文冠果花提取物对良性前列腺增生具有抑制作用

Abstract

Objective

To assess the inhibitory effect of the extract of Xanthoceras sorbifolium Bunge flower against benign prostatic hyperplasia (BPH) and explore its possible mechanism.

Methods

MTT assay was used to examine the effect of the extract of Xanthoceras sorbifolium Bunge flower on proliferation of benign prostatic hyperplasia cells (BPH-1), and cell apoptosis and cell cycle changes following the treatment were analyzed using annexin V/PI double staining and flow cytometry. The protein expression levels of Bcl-2, Bax, caspase-3, PI3K and AKT in the treated cells were detected using Western blotting. A rat model of BPH established by subcutaneous injection of testosterone propionate was treated with the flower extract for 28 days, and pathological changes in the prostate tissue were observed with HE staining. The protein expression levels of Bcl-2, Bax, caspase3 and PI3K/AKT in the prostate tissue were detected with Western blotting.

Results

Within the concentration range of 125-1000 µg/mL, the flower extract of Xanthoceras sorbifolium Bunge significantly inhibited the proliferation of BPH-1 cells and caused obvious cell cycle arrest at G0/G1 phase; the apoptotic rate of the cells was positively correlated with the concentration of the flower extract (P < 0.05). Bcl-2, p-PI3K and p-AKT expression levels were significantly down-regulated and Bax and caspase-3 expression levels were significantly increased in the cells after treatment with the flowers extract (P < 0.05). In the rat models of BPH, the rats treated with the flowers extract at moderate and high doses showed obviously decreased expressions of p-AKT and Bcl-2 and an increased expression of Bax in the prostate tissue; a significantly lowered p-AKT expression was observed in the prostate tissue of rats receiving the low-dose treatment (P < 0.05).

Conclusion

The flower extract of Xanthoceras sorbifolium Bunge has a inhibitory effect on BPH both in vitro and in rats, suggesting its potential value in the development of medicinal plant preparations for treatment of BPH.

良性前列腺增生（BPH）是中老年男性常见的泌尿系统疾病，前列腺异常增大导致尿路收缩，进而使排尿频率增加、尿急和排尿迟缓，影响患者的日常生活，降低患者的生活质量^[1]。据报道高达80%的人在50岁时有一定程度的前列腺肿大^[2]。其发病机制复杂，已有研究表明，急性和慢性炎症通过各种途径刺激细胞生长，特别是氧化应激，从而促进BPH的发展^[3-6]。此外，在Minutoli等^[7]的一项研究中，白藜芦醇、硒和番茄红素联合使用可通过诱导Caspase3的表达促进细胞凋亡，从而有效地减轻睾酮诱导的BPH大鼠的前列腺重量和生长。治疗良性前列腺增生的传统药物主要包括5-α还原酶抑制剂和α1-肾上腺素受体拮抗剂，但这两种制剂均具有严重的副作用如阳痿、直立型低血压、头晕等，不适宜长期使用^{[8, 9]}。近些年来，植物提取物在前列腺增生治疗方面的应用逐渐广泛^[10]。越来越多的BPH患者寻求使用天然、低毒的植物药预防和治疗良性前列腺增生。

文冠果花来源于无患子科文冠果属植物文冠果（Xanthoceras sorbifolium Bunge）^{[11, 12]}。花序大且花朵密，课题组前期使用70%乙醇对文冠果花进行回流提取得到文冠果花提取物，采用高效液相色谱法测定其中成分，发现文冠果花提取物中含有多种黄酮类化合物，其中主要成分为异槲皮苷和芦丁。异槲皮苷和芦丁广泛分布于饮食和药用植物中，具有抗氧化、抗炎和抗增殖等多种生物学特性，并且主要通过多种信号通路诱导细胞凋亡和细胞周期停滞，表现出对恶性细胞的抑制作用^[13-16]。因此，我们推测文冠果花提取物可能通过抗氧化、抗炎、诱导细胞凋亡等途径发挥抑制良性前列腺增生的作用。已有研究表明, 文冠果花总黄酮提取物对DPPH和ABTS的清除能力远大于芦丁, 且对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有很强的抑制活性^[17]。阿拉木斯^[18]采用经典药理学方法建立BPH动物模型并对文冠果花水提物和醇提物的药效进行了初步研究，研究发现文冠果花水提取物可以缓解大鼠前列腺的增生程度但作用机制尚不明确。基于此，本研究选择良性前列腺增生细胞BPH-1进行体外活性研究，结合动物实验探究文冠果花提取物对前列腺增生的影响及可能的机制，为开发治疗良性前列腺增生的植物制剂提供潜在选择。

1. 材料和方法

1.1. 材料

1.1.1. 主要试剂与仪器

文冠果花提取物（军事医学研究院抗辐射药物研究室自提）；Bcl-2、Bax、Caspase3、PI3K、p-PI3K、AKT、p- AKT抗体（Abcam）；ECL发光液、BCA蛋白定量试剂（北京普利莱基因技术有限公司）。ES-2001P型电子天平（长沙湘平科技发展有限公司）；DZTW型调温电热套（上海力辰邦西仪器科技有限公司）；LGJ-10D型冻干机（北京四环科学仪器厂有限公司）；BIO-TEK酶标仪（美谷分子仪器）；二氧化碳培养箱[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]。

1.1.2. 实验细胞与动物

人前列腺增生细胞（BPH-1）细胞株保存于军事医学研究院抗辐射药物研究室；SPF级雄性SD大鼠36只，体质量180±10 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK（京）2016-0011]，饲养于军事科学院军事医学研究院动物实验中心，温度控制在23±2 ℃，明暗循环12 h。动物饲养采用标准饮食和水，并在实验开始前1周进行适应性喂养。所有实验均按照军事科学院军事医学研究院动物实验伦理委员会的要求进行（实验动物管理与使用审查编号：IACUC-DWZX-2020-503）。

1.2. 方法

1.2.1. 细胞培养

BPH-1细胞置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，在37 ℃、5% CO₂的恒温培养箱中进行培养，以备后续实验。

1.2.2. MTT法检测细胞生存率

将BPH-1细胞均匀分散于完全培养基，按照1×10⁴/孔接种于96孔板中，培养24 h，使细胞贴壁。弃去完全培养基，分别加入不同浓度的含药培养基。各组浓度分别为：125、250、500、1000 µg/mL，并设置不含药的空白对照组。药物分别作用细胞12、24、48 h后，弃去上清液，每孔加入50 µL 1 mg/mL的MTT溶液，孵育4 h后弃上清，每孔加入100 µL异丙醇，震荡15 min至沉淀完全溶解。酶标仪于570 nm、650 nm（校准波长）处测定吸光度A。

1.2.3. Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡

细胞以2×10⁵/孔接种于6孔板中培养24 h，贴壁后更换含药培养基给药孵育24 h，各组浓度分别为：125、250、500、1000 µg/mL，并设置不含药的空白对照组。使用胰酶消化并收集不同浓度药物处理后的细胞，300 g离心5 min弃去上清，用0.5 mL 1×Annexin V（膜联蛋白V）结合缓冲液洗涤后再次以300 g离心5 min，弃去上清。用100 μL1×Annexin V结合缓冲液重悬细胞，加入Annexin V-FITC 5 μL/管进行荧光素标记，避光孵育5 min。每管加入10 μL PI（碘化丙啶）和400 μL 1×Annexin V结合缓冲液继续避光孵育10 min，用流式细胞仪检测。

1.2.4. 流式细胞仪检测细胞周期

细胞以2×10⁵/孔接种于6孔板中培养24 h，贴壁后更换含药培养基给药孵育24 h，各组浓度分别为：125、250、500、1000 µg/mL，并设置不含药的空白对照组。胰酶消化并收集细胞后300 g离心5 min弃去上清，用70%酒精重悬分散细胞，孵育2 h。孵育结束后500 g离心5 min弃上清，用2 mL 1×PBS重悬细胞，500 g离心5 min弃上清。每管加入400 µL PI染色液和100 µL RNaseI（核糖核酸酶A），37 ℃避光孵育30 min。加入2 mL PBS洗涤细胞，500 g离心5 min弃上清。加入0.5 mL PBS重悬细胞，用流式细胞仪检测。

1.2.5. Western blot法检测BPH-1细胞蛋白表达水平

细胞以2×10⁵/孔接种于6孔板中培养24 h，贴壁后更换含药培养基，各组浓度分别为：空白对照组、500 µg/mL、1000 µg/mL。给药孵育24 h后收集细胞，PBS洗涤3次后加入细胞裂解液在冰上裂解，12 000×g离心15 min收集上清液，使用BCA法测定蛋白浓度后，上清液加上样缓冲液，100 ℃水浴15 min，-20 ℃保存。蛋白质样品使用10%SDS-PAGE电泳分离，转移到0.22 μm PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h。加入一抗Bcl-2（1∶1000）、Bax（1∶1000）、Caspase3（1∶1000）、PI3K（1∶1000）、p-PI3K（1∶500）、AKT（1∶1000）、p-AKT（1∶500）、β-Actin（1∶5000），4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次，加入羊抗兔抗体（1∶5000）和羊抗鼠IgG抗体（1∶5000），室温孵育1 h。TBST洗膜3次，ECL发光显影，Image J软件分析蛋白条带积分吸光度值。

1.2.6. 动物模型的建立与分组

雄性正常SD大鼠36只，随机分为6组，异氟烷麻醉后，其中1组行手术处理作为空白对照，其余5组行去势手术。术后恢复7 d，去势大鼠连续28 d每日皮下注射丙酸睾酮5 mg/kg，假手术组皮下注射相同体积橄榄油溶液。注射后1 h，阳性药物组给予非那雄胺5 mg/kg，文冠果花提取物低、中、高剂量组给药剂量分别为50、200、600 mg/kg，假手术组给予等体积生理盐水，每周称体质量后调整给药剂量，连续灌胃给药28 d。

1.2.7. 组织病理学检查

给药28 d后处死大鼠，取大鼠前列腺组织使用4%多聚甲醛固定48 h，脱水浸蜡，石蜡包埋后使用石蜡切片机切成4 µm组织切片，脱蜡后分别使用苏木精和伊红染色2 min，脱水封片并使用显微镜采集图像并分析。

1.2.8. Western blot法检测大鼠前列腺组织蛋白表达水平

称取各组大鼠前列腺组织加入组织裂解液在冰上裂解，12 000×g离心15 min收集上清液，使用BCA法测定蛋白浓度后，上清液加上样缓冲液，100 ℃水浴15 min，-20 ℃保存。蛋白质样品使用10%SDS-PAGE电泳分离，转移到0.22 μm PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h。加入一抗Bcl-2（1∶1000）、Bax（1∶1000）、Caspase3（1∶1000）、PI3K（1∶1000）、p-PI3K（1∶500）、AKT（1∶1000）、p-AKT（1∶500）、β-Actin（1∶5000），4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次，加入羊抗兔抗体（1∶5000）和羊抗鼠IgG抗体（1∶5000），室温孵育1 h。TBST洗膜3次，ECL发光显影，Image J软件分析蛋白条带积分吸光度值。

1.3. 统计学分析

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.0统计软件对数据进行统计分析。结果采用均数±标准差表示。组间差异分析采用t检验，当P < 0.05表示差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 文冠果花提取物对BPH-1细胞生存率的影响

药物浓度在125 µg/mL时，药物处理12 h未见抑制作用，随着药物干预时间的延长，逐渐表现出抑制作用，细胞存活率降低至82.8%，且随着给药浓度从125 µg/mL增加至1000 µg/mL，细胞存活率出现明显的下降趋势，同一时间不同浓度给药组组间存活率下降出现统计学差异（P < 0.05），细胞存活率与给药浓度和给药时间呈负相关（图 1）。

图 1.

文冠果花提取物对BPH-1细胞存活率的影响

Effect of the flower extract of Xanthoceras sorbifolium Bunge on cell proliferation of BPH-1 cells (n=6, ^*P < 0.05).

2.2. 文冠果花提取物对BPH-1细胞凋亡率的影响

与空白对照组相比，给药浓度125 µg/mL时，凋亡率无统计学差异，随着给药浓度的进一步增加，细胞的早期和晚期凋亡程度相应增加，凋亡率明显升高（图 2）。

图 2.

文冠果花提取物对BPH-1细胞凋亡的影响

Effect of the flower extract of Xanthoceras sorbifolium Bunge on apoptosis of BPH-1 cells. ^**P < 0.01 vs control group (n=3).

2.3. 文冠果花提取物对BPH-1细胞周期的影响

与空白对照组相比，经药物处理过的BPH-1细胞G0/G1期比率上升，且G0/G1期比率与给药浓度呈正相关。S期比率下降，与给药浓度呈负相关。而G2/M期变化不具有统计学意义（图 3）。

图 3.

文冠果花提取物对BPH-1细胞周期的影响

Effect of the flower extract of Xanthoceras sorbifolium Bunge on cell cycle of BPH-1 cells. ^*P < 0.05 vs control group (n=3).

2.4. 文冠果花提取物对BPH-1细胞中Bcl-2/Bax/Caspase3的蛋白表达水平的影响

与空白对照组相比，BPH-1细胞在文冠果花提取物作用24 h后，Bax和Caspase3蛋白表达水平显著提高（P < 0.05），Bcl-2蛋白表达水平明显下调（P < 0.05），随着给药浓度从500 µg/mL提升至1000 µg/mL，Bax和Caspase3蛋白表达水平提升以及Bcl-2蛋白表达水平的下调的趋势进一步加大（图 4）。

图 4.

文冠果花提取物对BPH-1细胞Bcl-2/Bax/Caspase3蛋白表达水平的影响

Effect of the flower extract of Xanthoceras sorbifolium Bunge on protein express levels of Bcl-2/Bax/Caspase3 in BPH-1 cells by Western blotting. A: Bcl-2, Bax and Caspase3 expressions by Western blotting. B: The relative expression of Bcl-2, Bax and Caspase3. ^*P < 0.05, ^**P < 0.01 vs control group (n=3).

2.5. 文冠果花提取物对BPH-1细胞中PI3K/AKT蛋白表达水平的影响

与空白对照组相比，BPH-1细胞在文冠果花提取物作用24 h后，p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值显著降低（P < 0.05），随着给药浓度从500 µg/mL提升至1000 µg/mL，p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值降低的趋势进一步加大（图 5）。

图 5.

文冠果花提取物对BPH-1细胞PI3K/AKT蛋白表达水平的影响

Effect of the flower extract of Xanthoceras sorbifolium Bunge on protein express levels of PI3K/AKT in BPH- 1 cells by Western blotting. A: PI3K, p-PI3K, AKT and p-AKT expressions by Western blotting. B: The relative expression of PI3K. C: The relative expression of AKT. ^*P < 0.05, ^**P < 0.01 vs control group (n=3).

2.6. 文冠果花提取物对大鼠前列腺病理组织切片

假手术组大鼠前列腺组织内腺体结构较紧密，未见炎症细胞浸润；腺体上皮细胞层厚度正常，排列整齐，未见脱落。模型组大鼠前列腺组织内部分大量腺体上皮细胞增生，上皮细胞呈乳头状突起。阳性组大鼠前列腺组织中部分腺体腺腔内可见炎性细胞弥散性浸润。文冠果花提取物低剂量组大鼠前列腺组织内部分腺体上皮细胞增生，上皮细胞层增厚，部分腺体腔内可见炎性细胞弥散性浸润。文冠果花提取物中剂量组大鼠前列腺组织内部分腺体上皮细胞增生，上皮细胞层增厚，部分上皮细胞水肿，细胞肿胀、胞浆淡染。文冠果花提取物高剂量组大鼠前列腺组织内局部腺体间隙增大，未见明显炎症细胞浸润，部分腺体上皮细胞脱落（图 6）。

图 6.

大鼠前列腺组织的病理变化

Histopathological changes of rat prostate tissue (HE staining, scale bar=100 µm). C: sham operation group. M: model group. F: positive group. FL: low dose group of the flower extract. FM: medium dose group. FH: high dose group. Red arrows: Epithelial cell hyperplasia. Black arrows: Diffuse infiltrates of inflammatory cells. Blue arrows: Epithelial cells fall off.

2.7. 文冠果花提取物对大鼠前列腺组织中Bcl-2/Bax/Caspase3蛋白表达水平的影响

与假手术组相比，模型组Bax和Caspase3蛋白表达量显著降低（P < 0.01），Bcl-2蛋白量显著提高（P < 0.01）。与模型组相比，阳性药物组和文冠果花提取物低中高剂量组Bax和Caspase3蛋白表达水平显著提高（P < 0.05），Bcl-2蛋白表达水平明显下调（P < 0.05），随着文冠果花提取物给药剂量增大，Bax和Caspase3蛋白表达水平提升以及Bcl-2蛋白表达水平的下调的趋势进一步加大（图 7）。

图 7.

文冠果花提取物对大鼠前列腺组织中Bcl-2/Bax/Caspase3蛋白表达水平的影响

Effects of drugs on the expression level of Bcl-2/Bax/Caspase3 protein in prostate tissue of rats in each group. A: Bcl-2, Bax and Caspase3 expressions by Western blotting. B: The relative expression of Bcl-2. C: The relative expression of Bax. D: The relative expression of Caspase3. ^*P < 0.05, ^**P < 0.01 vs model group (n=3).

2.8. 文冠果花提取物对大鼠前列腺组织中PI3K/AKT蛋白表达水平的影响

与假手术组相比，模型组p-PI3K、p-AKT蛋白表达量显著增大（P < 0.01）。与模型组相比，阳性药物组p-PI3K和p-AKT表达水平均显著降低（P < 0.01），文冠果花提取物高剂量组中p-PI3K和p-AKT表达水平降低（P < 0.05，P < 0.01），文冠果花提取物低剂量组和中剂量组p-AKT表达水平降低（P < 0.05，图 8）。

图 8.

文冠果花提取物对大鼠前列腺组织中PI3K/AKT蛋白表达水平的影响

Effects of drugs on the expression level of PI3K/AKT protein in prostate tissue of rats in each group. A: PI3K, p-PI3K, AKT and p-AKT expressions by Western blotting. B: The relative expression of PI3K. C: The relative expression of AKT. ^*P < 0.05, ^**P < 0.01 vs model group (n=3).

3. 讨论

前期许多研究结果表明，当良性前列腺增生发生时，前列腺组织往往会伴随着细胞的异常增殖^{[19, 20]}。抑制前列腺细胞的异常增殖，促进其凋亡是治疗良性前列腺增生的一种方式。本研究结果表明，文冠果花提取物能有效降低BPH-1细胞的存活率，提示文冠果花提取物对良性前列腺增生细胞具有抑制作用，这种抑制作用可能与文冠果花提取物调控细胞周期和促进细胞凋亡有关。

凋亡是由多基因介导的细胞程序性死亡，也是细胞增殖抑制的重要原因^[21]。细胞凋亡的程序异常是导致良性前列腺增生的另一因素。本研究结果表明，BPH-1细胞经文冠果花提取物处理24 h后，凋亡水平显著增加，随给药浓度增加，可显著提高早期凋亡水平，提示诱导凋亡可能是文冠果花提取物发挥抗良性前列腺增生疾病的作用方式。

前列腺基质细胞和上皮细胞的生长和分裂均受细胞周期的调节^[22]。细胞周期可分为四个阶段：DNA合成前期（G1）、DNA合成期（S）、DNA合成后期（G2）和细胞分裂期（M），G1期涉及控制细胞周期进程的主要信号通路^[23]。本研究结果显示，文冠果花提取物处理过的BPH-1细胞G0/G1期细胞百分比显著上升，S期细胞百分比明显下降，这些结果表明，文冠果花提取物通过G0/G1期的细胞周期阻滞来抑制细胞增殖。

良性前列腺增生细胞中观察到的抗凋亡因子Bcl-2的减少和凋亡因子Bax的增加可能是由于前列腺组织增生的抑制^{[19, 24]}。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）通路影响各种细胞生物学过程，如增殖、生长、细胞凋亡和细胞骨架重排^{[25, 26]}，而AKT是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，作为主要的细胞内信号通路发挥重要作用^[27]。细胞凋亡的机制可由细胞应激引起，主要分为外在和内在的凋亡途径^{[27, 28]}。Caspase-9激活是内在凋亡途径过程中必不可少的起始蛋白。在内在途径中，caspase-9的活性形式通过刺激效应caspase执行者（如caspase- 3和caspase-7）介导细胞凋亡事件^{[29, 30]}。从实验中可以观察到，文冠果花提取物上调BPH-1细胞中Bax和Caspase3的表达水平，下调Bcl-2的表达水平，同时下调PI3K/AKT蛋白的磷酸化水平，提示文冠果花提取物通过调控PI3K/AKT和Bcl-2/Bax/Caspase3信号通路来抑制BPH-1细胞的异常增殖进而抑制良性前列腺增生。

我们进一步通过动物实验验证文冠果花提取物对良性前列腺增生的抑制作用。前列腺增生机制可能与前列腺中的DHT积累有关，DHT与核激素受体结合并刺激细胞生长。大多数增生由腺体增生引起，但间质也会增厚^{[31, 32]}。组织病理学结果表明，与假手术组相比，BPH大鼠的前列腺组织病理学显示上皮增生，上皮厚度增加。与睾酮诱导的BPH大鼠相比，经文冠果花提取物处理的大鼠前列腺上皮增生状态减轻，上皮厚度降低。然后我们进一步对前列腺组织蛋白表达水平进行分析，结果表明，文冠果花提取物组大鼠前列腺组织中PI3K/AKT信号通路磷酸化水平下调，Bcl-2表达水平下调，Bax和Caspase3蛋白表达水平上升，这一变化趋势与细胞蛋白表达趋势相符，进一步验证文冠果花提取物在减轻前列腺增生方面非常有效且通过该通路介导对良性前列腺的抑制。

综上所述，文冠果花提取物在细胞水平上抑制了BPH-1细胞的增生，动物水平上显著改善了睾酮诱导的大鼠良性前列腺增生的组织病理状态，这种抑制作用受PI3K/AKT和Bcl-2/Bax/Caspase3信号通路介导，这种作用结果可能与文冠果花提取物中含有的抗增殖和抗肿瘤的黄酮类成分有关，后期我们将对文冠果花提取物的活性成分进行验证。

Biography

王文晴，硕士，E-mail: 18137717683@163.com

Funding Statement

北京市自然科学基金（7202148）；河南省高等学校重点科研项目（20A360007）；河南省中医药科学研究专项课题项目（20-21ZY2153）