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. 2022 Aug 24;119(5):714–721. [Article in Portuguese] doi: 10.36660/abc.20210796
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Associação Positiva entre Autoanticorpos contra LDL Oxidada e HDL-C: Um Novo Mecanismo para Cardioproteção de HDL?

Carla Evelyn Coimbra Nunez 1, Joaquim Barreto Oliveira 2, Silvia de Barros-Mazon 1, Vanessa H S Zago 3, Denise Beheregaray Kaplan 1, Ruy T Nakamura 4, Magnus Ake Gidlund 5, Erica I L Gomes 6, Patricia Miralda Cazita 5, Edna Nakandakare 5, Helison R Carmo 6, Andrei C Sposito 2, Eliana Cotta de Faria 1
PMCID: PMC9750204  PMID: 36074481

Resumo

Fundamento

No microambiente da placa aterosclerótica, os fosfolipídios oxidados expressos na superfície de lipoproteína de baixa densidade oxidada (oxLDL) se ligam a receptores scavenger em macrófagos provocando a formação de células espumosas e a progressão da placa. Autoanticorpos contra oxLDL (oxLDL-Ab) interagem com epítopos oxidativos levando à formação de imunocomplexos que são incapazes de interagir com receptores de macrófagos, assim suprimindo a aterogênese. A liberação de oxLDL-Ab pelas células B envolve a resposta da interleucina 5 e Th2, que por sua vez são potencializadas pela HDL. Assim, levantamos a hipótese de que indivíduos com níveis mais altos de HDL-C podem apresentar níveis elevados de oxLDL-Ab.

Objetivo

Avaliar a relação entre os níveis de HDL-C e oxLDL-Ab.

Métodos

Indivíduos assintomáticos (n = 193) foram agrupados de acordo com sua concentração de HDL-C para uma das três categorias seguintes: baixa (< 68 mg/dL), intermediária (de 68 a 80 mg/dL) ou alta (> 80 mg/dL). Os valores p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

Nossa análise incluiu 193 indivíduos (média etária: 47 anos; masculino: 26,3%). Em comparação com os indivíduos no menor tercil de HDL-C, os mais elevados foram mais velhos (36 versus 53 anos; p = 0,001) e, menos frequentemente, masculinos (42,6% versus 20,9%; p = 0,001). Os valores médios de oxLDL-Ab aumentaram à medida que o grupo HDL-C aumentou (0,31, 0,33 e 0,43 unidades, respectivamente; p = 0,001 para tendência). A regressão linear simples encontrou uma relação significativa e positiva entre a variável independente, HDL-C, e a variável dependente, oxLDL-Ab (R = 0,293; p = 0,009). Essa relação manteve-se significativa (R = 0,30; p = 0,044), após ajuste por covariáveis. Os níveis de apolipoproteína AI também estiveram relacionados a oxLDL-Ab nos modelos de regressão linear simples e ajustada.

Conclusões

HDL-C e oxLDL-Ab estão independentemente relacionados.

Keywords: HDL-Colesterol, Lipoproteínas IDL, Aterosclerose

Introdução

A acumulação de lipoproteínas contendo apolipoproteína B (ApoB), principalmente lipoproteína de baixa densidade (LDL), na íntima arterial tem sido pesquisada como o passo inicial da aterogênese.1 Nesse microambiente arterial, a modificação oxidativa gera vários novos epítopos na LDL, que são reconhecidas pelas células imunes e levam à ativação da resposta inflamatória Th1 e Th2, provocando a liberação de autoanticorpos contra LDL oxidada (oxLDL-Ab).2 , 3

O papel protetor de oxLDL-Ab na aterogênese é apoiado por um crescente corpo de evidências. De fato, o tratamento com oxLDL-Ab diminuiu a progressão da placa aterosclerótica e mitigou significativamente a captação da lipoproteína de baixa densidade oxidada (oxLDL) por macrófagos em camundongos com deficiência de apolipoproteína E (ApoE).4 Além disso, estudos observacionais descobriram que os níveis de oxLDL-Ab estão inversamente relacionados à espessura da camada íntima da carótida e aos níveis de oxLDL em indivíduos saudáveis.8 Da mesma maneira, uma grande revisão sistemática concluiu que os níveis de oxLDL-Ab estão inversamente relacionados à gravidade da doença arterial coronariana e à incidência de eventos cardiovasculares.9

As propriedades benéficas de oxLDL-Ab desencadearam uma intensa busca por moduladores de sua liberação. Neste assunto, Chou et al.10 verificaram que a estimulação de células B com interleucina 5 (IL5) induziu a geração de oxLDL-Ab. É importante ressaltar que a IL5 está relacionada à resposta Th2, que por sua vez é comprovadamente inibida por oxLDL, mas incrementada pela lipoproteína de alta densidade (HDL).11 , 12 Considerando isso, projetamos o presente estudo com a hipótese de que a HDL plasmática pode estar independentemente associada aos níveis plasmáticos de oxLDL-Ab. Portanto, nosso estudo avaliou se os níveis de oxLDL-Ab e colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL-C) estão relacionados em indivíduos com uma ampla variedade de concentrações plasmáticas de HDL-C.

Métodos

Desenho da pesquisa

O presente estudo foi realizado como análise transversal de dados de indivíduos saudáveis consecutivamente incluídos em um grande grupo de pacientes assintomáticos atendidos no Hospital Universitário da Universidade de Campinas, na cidade de Campinas, São Paulo, Brasil. Os pacientes elegíveis tinham 18 anos ou mais, sendo de ambos os sexos. Após a assinatura do termo de consentimento informado, os participantes responderam a um questionário detalhado de elegibilidade.

Os critérios de exclusão foram qualquer doença arterial coronariana prévia ou acidente vascular cerebral; causas secundárias de HDL-C plasmático baixo ou alto; uso regular de tratamentos médicos (especialmente aqueles que interferem no metabolismo lipídico, como estatinas, terapia de reposição hormonal e anticoncepcionais); doenças hepáticas, renais, pulmonares e endócrinas (como diabetes); uso crônico de álcool e tabaco; e mulheres que estavam grávidas ou lactantes devido à possível influência hormonal. Os participantes elegíveis foram submetidos a um exame físico detalhado, medidas de pressão arterial e ultrassonografia carotídea, e suas amostras de sangue periférico foram coletadas para análise bioquímica.

Os participantes foram agrupados de acordo com seus tercis de níveis de HDL-C da seguinte maneira: 1) baixas concentrações de HDL-C (HDL-C abaixo de 68 mg/dL: n = 59); 2) concentrações intermediárias (HDL-C 68 a 80 mg/dL: n = 71) e altas concentrações de HDL-C (HDL-C > 80 mg/dL: n = 63).

O Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Estadual de Campinas aprovou todos os procedimentos sob parecer número 790/2006. Todos os participantes assinaram uma declaração de consentimento para participar do estudo.

Coleta de amostras e métodos analíticos

Foram coletadas amostras de sangue venoso após jejum de 12 horas nos indivíduos selecionados para participar do estudo. As amostras foram centrifugadas (4 °C, 1000 g, 10 minutos) para separação de soro e plasma EDTA e armazenadas a −80 °C até a análise. Foi coletada outra amostra de sangue em jejum de 12 horas durante uma segunda visita 15 minutos após a administração intravenosa de heparina (Liquemine® Roche, 100 U/kg de peso corporal).

Colesterol total, triglicerídeos e fosfolipídios no soro e os dois primeiros analitos em lipoproteínas foram analisados por métodos enzimático-colorimétricos (BM Hitachi 917 Roche, Mannheim, Alemanha). Foram medidas a apolipoproteína B100 e a apolipoproteína AI (ApoAI) em um sistema automatizado BN II (Siemens Healthcare Diagnostics, Marburg, Alemanha), utilizando ensaios comercialmente disponíveis (Dade-Boehringer®, Deerfield, Illinois, EUA). Foi analisado o HDL-C por um método direto homogêneo. O colesterol da lipoproteína de baixa densidade (LDL-C) foi calculado pela fórmula de Friedewald.13

Para obter as subfrações de HDL, as lipoproteínas que continham ApoB foram precipitadas por sulfato de dextrano, e o sobrenadante foi submetido a micro-ultracentrifugação sequencial utilizando o Airfuge/75B (Beckman Instruments, Palo Alto, California, EUA).

As atividades plasmáticas da proteína de transferência de éster de colesterol (CETP) e da proteína de transferência de fosfolipídios (PLTP) foram determinadas por meio de ensaios radiométricos usando substratos exógenos conforme descrito anteriormente.14 , 15 As atividades da lipase hepática (LH) e da lipoproteína lipase (LPL) foram medidas em amostras de plasma pós-heparina, coletadas 15 minutos após a administração intravenosa de heparina (100 U/kg de peso corporal). O ensaio foi baseado na liberação de ácidos graxos, utilizando uma emulsão de trioleína radiomarcada como substrato, e NaCl 1M como inibidor de LPL.16

Foi medida a proteína C-reativa de alta sensibilidade (hsCRP) por imunoturbidimetria utilizando o ensaio de alta sensibilidade Tina-quant® CRP (látex) (Roche Diagnostics®, Mannheim, Alemanha) na plataforma analítica Hitachi–Roche. Foi usado um kit ELISA comercial fabricado pela R&D para medir o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α).

Foi usado o método ELISA para medir oxLDL-Ab no plasma de todos os participantes.17 , 18 Resumidamente, placas de microtitulação de poliestireno (Costar, Cambridge, Massachusetts, EUA) foram revestidas com 1 µg/ml de oxLDL humana (20 mM Cu2, 24 horas) em tampão carbonato/bicarbonato (20 µL/poço), pH 9,4, e armazenadas durante a noite a 4 ºC. As placas foram bloqueadas com uma solução de leite desnatado a 5% (Molico/Nestlé, São Paulo, Brasil) e, na sequência, incubadas por 2 horas em temperatura ambiente seguida por 4 lavagens com PBS (100 µL). Amostras de plasma (20 µL) foram adicionadas e as placas foram incubadas durante a noite a 4 ºC seguidas por lavagem com 1% Tween 20 em PBS. O anticorpo IgG anti-rato de coelho conjugado com peroxidase (20 µL; 1:1,500) foi então adicionado e, após 1 hora à temperatura ambiente, as placas foram lavadas. Em seguida, 75 µL de solução de substrato (250 mg de tetrametilbenzidina diluídos em 50 mL de DMSO, 10 µL de 30% H2O2, 12 mL de tampão citrato, pH 5,5) foram incorporados à mistura e, após incubação à temperatura ambiente por 15 minutos, a reação foi interrompida pela adição de 25 µL de ácido sulfúrico 2,0 M. A densidade óptica foi lida em um leitor de microplacas (Titertek Multiskan MCC/340P, modelo 2.20, Labsystems, Finlândia) a 450 nm.

Para todas as variáveis medidas, isto é, lipídios, marcadores inflamatórios e atividades enzimáticas, os coeficientes de variação intra/inter-ensaio aceitos variaram de 3% a 10% e de 10% a 15%, respectivamente.

Análise estatística

Os dados são média ± desvio padrão para dados com distribuição normal e mediana (intervalo interquartil) para dados não paramétricos, enquanto as variáveis categóricas são apresentadas como número de casos (porcentagens). A normalidade das variáveis contínuas foi avaliada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. ANOVA de uma via com teste post hoc de Bonferroni e o teste Kruskal-Wallis com post hoc de Dunn-Bonferroni foram usados para comparar a distribuição de dados contínuos paramétricos e não paramétricos entre os grupos, respectivamente. O teste do qui-quadrado com ajuste de Bonferroni foi empregado para comparar a frequência entre os grupos de dados categóricos.

A regressão linear foi utilizada para avaliar a relação entre a variável independente, oxLDL-Ab, e a variável dependente, HDL-C. Este teste foi realizado após a verificação dos pressupostos de normalidade, linearidade, homocedasticidade e independência. A análise de regressão linear ajustada foi utilizada para avaliar a relação entre as variáveis independentes, HDL-C, ApoAI e HDL-3C, e a variável dependente, oxLDL-Ab, após ajuste por covariáveis. Os resultados apresentados como coeficientes de determinação (R2) representam a porcentagem de variação da variável dependente explicada pelas variáveis independentes. Valores de probabilidade (p) menores que 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Todas as análises foram realizadas no software SPSS versão 20.0 para Mac.

Resultados

A Tabela 1 mostra as comparações das características clínicas, antropométricas e bioquímicas entre todos os subgrupos de HDL. Os participantes foram colocados, de acordo com suas concentrações de HDL-C, em uma das três categorias estatisticamente diferentes (p ≤ 0,006): baixa (< 60 mg/dL), intermediária (68 a 80 mg/dL) ou alta (> 80 mg/dL).

Tabela 1. Características clínicas, antropométricas e bioquímicas de indivíduos com concentrações diferentes de HDL-C.

Parâmetros Baixa (< 68 mg/dL) Intermediária (68 a 80 mg/dL) Alta (> 80 mg/dL) Valor p
n 59 71 63  
Idade (anos) 36±14 52±12 53±13 0,001 1,2
Sexo masculino (%) 42,6 11,7 20,9 0,001
IMC (kg/m2) 24±5 25±5 25±5 0,158
PAS (mmHg) 119±13 124±14 130±18 0,001 1,3
PAD (mmHg) 77±9,2 79±10 83±11 0,006 1
Colesterol (mg/dL) 170±45 224±37 231±38 0,001 1,2
TG (mg/dL) 77 (38) 98 (39) 87 (40) 0,008 2
Fosfolipídios (mg/dL) 206±54 225±41 228±48 0,023 1
HDL-C (mg/dL) 51±5,6 73±3,9 86±4,7 0,001 1,2,3
HDL2-C (mg/dL) 11±2,9 17±4,6 19±4,7 0,001 1,2,3
HDL3-C (mg/dL) 36±6 55±7,6 64±6,7 0,001 1,2,3
HDL2TG (mg/dL) 6,8±4,8 8,6±4,7 24±9,8 0,022 1
HDL3TG (mg/dL) 51±5,5 73±4 86±4,7 0,001 1,2
LDL-C (mg/dL) 105±37 130±35 127±35 0,001 1,2
VLDL (mg/dL) 15±7,9 19±7,9 17±8,0 0,020 2
ApoAI (mg/dL) 140±27 180±24 195±31 0,001 1,2,3
ApoB100 (mg/dL) 82±30 104±25 101±26 0,001 1,2
LH (nmol/AGL/mL/h) 2529 (1361) 1539 (973) 1561 (1018) 0,001 1,2
LPL (nmol/AGL/mL/h) 2313 (1012) 2497 (1690) 2880 (1522) 0,091
CETP (%) 15,8±8,3 10,4±6,9 10,7±7,6 0,001 1,2
PLTP (%) 14,4±10,4 19,5±11,4 18,3±16,1 0,020 2
hsCRP (mg/L) 0,38±0,63 0,44±0,54 0,32±0,41 0,451
TNF-α (pg/mL) 9,8±9,3 11±12,3 12±12,1 0,756
oxLDL-Ab (OD) 0,31±0,17 0,33±0,16 0,43±0,17 0,001 1
EMIC média (mm) 0,62±0,12 0,90±0,24 0,86±0,22 0,001 1,2
Uso de álcool % (n) 16,1 24,7 28,4 0,265
DAC % (n) 9,4 6,8 9,0 0,866
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Os dados são representados como média ± desvio padrão e mediana (intervalo interquartil) quando distribuídos normalmente e não normalmente, respectivamente, e como número (%) quando categóricos. Baixa: HDL-C < 68; intermediária: HDL-C 68 a 80 mg/dL; alta: HDL-C > 80 mg/dL. AGL: ácidos graxos livres; ApoAI: apolipoproteína AI; ApoB100: apolipoproteína B100; C: colesterol; CETP: proteína de transferência de éster de colesterol; DAC: doença arterial coronariana; EMIC: espessura médio-intimal carotídea; HDL: lipoproteína de alta densidade; hsCRP: proteína C-reativa de alta sensibilidade; IMC: índice de massa corporal; LDL: lipoproteína de baixa densidade; LH: lipase hepática; LPL: lipoproteína lipase; PAD: pressão arterial diastólica; PAS: pressão arterial sistólica; oxLDL-Ab: autoanticorpos contra lipoproteína de baixa densidade oxidada; PLTP: proteína de transferência de fosfolipídios; TG: triglicerídeos; TNF-α: fator de necrose tumoral alfa; VLDL: lipoproteína de muito baixa densidade. Os valores de p foram obtidos por ANOVA de uma via e teste de Kruskal-Wallis para variáveis contínuas com distribuição normal e não normal, e pelo teste qui-quadrado para dados categóricos. As diferenças entre os grupos são representadas por 1(baixo ≠ alto), 2(baixo ≠ intermediário), 3(intermediário ≠ alto).

Quando comparado ao tercil mais baixo de HDL-C, o tercil mais alto apresentava mais mulheres, idades mais avançadas e, como esperado, maior concentração de colesterol. As atividades de LH e CETP foram reduzidas, e LH e PLTP aumentaram no tercil mais alto de HDL-C em comparação com o tercil mais baixo. Não foram encontradas diferenças em hsCRP e TNFα. Vale ressaltar que os níveis de oxLDL-Ab foram significativamente maiores entre no grupo com HDL-C alta, em comparação ao grupo com HDL-C baixa.

Para explorar a influência das variáveis independentes, concentração de HDL-C, tercis de HDL-C, sexo, ApoAI, ApoB, marcadores inflamatórios e idade, na variável dependente, oxLDL-Ab, foi realizada uma análise de regressão linear, conforme mostrado na Tabela 2 . Os níveis de OxLDL-Ab foram influenciados pela idade, HDL-C, tercis de HDL-C, HDL-3C e ApoAI.

Tabela 2. Regressão linear simples usando oxLDL-Ab como variável dependente.

Variáveis independentes B (SE) Valor p R R2
Idade 0,002 (,001) 0,027 0,216 0,047
Sexo masculino 8,66 (,029) 0,998 0,000 0,000
HDL-C 0,002 (,001) 0,004 0,293 0,086
Tercis de HDL 0,042 (,015) 0,006 0,276 0,076
HDL-2C 0,004 (,002) 0,054 0,191 0,036
HDL-3C 0,002 (,001) 0,016 0,237 0,056
ApoAI 0,001 (,000) 0,002 0,308 0,095
LDL 0,000 (,000) 0,179 0,132 0,017
ApoB 0,001 (,000) 0,204 0,126 0,016
hsCRP 0,052 (,032) 0,105 0,177 0,031
TNF-α 0,002 (,001) 0,086 0,225 0,051
EMIC 0,146 (,085) 0,093 -0,25 0,316
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Regressão linear simples. ApoAI: apolipoproteína AI; ApoB: apolipoproteína B; C: colesterol; EMIC: espessura médio-intimal da carótida; HDL: lipoproteína de alta densidade; hsCRP: proteína C reativa de alta sensibilidade; LDL: lipoproteína de baixa densidade; oxLDL-Ab: autoanticorpos contra lipoproteína de baixa densidade oxidada; TNF-α: fator de necrose tumoral alfa.

Na análise de regressão ajustada, apenas HDL-C e ApoAI foram independentemente relacionados aos níveis de oxLDL-Ab no modelo ajustado pelas covariáveis de idade e ApoB, conforme mostrado na Tabela 3 .

Tabela 3. Regressão linear ajustada por covariáveis.

Variáveis independentes Modelos B (SE) Valor p R R2
HDL-C HDL-C Idade 0,002 (,001) 0,044 0,30 0,090
HDL-C ApoB 0,002 (,001) 0,011 0,279 0,078
HDL-3C HDL-3C Idade 0,001 (,001) 0,166 0,272 0,074
HDL-3C ApoB 0,002 (,001) 0,054 0,234 0,055
ApoAI ApoAI Idade 0,153 (,059) 0,019 0,318 0,101
ApoAI ApoB 0,001 (,00) 0,004 0,310 0,096
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Regressão linear ajustada. ApoAI: apolipoproteína AI; ApoB: apolipoproteína B; HDL-C: colesterol de lipoproteína de alta densidade.

Modelos de curva de regressão linear das relações de HDL e ApoAI com oxLDL-Ab são mostrados nas Figuras 1 e 2 , respectivamente.

Figura 1. Modelo de curva: oxLDL-Ab versus HDL. HDL: lipoproteína de alta densidade; oxLDL-Ab: autoanticorpos contra lipoproteína de baixa densidade.

Figura 1

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Figura 2. Modelo de curva: oxLDL-Ab versus ApoAI. ApoAI: apolipoproteína AI; oxLDL-Ab: autoanticorpos contra lipoproteína de baixa densidade.

Figura 2

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Discussão

A retenção de oxLDL na camada subendotelial da parede arterial é um passo inicial da aterosclerose.19 A oxLDL liga-se a receptores scavenger , como Lox1 e SR-B1, para desencadear vias deletérias que culminam na progressão da placa.20 Além do transporte reverso de colesterol, a HDL modula a imunidade humoral da placa aterosclerótica, regulando positivamente a resposta de IL5 e Th2, que estão envolvidas na ativação de células B e na liberação de oxLDL-Ab.21 Correspondentemente, nosso estudo, pela primeira vez, encontrou uma correlação positiva independente entre níveis séricos de HDL-C e oxLDL-Ab.

Dados experimentais anteriores demonstraram consistentemente um papel ateroprotetor para oxLDL-Ab. De uma perspectiva mecanicista, oxLDL-Ab coloca-se na placa aterosclerótica, onde se liga a epítopos de oxLDL, formando complexos imunes que não podem interagir com os receptores Fcγ de macrófagos.13 , 22 Como resultado, a neutralização de epítopos de oxLDL por oxLDL-Ab impede a ativação de macrófagos, interrompendo uma via imperativa de progressão da placa.13 Em consonância com isso, Dai et al.23 demonstraram que o pré-tratamento de macrófagos com oxLDL-Ab preveniu a morte celular induzida por oxLDL e a ativação de NF-kappaB. De acordo com isso, o tratamento com oxLDL-Ab significativamente reduziu a área transversal da placa aterosclerótica e a molécula de adesão celular vascular 1, e mitigou a captação de macrófagos em camundongos LDLr-

Dados cumulativos de estudos clínicos também apoiaram o papel de oxLDL-Ab como marcador de doença cardiovascular. A esse respeito, os níveis séricos de oxLDL-Ab consistentemente mostraram uma correlação inversa independente com a espessura íntima-média da artéria carótida comum e a progressão da aterosclerose carotídea.16 , 25 - 30 Por exemplo, em uma coorte de 226 pacientes com hipertensão inscritos prospectivamente na análise por ultrassonografia carotídea, aqueles com menor valor de oxLDL-Ab mostraram um risco 3 vezes menor que qualquer progressão da espessura íntima-média das artérias carótidas ao longo 4 anos.31 De forma semelhante, entre os indivíduos submetidos à angiografia coronária clinicamente indicada, aqueles nos tercis mais altos de oxLDL-Ab tiveram um risco 37% menor de aterosclerose coronariana angiograficamente significativa e apresentaram um número menor de artérias com doença quando comparados àqueles com os níveis mais baixos de anticorpos.32 , 33 Consistentemente, Shoji et al.34 observaram um aumento de 2 vezes na mortalidade cardiovascular em 5 anos entre indivíduos com doença renal em estágio final e baixo oxLDL-Ab, quando comparados a pacientes com doença renal em estágio final com níveis mais elevados de oxLDL-Ab.

Além do exposto, verificamos uma correlação independente positiva entre os níveis séricos de HDL-C e oxLDL-Ab. De uma perspectiva mecanicista, esse achado pode derivar dos efeitos imunomoduladores de HDL na resposta Th2, que razoavelmente potencializa a liberação de oxLDL-Ab. Essa hipótese ainda merece uma investigação mais profunda. Outras razões potenciais para a correlação verificada podem ser destacadas, por exemplo, experimentalmente, a captação de HDL atenuada de oxLDL por macrófagos. Isso pode resultar no acúmulo de oxLDL no microambiente da placa, favorecendo a resposta humoral local.35

O presente estudo teve algumas limitações. Mais importante, assumimos que HDL induz oxLDL-Ab modulando a resposta Th2 relacionada a IL5. No entanto, não foi realizada a medição da IL5. Além disso, os níveis de oxLDL, que estão intimamente relacionados à liberação de oxLDL-Ab, também não foram avaliados e teriam sido uma variável de ajuste razoável em nossos modelos. Por fim, o tamanho da amostra foi relativamente pequeno, o que pode ter comprometido o poder estatístico para afirmar a correlação.

Conclusão

Os níveis séricos de oxLDL-Ab e HDL-C estão positivamente relacionados.

Agradecimentos

Agradecemos a assistência técnica e estatística prestada por Mirian Danelon e por Helymar Machado (Universidade de Campinas). Também agradecemos o apoio laboratorial de Dr. Eder CR Quintão, do Laboratório Lipídio da Universidade de São Paulo.

Funding Statement

Fontes de financiamento: O presente estudo foi financiado por Bolsa de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) n° 2006/60585-9, da Fundação de Amparo ao Ensino e à Pesquisa da Universidade Estadual de Campinas (Faepex) n° 179/18 e 2634/19, e o Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, bolsa n° 308169/2018-0, Brasil.

Footnotes

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de mestrado de Carla Evelyn Coimbra Nunez pela Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP).

Fontes de financiamento: O presente estudo foi financiado por Bolsa de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) n° 2006/60585-9, da Fundação de Amparo ao Ensino e à Pesquisa da Universidade Estadual de Campinas (Faepex) n° 179/18 e 2634/19, e o Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, bolsa n° 308169/2018-0, Brasil.

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Positive Association between Autoantibodies Against Oxidized LDL and HDL-C: A Novel Mechanism for HDL Cardioprotection?

Carla Evelyn Coimbra Nunez 1, Joaquim Barreto Oliveira 2, Silvia de Barros-Mazon 1, Vanessa H S Zago 3, Denise Beheregaray Kaplan 1, Ruy T Nakamura 4, Magnus Ake Gidlund 5, Erica I L Gomes 6, Patricia Miralda Cazita 5, Edna Nakandakare 5, Helison R Carmo 6, Andrei C Sposito 2, Eliana Cotta de Faria 1

Abstract

Background

In the atherosclerotic plaque microenvironment, oxidized phospholipids expressed in the oxidized low-density lipoprotein (oxLDL) surface bind to scavenger receptors of macrophages eliciting foam cell formation and plaque progression. Auto-antibodies against oxLDL (oxLDL-Ab) interact with oxidative epitopes leading to the formation of immune complexes that are unable to interact with macrophage receptors, thus abrogating atherogenesis. Release of oxLDL-Ab by B cells involves interleukin 5 and Th2 response, which in turn are potentiated by HDL. Thereby, we hypothesized that individuals with higher levels of HDL-C may plausibly display elevated titers of oxLDL-Ab.

Objective

To evaluate the relationship between HDL-C and oxLDL-Ab levels.

Methods

Asymptomatic individuals (n = 193) were grouped according to their HDL-C concentration to one of three categories: low (< 68 mg/dL), intermediate (68 to 80 mg/dL) or high (> 80 mg/dL). P values < 0.05 were considered statistically significant.

Results

Our analysis included 193 individuals (mean age: 47 years; male: 26.3%). Compared to individuals in the lowest HDL-C tertile, those in the highest tertile were older (36 versus 53 years; p = 0.001) and less frequently male (42.6% versus 20.9%; p = 0.001). Mean values of oxLDL-Ab increased as the HDL-C group escalated (0.31, 0.33 and 0.43 units, respectively; p = 0.001 for trend). Simple linear regression found a significant, positive relationship between the independent variable, HDL-C, and the dependent variable, oxLDL-Ab (R = 0.293; p = 0.009). This relation remained significant (R = 0.30; p = 0.044), after adjustment by covariates. Apolipoprotein AI levels were also related to oxLDL-Ab in both simple and adjusted linear regression models.

Conclusion

HDL-C and oxLDL-Ab are independently related.

Keywords: Cholesterol, HDL; Lipoproteins, IDL; Atherosclerosis

Introduction

Accumulation of apolipoprotein B (ApoB)-containing lipoproteins, chiefly low density lipoprotein (LDL), in arterial intima has been pursued as the initial step of atherogenesis.1 In this arterial microenvironment, oxidative modification generates several new epitopes in LDL, which are recognized by immune cells and lead to the activation of Th1 and Th2 inflammatory response eliciting the release of autoantibodies against oxidized LDL (oxLDL-Ab).2 , 3

The protective role of oxLDL-Ab in atherogenesis is supported by a growing body of evidence. In fact, treatment with oxLDL-Ab diminished atherosclerotic plaque progression, and significantly mitigated oxidized LDL (oxLDL) uptake by macrophages in apolipoprotein E (ApoE)-deficient mice.4 - 7 Moreover, observational studies have found that oxLDL-Ab levels are inversely related to carotid intima media thickness and to oxLDL levels in healthy individuals.8 Accordingly, a large systematic review concluded that oxLDL-Ab levels are inversely related to coronary artery disease severity and incidence of cardiovascular events.9

The beneficial properties of oxLDL-Ab have sparked an intense search for modulators of its release. In this matter, Chou et al.10 found that stimulation of B cells with interleukin 5 (IL5) elicited generation of oxLDL-Ab. Importantly, IL5 is related to Th2 response, which in turn is proven to be inhibited by oxLDL but enhanced by high-density lipoprotein (HDL).11 , 12 This considered, we designed the present study hypothesizing that plasma HDL may be independently associated with plasma levels of oxLDL-Ab. To address this, our study evaluated whether oxLDL-Ab and high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are related in individuals with a large range of plasma HDL-C concentrations.

Methods

Research design

The study was conducted as cross-sectional analysis of data from healthy individuals consecutively enrolled in a large pool of asymptomatic patients attended at the University of Campinas Teaching Hospital, in the city of Campinas, Sao Paulo, Brazil. Eligible patients were 18 years or older, from both sexes. After signing the informed consent form, participants answered a detailed eligibility questionnaire.

Exclusion criteria were any previous coronary artery disease or stroke; secondary causes of low or high plasma HDL-C; regular use of medical treatments (especially those interfering in lipid metabolism, such as statins, hormonal replacement therapy, and contraceptives); liver, renal, lung, and endocrine diseases (such as diabetes); chronic use of alcohol and tobacco; and women who were pregnant or lactating due to the possible hormone influence. Eligible participants then underwent a detailed physical examination, blood pressure measurements, and carotid ultrasound examination, and their peripheral blood sample was collected for biochemical analysis.

Participants were grouped according to their HDL-C levels tertiles as follows: 1) low HDL-C concentrations (HDL-C below 68 mg/dL: n = 59); 2) intermediate concentrations (HDL-C 68 to 80 mg/dL: n = 71) and high HDL-C concentrations (HDL-C > 80 mg/dL: n = 63).

The Research Ethics Committee of the State University of Campinas approved all procedures under opinion number 790/2006. All participants signed a consent declaration to participate in the study.

Sample collection and analytical methods

Venous blood samples were drawn after a 12-hour fasting period in individuals selected to participate in the study. The samples were centrifuged (4 °C, 1000 g, 10 minutes) for serum and EDTA plasma separation, and stored at −80 °C until analysis. Another 12-hour fasting blood sample was collected during a second visit 15 minutes after intravenous administration of heparin (Liquemine® Roche, 100 U/kg body weight).

Total cholesterol, triglycerides, and phospholipids in serum and the first two analytes in lipoproteins were analyzed by enzymatic-colorimetric methods (BM Hitachi 917 Roche, Mannheim, Germany). Apolipoprotein B100 and apolipoprotein AI (ApoAI) were measured in an automated BN II system (Siemens Healthcare Diagnostics, Marburg, Germany), using commercially available assays (Dade-Boehringer®, Deerfield, Illinois, USA). HDL-C was analyzed by a direct homogenous method. Low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) was calculated by Friedewald’s13 formula.

To obtain HDL sub-fractions, lipoproteins that contained ApoB were precipitated by dextran sulfate, and the supernatant substance was submitted to sequential micro-ultracentrifugation using the Airfuge/75B (Beckman Instruments, Palo Alto, California, USA).

Plasma activities of cholesteryl ester transfer protein (CETP) and phospholipid transfer protein (PLTP) were determined through radiometric assays using exogenous subtracts as previously described.14 , 15 Hepatic lipase (HL) and lipoprotein lipase (LPL) activities were measured in post-heparin plasma samples, collected 15 minutes after intravenous administration of heparin (100 U/kg of body weight). The assay was based on the fatty acid release, using a radiolabeled triolein emulsion as substrate, and NaCl 1M as LPL inhibitor.16

High-sensitivity C-reactive protein (hsCRP) was measured by immunoturbidimetry utilizing the Tina-quant® CRP (latex) high sensitivity assay (Roche Diagnostics®, Mannheim, Germany) in the Hitachi–Roche analytical platform. A commercial ELISA kit manufactured by R&D was used for tumor necrosis factor alpha (TNF-α) measurement.

The ELISA method was used to measure oxLDL-Ab in the plasma of all participants.17 , 18 Briefly, polystyrene microtiter plates (Costar, Cambridge, Massachusetts, USA) were coated with 1 µg/ml of human oxLDL (20 mM Cu2, 24 hours) in carbonate/bicarbonate buffer (20 µL/well), pH 9.4, and kept overnight at 4 ºC. The plates were blocked with a 5% solution of fat-free milk (Molico/Nestlé, São Paulo, Brazil), and then incubated for 2 hours at room temperature followed by washing 4 times with PBS (100 µL). Plasma samples (20 µL) were added, and the plates were incubated overnight at 4 ºC followed by washing with 1% Tween 20 in PBS. The peroxidase-conjugated rabbit anti-mouse IgG antibody (20 µL; 1:1.500) was then added, and after 1 hour at room temperature, the plates were washed. Subsequently, 75 µL of substrate solution (250 mg of tetramethylbenzidine diluted in 50 mL of DMSO, 10 µL of 30% H2O2, 12 mL of citrate buffer, pH 5.5) were incorporated to the mixture and, after incubation at room temperature for 15 minutes, the reaction was stopped by adding 25 µL of 2.0 M sulfuric acid. The optical density was read in a microplate reader (Titertek Multiskan MCC/340P, model 2.20, Labsystems, Finland) at 450 nm.

For all measured variables, i.e., lipid, inflammatory markers, and enzyme activities, the accepted intra/inter-assay coefficients of variation varied from 3% to 10%, and from 10% to 15%, respectively.

Statistical analysis

Data are mean ± standard deviation for normally distributed data and median (interquartile range) for non-parametric data, whereas categorical variables are presented as number of cases (percentages). The normality of the continuous variables was assessed by the Kolmogorov-Smirnov test. One-way ANOVA with Bonferroni post-hoc test and Kruskal-Wallis with Dunn-Bonferroni post hoc were used to compare the distribution of parametric and nonparametric continuous data across groups, respectively. Chi-square test with Bonferroni adjustment was employed to compare the frequency across groups of categorical data.

Linear regression was utilized to assess the relationship between the independent variable, oxLDL-Ab, and the dependent variable, HDL-C. This test was performed after assumptions of normality, linearity, homoscedasticity, and independence were ascertained. Adjusted linear regression analysis was utilized to assess the relationship between the independent variables, HDL-C, ApoAI, and HDL-3C, and the dependent variable, oxLDL-Ab, after adjustment by covariates. The results shown as coefficients of determination (R2) represent the percentage of variation in the dependent variable explained by the independent variables. Probability values (p) less than 0.05 were considered statistically significant. All analyses were performed using the software SPSS version 20.0 for Mac.

Results

Table 1 shows the comparisons of clinical, anthropometric, and biochemical characteristics among all HDL subgroups. The participants were assigned, according to their HDL-C concentrations to one of three statistically different categories (p ≤ 0.006): low (< 60 mg/dL), intermediate (68 to 80 mg/dL) or high (> 80 mg/dL).

Table 1. Clinical, anthropometric, and biochemical characteristics of individuals with different concentrations of HDL-C.

Parameters Low (< 68 mg/dL) Intermediate (68 to 80 mg/dL) High (> 80 mg/dL) p values
n 59 71 63  
Age (years) 36±14 52±12 53±13 0.001 1,2
Male (%) 42.6 11.7 20.9 0.001
BMI (kg/m2) 24±5 25±5 25±5 0.158
SBP (mmHg) 119±13 124±14 130±18 0.001 1,3
DBP (mmHg) 77±9.2 79±10 83±11 0.006 1
Cholesterol (mg/dL) 170±45 224±37 231±38 0.001 1,2
TG (mg/dL) 77 (38) 98 (39) 87 (40) 0.008 2
Phospholipids (mg/dL) 206±54 225±41 228±48 0.023 1
HDL-C (mg/dL) 51±5.6 73±3.9 86±4.7 0.001 1,2,3
HDL2-C (mg/dL) 11±2.9 17±4.6 19±4.7 0.001 1,2,3
HDL3-C (mg/dL) 36±6 55±7.6 64±6.7 0.001 1,2,3
HDL2TG (mg/dL) 6.8±4.8 8.6±4.7 24±9.8 0.022 1
HDL3TG (mg/dL) 51±5.5 73±4 86±4.7 0.001 1,2
LDL-C (mg/dL) 105±37 130±35 127±35 0.001 1,2
VLDL (mg/dL) 15±7.9 19±7.9 17±8.0 0.020 2
ApoAI (mg/dL) 140±27 180±24 195±31 0.001 1,2,3
ApoB100 (mg/dL) 82±30 104±25 101±26 0.001 1,2
HL (nmol/FFA/mL/h) 2529 (1361) 1539 (973) 1561 (1018) 0.001 1,2
LPL (nmol/FFA/mL/h) 2313 (1012) 2497 (1690) 2880 (1522) 0.091
CETP (%) 15.8±8.3 10.4±6.9 10.7±7.6 0.001 1,2
PLTP (%) 14.4±10.4 19.5±11.4 18.3±16.1 0.020 2
hsCRP (mg/L) 0.38±0.63 0.44±0.54 0.32±0.41 0.451
TNF-α (pg/mL) 9.8±9.3 11±12.3 12±12.1 0.756
oxLDL-Ab (OD) 0.31±0.17 0.33±0.16 0.43±0.17 0.001 1
Mean CIMT (mm) 0.62±0.12 0.90±0.24 0.86±0.22 0.001 1,2
Alcohol use % (n) 16.1 24.7 28.4 0.265
CAD % (n) 9.4 6.8 9.0 0.866
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Data are represented as mean ± standard deviation and median (interquartile range) when normally and non-normally distributed, respectively, and as number (%) when categorical. Low: HDL-C < 68; intermediate: HDL-C 68 to 80 mg/dL; high: HDL-C > 80 mg/dL. ApoAI: apolipoprotein AI; ApoB100: apolipoprotein B100; BMI: body mass index; C: cholesterol; CAD: coronary artery disease; CETP: cholesterol ester transfer protein; CIMT: carotid intima-media thickness; DBP: diastolic blood pressure; FFA: free fatty acids; HDL: high-density lipoprotein; HL: hepatic lipase; hsCRP: high-sensitivity C-reactive protein; LDL: low-density lipoprotein; LPL: lipoprotein lipase; oxLDL-Ab: autoantibodies against oxidized low-density lipoprotein; PLTP: phospholipid transfer protein; SBP: systolic blood pressure; TG: triglycerides; TNF-α: tumor necrosis factor alpha; VLDL: very low-density lipoprotein. The p values were obtained by one-way ANOVA and Kruskal-Wallis test for continuous variables with normal and non-normal distribution, and by chi-square test for categorical data. Differences among groups are represented by1(low ≠ high),2(low ≠ intermediate),3(intermediate ≠ high).

When compared to the lowest tertile of HDL-C, the highest tertile had more women, older ages, and, as expected, higher concentration of cholesterol. HL and CETP activities were reduced, and HL and PLTP increased in the upper tertile of HDL-C as compared to those in the lowest tertile. No differences were found in hsCRP and TNF-α. It is noteworthy that oxLDL-Ab levels were significantly higher in the high HDL-C group, in comparison to the low HDL-C group.

To explore the influence of the independent variables, HDL-C concentration, HDL-C tertiles, sex, ApoAI, ApoB, inflammatory markers and age, on the dependent variable, oxLDL-Ab, a linear regression analysis was performed, as shown in Table 2 . OxLDL-Ab levels were influenced by age, HDL-C, HDL-C tertiles, HDL-3C, and ApoAI.

Table 2. Simple linear regression using oxLDL-Ab as dependent variable.

Independent variables B (SE) p values R R2
Age 0.002 (.001) 0.027 0.216 0.047
Male 8.66 (.029) 0.998 0.000 0.000
HDL-C 0.002 (.001) 0.004 0.293 0.086
HDL tertiles 0.042 (.015) 0.006 0.276 0.076
HDL-2C 0.004 (.002) 0.054 0.191 0.036
HDL-3C 0.002 (.001) 0.016 0.237 0.056
ApoAI 0.001 (.000) 0.002 0.308 0.095
LDL 0.000 (.000) 0.179 0.132 0.017
ApoB 0.001 (.000) 0.204 0.126 0.016
hsCRP 0.052 (.032) 0.105 0.177 0.031
TNF-α 0.002 (.001) 0.086 0.225 0.051
CIMT 0.146 (.085) 0.093 -0.25 0.316
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Simple linear regression. ApoAI: apolipoprotein AI; ApoB: apolipoprotein B; C: cholesterol; CIMT: carotid intima-media thickness; HDL: high-density lipoprotein; hsCRP: high-sensitivity C-reactive protein; LDL: low-density lipoprotein; oxLDL-Ab: autoantibodies against oxidized low-density lipoprotein; TNF-α: tumor necrosis factor alpha.

In the adjusted regression analysis, only HDL-C and ApoAI were independently related to oxLDL-Ab levels in the model adjusted by the covariates of age and ApoB, as shown in Table 3 .

Table 3. Linear regression adjusted by covariates.

Independent variables Models B (SE) p values R R2
HDL-C HDL-C Age 0.002 (.001) 0.044 0.30 0.090
HDL-C ApoB 0.002 (.001) 0.011 0.279 0.078
HDL-3C HDL-3C Age 0.001 (.001) 0.166 0.272 0.074
HDL-3C ApoB 0.002 (.001) 0.054 0.234 0.055
ApoAI ApoAI Age 0.153 (.059) 0.019 0.318 0.101
ApoAI ApoB 0.001 (.00) 0.004 0.310 0.096
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Adjusted linear regression. ApoAI: apolipoprotein AI; ApoB: apolipoprotein B; HDL-C: high-density lipoprotein cholesterol.

Linear regression curve models of HDL and ApoAI relationships to oxLDL-Ab are shown in Figures 1 and 2 , respectively.

Figure 1. Curve model: oxLDL-Ab versus HDL. HDL: high-density lipoprotein; oxLDL-Ab: autoantibodies against oxidized low-density lipoprotein.

Figure 1

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Figure 2. Curve model: oxLDL-Ab versus ApoAI. ApoAI: apolipoprotein AI; oxLDL-Ab: autoantibodies against oxidized low-density lipoprotein.

Figure 2

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Discussion

Retention of oxLDL in the subendothelial layer of the arterial wall is an initiating step of atherosclerosis.19 OxLDL binds to scavenger receptors, such as Lox1 and SR-B1, to prompt downstream deleterious pathways that culminate in plaque progression.20 Beyond reverse cholesterol transport, HDL modulates humoral immunity of atherosclerotic plaque, upregulating IL5 and Th2 response, which are involved in B cell activation and release of oxLDL-Ab.21 Correspondingly, our study, for the first time, found an independent positive correlation between serum levels of HDL-C and oxLDL-Ab.

Prior experimental data have consistently demonstrated an atheroprotective role for oxLDL-Ab. From a mechanistic perspective, oxLDL-Ab colocalizes in the atherosclerotic plaque, where it binds to oxLDL epitopes forming immune complexes that cannot interact with macrophage Fcγ receptors.13 , 22 As a result, neutralization of oxLDL epitopes by oxLDL-Ab prevents macrophage activation, interrupting an imperative pathway of plaque progression.13 In line with this, Dai et al22 demonstrated that pretreatment of macrophages with oxLDL-Ab prevented oxLDL-induced cell death and NF-kappaB activation. Accordingly, treatment with oxLDL-Ab significantly reduced cross-sectional atherosclerotic plaque area and vascular cell adhesion molecule 1, and it mitigated macrophage uptake in LDLr-mice.22 , 24

Cumulative data from clinical studies have also supported a role for oxLDL-Ab as a marker of cardiovascular disease. In this matter, serum levels of oxLDL-Ab have consistently shown an independent inverse correlation with common carotid artery intima-media thickness and progression of carotid atherosclerosis.16 , 25 - 30 For example, in a cohort of 226 patients with hypertension prospectively enrolled in carotid ultrasound analysis, those with the lowest value of oxLDL-Ab showed a 3-fold reduced risk of any 4-year progression of intima-media thickness of the carotid arteries.31 Similarly, among individuals undergoing clinically indicated coronary angiography, those in the highest tertiles of oxLDL-Ab had a 37% lower risk of angiographically significant coronary atherosclerosis, and displayed a lower number of diseased arteries when compared to those with the lowest titers of antibodies.32 , 33 Consistently, Shoji et al.34 observed a 2-fold increased 5-year cardiovascular mortality among individuals with end-stage renal disease and low oxLDL-Ab, when compared to patients with end-stage renal disease with higher levels of oxLDL-Ab.

In addition to the aforesaid, we found a positive independent correlation between serum levels of HDL-C and oxLDL-Ab. From a mechanistic perspective, this finding may derive from immunomodulatory effects of HDL on Th2 response, which reasonably potentiates oxLDL-Ab release. This hypothesis still warrants further examination. Other potential reasons for the verified correlation may be highlighted, for example, experimentally, HDL attenuated uptake of oxLDL by macrophages. This may result in accumulation of oxLDL in the plaque microenvironment, favoring local humoral response.35

This study had some limitations. More importantly, we assumed that HDL induces oxLDL-Ab by modulating IL5-related Th2 response. Nevertheless, measurement of IL5 were not performed. Furthermore, oxLDL levels, which are closely related to oxLDL-Ab release, were also not assessed and would have been a reasonable adjustment variable in our models. Finally, sample size was relatively small, which may have jeopardized statistical power to claim correlation.

Conclusion

Serum levels of oxLDL-Ab and HDL-C are positively related.

Acknowledgements

We thank the technical and statistical assistance provided by Mirian Danelon and by Helymar Machado (University of Campinas). We also acknowledge the laboratory support from Dr. Eder CR Quintão, from the Lipid Laboratory, University of São Paulo.

Footnotes

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Carla Evelyn Coimbra Nunez, rom Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP).

Sources of Funding: This study was partially funded by State of São Paulo Research Foundation (FAPESP) grant n° 2006/60585-9, the University of Campinas Teaching and Research Support Foundation (Faepex) grant n° 179/18 and 2634/19, and the National Council for Scientific and Technological Development, grant n° 308169/2018-0, Brazil.

Articles from Arquivos Brasileiros de Cardiologia are provided here courtesy of Sociedade Brasileira de Cardiologia

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