 min× 3次以脱水；滴加适量中性树胶，用盖玻片覆盖封片。
1.7.5. 统计学方法
采用Graphpad Prism 8.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，2组数据符合正态分布和方差齐性采用两样本t检验，3组以上的数据符合正态分布和方差齐性采用单因素方差分析，均数间两两比较均采用LSD法检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。所有实验均独立重复至少3次。
2. 结果
2.1. 参白解毒方对AOM/DSS小鼠体质量、生存状态的影响
自实验第4周起，AOM/DSS模型组和参白解毒方低、高剂量组有小鼠肤色逐渐变淡、甚至局部脱毛，以颈下脱毛为主，大便变稀，大便粘着肛门，偶有便血，后期部分出现脱肛，饮水和进食有所减少，以模型组和参白解毒方低剂量组为甚，高剂量组小鼠状态明显较其他各组改善，后期生存状态恢复如空白组，无明显特殊异常，统计各项总评分后如图 1A所示；而AOM/DSS模型组和参白解毒方低、高剂量组在造模期间体质量均有所下降，并在恢复纯净水饮水后体质量逐渐回升，但参白解毒方低、高剂量组和AOM/DSS模型组之间体质量无明显差异（图 1B）。对于死亡小鼠，记录时间，结果如图（图 1C），模型组小鼠造模后生存率逐渐下降，后期基本稳定，空白组后期有一个在饲养过程中死亡；用药各组生存率较模型组比较并无明显差异。
图 1.
各组小鼠生存状态评分、体质量和生存率
Survival status score (A), body weight (B) and survival rate (C) of the mice in each group.
2.2. 参白解毒方对造模小鼠脾重和肠道质量的影响
与空白组比较，AOM/DSS模型组小鼠的脾重显著增加（P < 0.05），小鼠肠道质量亦明显升高，差异具有统计学意义（P < 0.01，表 1和图 2）；与AOM/DSS模型组相比，参白解毒方低剂量组、高剂量组脾重均减轻，且呈剂量依赖趋势，其中高剂量组脾重明显下降，差异有统计学意义（P < 0.05）。参白解毒方低、高剂量组的肠道质量均有所下降，且差异均有统计学意义（均P < 0.05）。
表 1.
各组小鼠脾重和肠道重量情况
Spleen and intestinal weight of the mice in each group (Mean±SD, n=5)
| Group | Dose (g∙kg-1) | Spleen weight (g) | Intestinal weight (g) | P1 | P2 |
| 1)P < 0.05, 2)P < 0.01 vs control group; 3)P < 0.05 vs model group. | |||||
| Control | 0.095±0.017 | 0.365±0.043 | |||
| Model | 0.163±0.0451} | 0.551±0.1042) | 0.019 | 0.004 | |
| Low dose | 14 | 0.142±0.034 | 0.387±0.0793) | 0.478 | 0.024 |
| High dose | 42 | 0.075±0.0053) | 0.374±0.0383) | 0.044 | 0.022 |
图 2.
参白解毒方对AOM/DSS造模小鼠脾重和肠道重量的影响
Effects of SBJDF on spleen weight (A) and intestinal weight (B) of AOM/DSS model mice (Mean±SD, n=5). #P < 0.05 vs control group, ##P < 0.01 vs control group, *P < 0.05 vs model group.
2.3. 参白解毒方对小鼠肠道肿瘤形成及血浆miRNA-222的影响
取各组小鼠肠道组织，沿长轴方向剖开肠腔，记录结直肠及肿瘤生长位置，结果显示对照组无肿瘤形成，其它各组肿瘤位置以直肠部位为主，其中AOM/DSS模型组小鼠瘤体最多、最大，明显大于参白解毒方组而参白解毒方高剂量组无明显肿瘤形成。参白解毒方处理后小鼠肠道的肿瘤发生率、平均成瘤数量、荷瘤鼠平均成瘤数量、肿瘤体积（mm3）均低于AOM/DSS模型组，参白解毒方高剂量组减少尤其明显，肿瘤体积从模型组、参白解毒方低剂量组、高剂量组呈依次下降趋势（图 3）。
图 3.
各组小鼠肿瘤形成情况、发生率、成瘤数量及肿瘤体积
Tumor formation (A), incidence (B), number of tumors formed (C, D) and tumor volume (E) in each group (n=5). C, D: Average number of tumor and average number of tumorigenesis in tumor-bearing mice.
小鼠处死前摘取眼球，留取血液，离心取上清，提取血清中miRNA-222，进行qRT-PCR检测其在各组中表达情况。结果如图 4所示，模型组miRNA-222表达高于空白对照组，用药各组miRNA-222的表达量均较模型组下调，且差异均有统计学意义。如与空白组比较，模型组中miRNA-222上调，差异有统计学意义（P=0.04）；参白解毒方各组下调更明显，且差异均有显著统计学意义（低剂量组，P=0.003；高剂量组，P=0.002）。
图 4.
各组小鼠血浆中miRNA-222表达情况
Expression of miRNA-222 in plasma of each group (Mean±SD, n=3). #P < 0.05 vs control, **P < 0.01 vs model.
2.4. 参白解毒方对小鼠腺瘤、腺癌形成的影响
空白组为肠道正常腺体组织，AOM/DSS模型组瘤体组织较大，且均已形成腺癌；参白解毒方低剂量组瘤体组织同时存在腺瘤低级别瘤变和高级别瘤变，参白解毒方高剂量组以肠道正常粘膜组织为主，仅发现局部少量腺瘤低级别瘤变（图 5）。
图 5.
各组小鼠腺瘤、腺癌形成情况
Formation of adenoma and adenocarcinoma in each group (HE staining, original magnification: ×200). A: Control group. B: Model group. C: Low-dose SBJDF group. D: High-dose SBJDF group.
2.5. 参白解毒方对小鼠肠道组织中PTEN/PI3K/AKT通路相关分子表达的影响
各组小鼠瘤体或肠道组织石蜡切片进行PTEN/PI3K/AKT通路相关分子的免疫组化检测，结果如图 6和图 7（×200倍）所示，PTEN、p-PTEN在对照组强阳性表达，在AOM/DSS模型组中弱阳性表达，参白解毒方处理组随剂量升高阳性表达逐渐增强。PI3K、AKT、p-AKT在对照组阴性表达，在AOM/DSS模型组阳性表达，参白解毒方低剂量组、高剂量组阳性递减。GSK-3β在对照组阳性表达，AOM/DSS模型组为阴性表达或弱阳性表达，在参白解毒方低剂量组、高剂量组有依次递增趋势；p-GSK-3β则与其趋势相反，在空白组为弱阳性表达，AOM/DSS模型组明显阳性表达，在参白解毒方低剂量组、高剂量组表达依次递减。对照组c-myc、CyclinD1弱阳性表达，AOM/DSS模型组强阳性表达，参白解毒方低剂量组、高剂量组中表达有依次递减。β-Catenin、Survivin在对照组虽有阳性表达，但在AOM/DSS模型组强阳性表达，在参白解毒方低剂量组、高剂量组阳性表达逐渐递减。免疫组化评分见柱状图 8。
图 6.
参白解毒方对各组肠道组织PTEN、PI3K、AKT及其磷酸化蛋白表达的影响
Effects of SBJDF on expressions of PTEN, PI3K, AKT and their phosphorylated proteins in intestinal tissues in each group (Immunohistochemistry, ×200). A: Control group. B: Model group. C: Low-dose SBJDF group. D: High-dose SBJDF group.
图 7.
参白解毒方对各组肠道组织GSK-3β、p-GSK-3β、β-Catenin及其下游靶蛋白表达的影响
Effects of SBJDF on GSK-3β, p-GSK-3 β, β-catenin and the downstream target protein expressions in intestinal tissues in each group (Immunohistochemistry, ×200). A: Control group. B: Model group. C: Low-dose SBJDF group. D: High-dose SBJDF group.
图 8.
参白解毒方对各组肠道组织相关分子表达的影响
Comparison of the expression levels of the related proteins in the intestinal tissues among the 4 groups (Mean±SD, n=3).
3. 讨论
由于结直肠腺瘤癌变是结直肠癌发生的最主要途径，预防结直肠腺瘤癌变是减少结直肠癌发生率的有效切入点，目前虽主要依赖于肠镜筛查及手术切除，但在药物干预方面，国内外尚没有公认的预防结直肠腺瘤再发、复发及癌变的有效治疗方案，而传统中药的应用为此提供了探索和选择。参白解毒方是岐黄学者程海波教授临床治疗临床慢性结肠炎、结直肠息肉的经验方，主要由白花蛇舌草、苦参、党参、黄连、乌梅等药物组成，按照中医理论进行组合配伍并形成标准化制剂。本团队既往的研究显示参白解毒方可能通过维持细胞周期稳态发挥对溃疡性结肠炎肠黏膜上皮细胞的保护作用[14]；另体外研究发现参白解毒方可以抑制结直肠癌细胞HCT116的增殖，其作用机制可能是通过调节PTEN/PI3K/AKT信号通路[15]或抑制NF-κB信号通路的激活，引起细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡[16]。
建立直结肠癌诱发模型最常用的试剂是二甲基肼（DMH）和其代谢产物偶氮甲烷（AOM）。近年来研究显示长期反复的炎症性肠病可以诱发结直肠癌，故目前较多采用AOM联合DSS制备炎症相关性结直肠癌模型。但这些模型中的严重炎症与人类散发性肠癌并无密切关系[17]，因此，为了避免DSS治疗周期导致结肠炎的过度炎症反应，我们根据近年文献，通过调整DSS的剂量和持续时间，使其仅轻微刺激结肠，结果显示其仍能促进结直肠腺癌发生。临床研究发现核内β-catenin的高表达参与促进腺瘤癌变过程[18]；另有研究发现夏枯草芽乙醇提取物（TAEE）可以减少AOM/DSS模型中核内β-catenin的表达及其下游Cyclin D1和c-Myc的表达[19]，从而抑制肠癌的形成。故β-catenin是腺瘤癌变过程中的重要分子之一。本研究通过调整后的AOM联合DSS方案造模，结果显示造模后小鼠生成状态变差，有脱毛，腹泻、便血、甚至脱肛情况出现；实验结束时模型组可以形成较明显的肿瘤，病理确认已形成腺癌，而空白组为肠道正常腺体组织。提示本研究AOM/DSS造模可以诱导结直肠腺癌的形成。本研究结果表明，参白解毒方可以改善AOM/DSS模型小鼠的生存状态，降低肠道形成肿瘤的数目和瘤体的大小。参白解毒方给药组小鼠的肿瘤发生率、平均成瘤数量、荷瘤鼠平均成瘤数量、肿瘤体积（mm3）均低于AOM/DSS模型组，且参白解毒方高剂量组已无明显肿瘤形成。对各组小鼠肠道肿瘤进行病理检测，AOM/DSS模型组瘤体大，且均已形成腺癌，参白解毒方低剂量组瘤体组织同时存在腺瘤低级别瘤变和高级别瘤变；参白解毒方之高剂量组以肠道正常粘膜组织为主，仅发现局部少量腺瘤低级别瘤变。以上结果说明参白解毒方可以有效的抑制结直肠腺瘤的形成及癌变。
MicroRNAs（miRNAs或者miR）是一类内生的、长度约18~25个核苷酸的非编码小RNA分子，可以通过靶向mRNA在转录后水平进行翻译抑制或降解来调控基因表达[20]。有研究发现miR-221/222可以降低ERα和PTEN的表达，从而诱导细胞周期阻滞和3D细胞培养条件下细胞生长的抑制[21]。本团队前期研究中对可以调控PTEN的miRNA-519α、miRNA-454和miRNA-222进行了观察，因miRNA-519α在结直肠腺瘤、腺癌中表达量过低而予以排除；miRNA-454和miRNA-222在腺瘤、腺癌中的表达虽均有递增趋势，但miRNA-454的CT值为30左右，而miRNA-222 CT值为20左右，相对而言miRNA-454的整体表达略低，故本实验筛选表达较高的miRNA-222进行后续实验。PI3K的活化可以产生第二信使3，4，5-三磷酸磷脂肌醇（PIP3），进一步促进蛋白激酶B（PKB, 也称为AKT）的活化[22]，从而激活其下游一系列底物。PI3K/AKT为PTEN的下游信号通路，该通路的激活可以抑制其下游的糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）的活性[23]，促进β-catenin的入核[24]，进而促进结直肠腺瘤癌变及其恶性进展[25]。因此，PTEN/PI3K/AKT信号通路在肿瘤的发生及进展过程中发挥着重要的作用，可以调控多种肿瘤细胞，包括结直肠癌细胞的增殖、凋亡和侵袭[26, 27]，而miR-221/222可能参与了PTEN介导的调控过程。我们在本研究发现模型组血清miRNA-222上调，参白解毒方可以下调miRNA-222的表达，且有剂量依赖趋势。通过免疫组化进一步观察下游PTEN/PI3K/AKT通路相关分子的表达情况。结果与预期一致，PTEN、p-PTEN、GSK-3β在空白组中呈阳性表达或强阳性表达，模型组为阴性表达或弱阳性表达，在参白解毒方低剂量组、高剂量组表达有依次递增趋势；p-GSK-3β与其他促癌因子结果趋势一致，与PI3K、AKT、p-AKT、β-catenin、c-myc、cyclinD1、survivin在空白组均呈阴性表达或弱阳性表达，在模型组强阳性表达，而参白解毒方低剂量组、高剂量组其表达有递减趋势。
综上所述，参白解毒方可以防治结直肠腺瘤癌变，其机制可能是部分下调miRNA-222的表达从而逆转增加PTEN表达量，抑制PI3K/AKT通路激活，增高GSK-3β表达或促进其活化，减少核内β-catenin的表达，下调凋亡抑制蛋白survivin和促进细胞增殖的周期蛋白cyclind1、c-myc表达，从而抑制结直肠腺瘤癌变过程，但miRNA-222与PTEN/PI3K/AKT信号通路之间的调控作用有待进一步深入探索。本研究为从中医药方法寻找治疗结直肠腺癌提供了一定的实验依据。
Biography
刘见荣，主治中医师，博士，E-mail: liujianrong-zz@163.com
Funding Statement
国家自然科学基金（81930117）；江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）
Supported by National Natural Science Foundation of China (81930117)
Contributor Information
刘 见荣 (Jianrong LIU), Email: liujianrong-zz@163.com.
沈 卫星 (Weixing SHEN), Email: weixingshen@njucm.edu.cn.
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