Skip to main content
NCBI home page
Revista Brasileira de Ortopedia logoLink to Revista Brasileira de Ortopedia
. 2022 Jul 22;57(6):1051–1059. doi: 10.1055/s-0042-1744292

Biocomponents Based on Hydroxiapatite: Influence of Sterilization on the Mechanical Resistance

Ivânio Tagliari 1,✉, Alan Menegaz Lerner 2, Antônio Lourenço Severo 3, Charles Leonardo Israel 2
PMCID: PMC9757965  PMID: 36540739

Abstract

Objective  This study aimed to evaluate the influence of sterilization on the compressive and flexural mechanical strength of hydroxyapatite-based biocomponents obtained through freeze-dried bovine bone, and its association with chitosan.

Methods  Freeze-dried bovine bone was processed into 100 μm particles and mixed with 50% of its weight in chitosan. The mixture was packed in metallic molds for preparing the specimens, and sterilized at 127°C using an autoclave for subsequent experimentation. The specimens were subjected to compression and flexion tests following norm 5833 of the International Organization for Standardization (ISO), with 6 × 12 mm cylindrical blocks (for compression tests) and 75 × 10 × 3.3 mm plates (for flexion tests) as samples. The samples were divided into four groups of 20 specimens each, with 10 for compression and 10 for flexion tests. Three groups were sterilized (autoclave, gamma rays, and ethylene oxide), whereas the fourth group (control) was not. The mechanical tests obtained from the different sterilization processes were compared using analysis of variance (ANOVA, p  < 0.05), followed by the Tukey multiple comparison test of means, with a 95% confidence interval.

Results  The specimens presented mean compressive strengths of 10.25 MPa for the control group and 3.67 MPa, 9.65 MPa, and 9.16 MPa after ethylene oxide, gamma ray, and autoclave sterilization, respectively. Flexion test results showed an average resistance of 0.40 MPa in the control group, and 0.15 MPa, 0.17 MPa, and 0.30 MPa after ethylene oxide, gamma ray, and autoclave sterilization, respectively. There were statistically significant differences observed in the maximum compression of the ethylene oxide-sterilized group compared with that of the control group ( p  = 0 . 0002), gamma ray-sterilized ( p  = 0.0003), and the autoclaved ( p  = 0.0006) groups. There was a statistically significant difference in maximum flexion of the specimens sterilized by gamma rays when compared with the control group ( p  = 0.0245). However, low flexural strengths were observed in all specimens.

Conclusion  The autoclave sterilization group did not result in statistically significant differences in either compression or flexion strength tests. Thus, the autoclave proved to be the best sterilization option for the hydroxyapatite-based biocomponents in this study.

Keywords: biocompatible materials, chitosan, bone transplantation, hydroxyapatite, mechanical tests

Introduction

Advances in the health area, combined with engineering and other branches of science, mainly motivated by the increase in life expectancy and quality of life, have enabled the development of techniques that seek to reestablish the total or partial functions of the organ or tissue of people who suffered some kind of mutilation or were affected by some disease. 1

As the body ages, joints and bones become fragile, causing pain and restricting certain movements. Thus, orthopedic, dental and veterinary implants have been applied with greater frequency, and many studies are performed to obtain equipment and, in this case, implant materials such as bone that meet these new medical needs. 2

Biomaterials are more relevant in devices that are temporarily or permanently implanted into the human body. These improve the bone repair process in the dental, orthopedic and veterinary areas, mainly in bone fractures and affections, such as: small bone defect in elongation or shortening of extremities, corrective addition or subtraction osteotomies, dental and orthopedic prostheses, tumoral bone defects, and pseudoarthrosis.

These materials differ from others because they contain a combination of mechanical, chemical, physical, and biological properties that make them viable to be used inside the human body. 2 Among the several materials that are constantly being tested and evaluated in the laboratory are hydroxyapatite—with proven osteoconductive function—and chitosan—a biopolymer capable of stimulating the release of cellular cytokine inducers. The combination of these biomaterials consolidates their advantages into a single compound that accelerates the bone regeneration process, especially in cases of fractures with delayed or poor bone union. 3

Hydroxyapatite is one of the most biocompatible ceramics due to its similarity with the minerals that constitute human bones and teeth. 4 It has various advantages such as uniform composition, high biocompatibility, safety—it is not toxic, allergenic, or carcinogenic—and completely controllable microstructure (pore size). 5 Therefore, it has been studied as a potential substitute material for bone and dental implants. 6 Some studies used hydroxyapatite with different proportions of calcium and phosphorus to verify its function in bone regeneration based on its osteoconductive property. 7 8

Kong et al. 9 conducted an in vitro study to investigate the bioactivity of chitosan/hydroxyapatite and observed that the composite presented better bioactivity than chitosan alone. Chitosan is obtained from chitin, a polysaccharide found abundantly in nature, primarily in crustaceans, insects, and fungi. Chitosan is obtained from chitin by a process of chemical or enzymatic deacetylation. 10 The antimicrobial and antioxidant properties of chitosan led to its numerous applications in different fields, including the food industry, cosmetic and personal care products, wastewater management, pharmacological products, and implantable materials. 11 12

In this study, it was determined that we cannot use these biomaterials, hydroxyapatite and chitosan, in the human body without going through the sterilization process, which weakens the mechanical structure of these components, changing their resistance. Based on that, this referent study aims to research the best sterilization method that allows its use without changing the characterization of the material and losing its resistance. Therefore, hypotheses are made regarding the best sterilization method. The chosen methods can be divided into physical (heat, filtration, and radiation) and chemical (phenolic compounds, chlorhexidine, halogens, alcohols, peroxides, ethylene oxide, formaldehyde, glutaraldehyde, and peracetic acid).

Therefore, this study aims to analyze the effect of sterilization on the mechanical strength of lyophilized bovine bone (hydroxyapatite) that was processed and mixed with chitosan at 50% by weight. The specimens from the different groups were submitted to compression and flexion tests according to norm 5833 of the International Organization for Standardization (ISO).

Materials and Methods

For this study, 10 bovine femurs were obtained from animals between 2 and 3 years of age from slaughterhouses in the Southern Region of Brazil. A flowchart of this study's chemical and mechanical processes was prepared to facilitate the execution ( Fig. 1 ).

Fig. 1.

Fig. 1

Open in a new tab

Flowchart of the chemical and mechanical processes in the experimental study.

Initially, the muscular portion of the bones was removed, then cleaned and degreased with hydrogen peroxide and saline solution. Bone fillets were prepared using a band saw, frozen in an ultrafreezer (−70°C), and lyophilized using a LS3000 Terroni (Terroni Elec., São Carlos, SP, Brazil) freeze-drier ( Fig. 2 ). Freeze-drying was performed over a period of 5 days to remove all bone moisture by sublimation. After lyophilization, the bones were cut into blocks, triturated, and ground using a SPLabor Parakeet Mill (SPLabor. Presidente Prudente, SP, Brazil) model 16 at an average rotation of 50 RPM, using 30 Ø8 mm and 80 Ø15 mm spheres ( Fig. 3 ). The grinding was performed for 6 to 12 hours, until it reached a maximum granulometry of 100 µm, as verified using the Mastersizer 3000 (Malvern Panalytical. Malvern, United Kingdom) equipment ( Fig. 4 ).

Fig. 2.

Fig. 2

Open in a new tab

Freeze-dryer Terroni LS 3000 model.

Fig. 3.

Fig. 3

Open in a new tab

Parakeet Mill SPLabor model 16.

Fig. 4.

Fig. 4

Open in a new tab

Mastersizer 3000.

For mixing the inputs, first the materials were weighed in a Shimadzu analytical balance, model AY220. Chitosan was added, with a proportion of 50% in weight, to lyophilized bovine bone in a Marconi industrial mixer (Marconi Ltda. Piracicaba, SP, Brazil) for a period of 3 minutes. To make an alloy, 3.5 mL of distilled water was added for every 10 g of powder. After homogenization, the composite was inserted into metal molds to make the specimens. These were made in standardized templates, manufactured according to ISO 5833. The molds were filled with the bone mixture after applying the release agent WD-40 (Theron Marketing Ltda. Curitiba, PA, Brazil) in the holes to facilitate the subsequent removal of the components. Metallic molds with dimensions of 6 ×12 mm (compression test) and 75 ×10 ×3.3 mm (flexion test) were used ( Fig. 5A and 5B ). Steel 316L plates were used for the lower and upper ends of the molds to facilitate sample extraction. A pachymeter was used to verify the specimens' standardization.

Fig. 5.

Fig. 5

Open in a new tab

( A ) Compression matrix. ( B ) Bending matrix.

The molds were immobile for 7 days and the removal was aided by an extruder tool formed by a handle of clinical grade dental mirror (size no. 5). Thereafter, the samples were stored away from humidity and light, at an average temperature of 23°C, to prevent interference until the application of mechanical loads.

After the calibration process, they were sterilized in four groups of 20 units each using autoclave for the first, gamma rays for the second, and ethylene oxide for the third group.

The results of the mechanical tests obtained from the different sterilization processes performed were compared using analysis of variance (ANOVA), followed by the Tukey multiple comparison test of means, with a 95% confidence interval. Statistical analysis was performed using the Statistica (Statsoft Inc., Tulsa, OK, USA) software, version 7.0. The values considered as statistically significant were p  < 0.05.

Autoclave

Autoclaving sterilization was performed in the Sterilization Center of the Hospital São Vicente de Paulo in Passo Fundo, RS, Brazil. The material was sterilized at a water boiling temperature of 121°C for 15 minutes.

We used the 300-L STERIS Industrial Autoclave (Future Health Concepts Inc. Sanford, FL, USA) model SV 3043, following all the protocols required by the Brazilian Health Surveillance Standards.

Gamma Rays

The specimens were sent to Companhia Brasileira de Esterilização (EMBRARAD. Cotia, SP, Brazil) for application of gamma rays using a Linear Cobalt 60 Accelerator (Nordion Inc. Ottawa, ON, Canada) models JS 7500 and JS 9600.

All the controls and documentation of the process were followed, as foreseen by the ISO 9001 standard. They were made with 3 cycle times of 2'18” for the JS 9600 model and 2 cycle times of 7'45” for the JS 7500 model.

Ethylene Oxide

The sterilization method using ethylene oxide gas was performed in a Baumer autoclave (Baumer, São Paulo, SP, Brazil) with a 700 L capacity for 3 to 4 hours of exposure.

The ethylene oxide gas is injected into the chamber once it reaches the pressure and temperature levels adjusted to the exposure time. After exposure to ethylene oxide, the material goes through a vacuum processing phase with nitrogen injection sequence, to completely remove the gas and reduce the risk of poisoning.

Mechanical Tests

The tests were performed using the SCHENK machine (Hangzhou Jizhi Mechatronic Ltd. Hangzhou, China) from the Mechanical Engineering Laboratory of the Universidade de Passo Fundo, in the Southern Region of Brazil.

Of the 80 samples, 40 units were assayed for flexion and 40 for compression. The samples were divided into 60 units that went through a sterilization process, 20 each for autoclave, gamma rays, and ethylene oxide, while the other 20 control samples did not undergo sterilization. The tests were performed according to ISO 5833 ( Fig. 6A ).

Fig. 6.

Fig. 6

Open in a new tab

( A ) Compression test. ( B ) Bending test.

Compression Test

According to ISO 5833, samples for compression testing should be made in cylindrical matrices with dimensions of 6 mm in diameter and 12 mm in length. In our study, the speed of application of compressive force was constant with values between 19.8 and 25.6 mm/min.

Bending Test

The flexural test follows the ISO 5833 standard, which proposes a minimum flexural strength of 1800 MPa and an upper flexural modulus starting at 50 MPa. The standard also suggests recording the flexural values found when the loading was equal to 15N (initial) and 50N ( Fig. 6B ), in addition to the rupture force of the specimen.

Results

In all compression and flexural tests, supraphysiological loads were used to break the specimens.

In the compression tests, there was no statistically significant difference observed between the control and gamma ray-sterilized groups ( p  = 0.9634), control and autoclave-sterilized ( p  = 0.8170), and gamma rays and autoclave sterilized groups ( p  = 0 . 9784). However, there were statistically significant differences observed in the maximum compression of the ethylene oxide-sterilized group compared with the control ( p  = 0.0002), gamma ray-sterilized ( p  = 0.0003), and the autoclaved ( p  = 0.0006) groups. These results indicate that there is a loss of resistance to compression when the biomaterial specimens are sterilized by ethylene oxide. Thus, ethylene oxide is not a good alternative for the sterilization of the composite studied.

Considering the flexural strength, there was no statistically significant difference between specimens from the control and ethylene oxide sterilized groups ( p  = 0 . 0764), control and autoclave-sterilized ( p  = 0.5816), ethylene oxide-sterilized and autoclaved ( p  = 0.4182), ethylene oxide and gamma ray-sterilized ( p  = 0.9954), and gamma ray-sterilized and autoclaved groups ( p  = 0.3230). However, there was a statistically significant difference in maximum flexion of the specimens sterilized by gamma rays when compared with the control group ( p  = 0.0245). Therefore, there was a significant loss of flexural strength when comparing the specimens sterilized by gamma rays with the control group.

Although there were no statistically significant differences observed in the control group to flexural strength, ethylene oxide caused an important loss of strength of the material. However, low flexural strengths were observed in all specimens. Moreover, the autoclave sterilization group did not present statistically significant differences in either compression or flexion strength tests ( Table 1 , Figs. 7 and 8 ).

Table 1. Average values of resistance of specimens sterilized using different processes.

Sterilization process Maximum compression (MPa) – Average value (±SD) Maximum bending (MPa) – Mean value (±SD)
Control 10.25 (±3.14) a 0.40 (±0.24) a
Ethylene oxide 3.67 (±0.88) b 0.15 (±0.06) a, b
Gamma rays 9.65 (±3.58) a 0.17 (±0.07) b
Autoclave 9.16 (±2.67) a 0.30 (±0.17) a, b
Open in a new tab

Abbreviation: SD, standard deviation. Notes: a, b Equal letters in the same column indicate values belonging to the same homogeneous group, in which there was no statistically significant difference between its components, according to the Tukey test, at a 95% confidence interval.

Fig. 7.

Fig. 7

Open in a new tab

Values of average compressive stress found in the different groups.

Fig. 8.

Fig. 8

Open in a new tab

Values of average stress to bending found in the different groups.

Discussion

According to the studies by Somfai et al. 13 (2010) they mention that it is interesting to use a compound of hydroxyapatite and chitosan, combining the osteoconductive characteristic of the first with the biodegradability and mechanical resistance of the second. They reported that after 60 days, complete degradation of the biomaterials was not observed in implants for dogs. However, for Danilchenko et al. 14 (2009), who evaluated that the same composite, implanted in the tibia of rats, had good osteoconductive properties and biodegradation was practically complete, suggesting that the total replacement of the hydroxyapatite/chitosan implant by the neoformed bone tissue inside of bone failure occurs up to the 24th day after implantation. This difference was probably due to the difference between species (the metabolism rate of rats is higher than that of dogs). Fontes 15 (2009), in a study with hydroxyapatite to assess alveolar bone regeneration in dogs, found that at 60 days there was still the presence of the biomaterial. It was concluded that more studies are necessary to evaluate the biodegradation time of this compound.

According to the study by Rolim et al. 16 (2018) there was a more favorable biological response when chitosan was associated with other biomaterials. Therefore, it is important to continue scientific investigations with the use of these natural biopolymers, to better understand their role in cell behavior, as well as to improve manufacturing methodologies that can expand their clinical use in bone regeneration. With ongoing scientific investigations in all relevant areas of knowledge and in biomaterials, it is expected that many bone diseases—such as bone loss due to trauma, bone resection due to tumors, bone aging, as well as skeletal, metabolic, or genetic alterations—will be successfully treated with new bone regeneration protocols.

As reported by Rosito 17 (2006), the freeze-drying process may cause damage to the properties of the bone, especially to resistance. However, other studies using freeze-dried and frozen human and bovine bone grafts in acetabular reconstruction of patients found that the resistance property of these grafts was similar. With the application of compression tests, one can evaluate the resistance of freeze-dried bone and observe whether the mechanical properties are not altered. 17 Another study on freeze-dried bone showed a weakening of the grafts after the tests. 18 Resistance to torque was also applied to freeze-dried bones, showing an alarming loss of 88% of the original resistance. 19 In contrast, there were studies reporting that lower humidity increased the bone's mechanical resistance. 20 Furthermore, it has been demonstrated that freeze-dried human bone presents greater mechanical resistance to compression than fresh bone.

Although the biological aspect is not the focus of this study, it should be noted that Galia's 21 (2004) and Kakiuchi et al.'s 22 (1996) biopsy studies, performed in hip and knee prosthesis reviews, observed signs of integration of hydroxyapatite graft, characterized by the presence of necrotic bone trabeculae, involved by newly formed bone tissue, marrow hematopoietic, and adipose cells.

In his study, Mendes 23 (2006) used metal molds containing 48 cylindrical-shaped holes with dimensions of 6 ×12 mm to prepare bone cement specimens. The author used a universal mechanical test press to which a load cell of 49050 N (5000 kgf) had been attached at the speed of 20 mm/min. In this research, the author used 5 samples of 5 brands of bone cement found in the market. The tests were performed as described in ISO 5833. The tests ended when the cylinder broke or when it exceeded the yield limit. Mendes 23 (2006) demonstrated that all the brands considered in the study were in accordance with the standard, as they presented a compressive strength higher than 80 MPa while the standard requires a minimum value of 70 MPa.

The specimens analyzed in freeze-drying studies are varied, without standardization. In cubic samples, the length varies between 88 and 100 mm, width between 8 and 30 mm, and thicknesses between 2 and 15 mm. 2 5 21 24 Cylindrical samples vary less and are between 8 and 10 mm. 25 26 Based on these studies, we chose different sample sizes to guide the real significance, since this characteristic may influence the outcome of the procedure. Finally, these samples were discarded, since no significant difference was observed in the compression and flexion tests.

To generate a completely dry sample without wasting time, we studied the change in mass every 24 hours of the process and concluded that 120 hours are a satisfactory time. As a final step before the use of the grafts, sterilization is necessary to inhibit any type of antigenicity that may cause damage to patients. 27 One of the first sterilization techniques used ethylene oxide as a substrate. However, over time, its use was substituted due to its toxic effects. 28 Gamma radiation doses equal to 25 kGy have shown to be promising for sterilization of bone bacteria, with no resistance loss; 2 18 27 29 however, there are cases in which the permanence of prions (infectious protein particles) and of the HIV virus could only be eliminated with higher doses of radiation. 27 Loss of mechanical resistance is observed when higher doses of gamma radiation are used. 30 31 The autoclave process, which stipulates the use of temperatures higher than 120°C to exterminate infection risks to the recipient, can be used as an option for sterilization. 2 14 21 26 27 In contrast, this process significantly reduces the mechanical resistance of the bone graft. 14 There is still no consensus on the best method to sterilize lyophilized bones. 25

Additionally, the ethylene oxide sterilization process is normally performed with temperatures in the range of 40°C to 60°C, relative humidity with an optimum point between 40% and 80%, and a gas concentration usually above 400mg/L (optimal point of efficiency) with an average cycle duration from 3 to more than 10 hours. 30 This method was used due to the low temperature in the sterilization process, in which the deformation of the used inputs does not occur.

Comparing previous studies with ours, it was possible to verify that there was no statistically significant difference in flexural strength between specimens from the control and ethylene oxide-sterilized groups ( p  = 0.0764), control and autoclave-sterilized ( p  = 0 . 5816), ethylene oxide and autoclave sterilized ( p  = 0 . 4182), ethylene oxide and gamma ray sterilized ( p  = 0 . 9954), and gamma ray and autoclave sterilized groups ( p  = 0.3230). However, there was a statistically significant difference in maximum flexion of the specimens sterilized via gamma rays when compared with the control group ( p  = 0.0245). Although there was no significant difference in the control group, ethylene oxide caused loss of resistance of the material. Therefore, autoclaving seems to be a better option for sterilization of the studied biomaterial, as it did not result in significant losses of resistance either to compression or flexion.

Conclusion

The present study evaluated the influence of the sterilization processes (autoclave, ethylene oxide, and gamma rays) on biocomponents containing hydroxyapatite and chitosan in the proportion of 50% weight. The different processes of sterilization evaluated can cause different losses of resistance compared with the non-sterilized biomaterial. The autoclave sterilization process did not result in significant loss of resistance to compression and flexion, proving to be a good option for the sterilization of the hydroxyapatite-based biocomponents studied here.

Funding Statement

Suporte Financeiro Não houve suporte financeiro de fontes públicas, comerciais ou sem fins lucrativos.

Financial Support There was no financial support from public, commercial, or non-profit sources.

Conflito de Interesses Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Trabalho desenvolvido no Hospital São Vicente de Paulo (HSVP) e Universidade de Passo Fundo (UPF), RS, Brasil.

Trabalho desenvolvido no Hospital São Vicente de Paulo (HSVP) e Universidade de Passo Fundo (UPF), RS, Brasil.

Referências

  • 1.Galia C R, Macedo C A, Rosito R, Mello T M, Camargo L M, Moreira L F. In vitro and in vivo evaluation of lyophilized bovine bone biocompatibility. Clinics (São Paulo) 2008;63(06):801–806. doi: 10.1590/S1807-59322008000600016. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 2.Owusu-Dompreh F.Aplicação de tecnologias de manufatura rápida ao desenvolvimento integrado de produtos em clínicas e indústrias de manufatura médica [dissertação] Ohio: Youngstown State University; 2013. Disponível em:http://rave.ohiolink.edu/etdc/view?acc_num=ysu1389697786 [Google Scholar]
  • 3.Teixeira E R. São Paulo: Artes Médicas; 2001. Superfícies dos implantes: o estágio atual; pp. 63–80. [Google Scholar]
  • 4.Fook A CB, Aparecida A H, Fook M VL. Desenvolvimento de biocerâmicas porosas de hidroxiapatita para utilização comoscaffolds para regeneração óssea. Rev Matéria. 2010;15(03):392–399. [Google Scholar]
  • 5.Ono I, Tateshita T, Nakajima T. Evaluation of a high density polyethylene fixing system for hydroxyapatite ceramic implants. Biomaterials. 2000;21(02):143–151. doi: 10.1016/s0142-9612(99)00141-6. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 6.Pretorius J A, Melsen B, Nel J C, Germishuys P J. A histomorphometric evaluation of factors influencing the healing of bony defects surrounding implants. Int J Oral Maxillofac Implants. 2005;20(03):387–398. [PubMed] [Google Scholar]
  • 7.Vital C C, Borges A PB, Fonseca C C et al. Biocompatibilidade e comportamento de compósitos de hidroxiapatita em falha óssea na ulna de coelhos. Arq Bras Med Vet Zootec. 2006;58(02):175–183. [Google Scholar]
  • 8.Rezende C MF, Borges A PB, Bernis W O, Melo E G, Nobrega Neto P I. Aspectos clínicos cirúrgicos e radiográficos da hidroxiapatita sintética na diáfise proximal da tíbia de cães. Arq Bras Med Vet Zootec. 1998;50(05):537–545. [Google Scholar]
  • 9.Kong L, Yuan G, Lu G, Gong Y, Zhao N, Zhang X. A study on the bioactivity of chitosan/nano-hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering. Eur Polym J. 2006;42(12):3171–3179. [Google Scholar]
  • 10.Costa Silva H SR, Santos K SCR, Ferreira E I. Quitosana: derivados hidrossolúveis, aplicações farmacêuticas e avanços. Quim Nova. 2006;29(04):776–785. [Google Scholar]
  • 11.Enescu D, Olteanu C E. Chitosan funcionalizado e a sua utilização na investigação farmacêutica, biomédica e biotecnológica. Chem Eng Commun. 2008;195(10):1269–1291. [Google Scholar]
  • 12.Cheung C. The future of bone healing. Clin Podiatr Med Surg. 2005;22(04):631–641. doi: 10.1016/j.cpm.2005.07.002. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 13.Somfai T, Noguchi J, Kaneko H et al. Production of good-quality porcine blastocysts by in vitro fertilization of follicular oocytes vitrified at the germinal vesicle stage. Theriogenology. 2010;73(02):147–156. doi: 10.1016/j.theriogenology.2009.08.008. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 14.Danilchenko S N, Maksym P V, Kalinkevich O V, Kalinkevich A N. Chitosan–hydroxyapatite composite biomaterials made by a one step co-precipitation method: preparation, characterization and in vivo tests. J Biol Phys Chem. 2009;9(03):119–126. [Google Scholar]
  • 15.Fontes E B. Santa Maria, RS: Medicina Veterinária, Universidade Federal de Santa Maria; 2009. Hidroxiapatita sintética associada ou não à fração total de células mononucleares na regeneração de osso alveolar de cães [dissertação] [Google Scholar]
  • 16.Rolim A E, Carvalho F, Costa R, Rosa F P. Chitosan Scaffolds - Physico -Chemical and Biological Properties for Bone Repair. Rev Virtual Quim. 2018;10(02):211–228. [Google Scholar]
  • 17.Rosito R. Porto Alegre: Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Faculdade de Medicina; 2006. Reconstrução acebular com enxerto ósseo liofilizado humano ou bovino associado a dispositivo de reforço [dissertação] [Google Scholar]
  • 18.Fosse L, Rønningen H, Benum P, Lydersen S, Sandven R B. Factors affecting stiffness properties in impacted morsellized bone used in revision hip surgery: an experimental in vitro study. J Biomed Mater Res A. 2006;78(02):423–431. doi: 10.1002/jbm.a.30854. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 19.Iturria M, Rodriguez-Emmenegger C, Viegas R et al. Basic design of lyophilization protocols for human bone tissues. Lat Am Appl Res. 2010;40(02):147–151. [Google Scholar]
  • 20.Orsi V V, Collares M VM, Nardi N B et al. Osso liofilizado bovino não-desmineralizado com células-tronco mesenquimais para engenharia tecidual: estudo experimental em sítio heterotópico. Rev Soc Bras Cir Craniomaxilofac. 2007;10(04):133–139. [Google Scholar]
  • 21.Galia C R. Porto Alegre: Universidade Federal do Rio Grande do Sul; 2004. Enxertos ósseos liofilizados impactados humano e bovino em revisão de artroplastia total de quadril [dissertação] [Google Scholar]
  • 22.Kakiuchi M, Ono K, Nishimura A, Shiokawa H. Preparation of bank bone using defatting, freeze-drying and sterilisation with ethylene oxide gas. Part 1. Experimental evaluation of its efficacy and safety. Int Orthop. 1996;20(03):142–146. doi: 10.1007/s002640050051. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 23.Mendes R. Rio de Janeiro: Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro; 2006. Estudo experimental comparativo dos cimentos ósseos nacionais [dissertação] [Google Scholar]
  • 24.Oliveira A CP. Porto Alegre: Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Faculdade de Medicina; 2007. Comparação entre enxertos ósseos autólogo, homólogo congelado e homólogo liofilizado em cranioplastia de ratos [dissertação] [Google Scholar]
  • 25.Nather A, Thambyah A, Goh J C. Biomechanical strength of deep-frozen versus lyophilized large cortical allografts. Clin Biomech (Bristol, Avon) 2004;19(05):526–533. doi: 10.1016/j.clinbiomech.2004.01.010. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 26.Fideler B M, Vangsness C T, Jr, Lu B, Orlando C, Moore T. Gamma irradiation: effects on biomechanical properties of human bone-patellar tendon-bone allografts. Am J Sports Med. 1995;23(05):643–646. doi: 10.1177/036354659502300521. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 27.Nguyen H, Morgan D A, Forwood M R. Sterilization of allograft bone: effects of gamma irradiation on allograft biology and biomechanics. Cell Tissue Bank. 2007;8(02):93–105. doi: 10.1007/s10561-006-9020-1. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 28.Mikhael M M, Huddleston P M, Zobitz M E, Chen Q, Zhao K D, An K N. Mechanical strength of bone allografts subjected to chemical sterilization and other terminal processing methods. J Biomech. 2008;41(13):2816–2820. doi: 10.1016/j.jbiomech.2008.07.012. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 29.Viceconti M, Toni A, Brizio L, Rubbini L, Borrelli A. The effect of autoclaving on the mechanical properties of bank bovine bone. Chir Organi Mov. 1996;81(01):63–68. [PubMed] [Google Scholar]
  • 30.Taylor D. Inactivation of the BSE agent. C R Biol. 2002;325(01):75–76. doi: 10.1016/s1631-0691(02)01386-0. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 31.Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) Resolução RDC n. 156, de 11 de agosto de 2016Dispõe sobre o registro, rotulagem e reprocessamento de produtos médicos, e dá outras providências. Disponível em:https://www.saude.mg.gov.br/index.php?option=com_gmg&controller=document&id=896
Rev Bras Ortop (Sao Paulo). 2022 Jul 22;57(6):1051–1059. [Article in Portuguese]

Biocomponentes à base de hidroxiapatita: Influência da esterilização na resistência mecânica

Resumo

Objetivo  O objetivo deste estudo foi avaliar a influência da esterilização na resistência mecânica à compressão e flexão de biocomponentes à base de hidroxiapatita obtida a partir de osso bovino liofilizado e sua associação com quitosana.

Métodos  O osso bovino liofilizado foi processado em partículas de 100 μm e misturado à quitosana em proporção de 50% de seu peso. A mistura foi acondicionada em moldes metálicos para preparo dos espécimes e esterilizada a 127°C em autoclave para posterior experimentação. Os espécimes foram submetidos a ensaios de compressão e flexão seguindo a norma 5833 da International Organization for Standardization (ISO); os espécimes eram blocos cilíndricos de 6 × 12 mm (para ensaios de compressão) e placas de 75 × 10 × 3,3 mm (para ensaios de flexão). As amostras foram divididas em quatro grupos de 20 espécimes cada, sendo 10 para ensaios de compressão e 10 para ensaios de flexão. Três grupos foram esterilizados (por autoclavagem, raios gama e óxido de etileno), enquanto o quarto grupo (controle) não foi. Os testes mecânicos obtidos nos diferentes processos de esterilização foram comparados por análise de variância (ANOVA, p  < 0,05) seguido pelo teste de comparação múltipla de médias de Tukey, com intervalo de confiança de 95%.

Resultados  Os espécimes apresentaram resistências médias à compressão de 10,25 MPa para o grupo de controle e 3,67 MPa, 9,65 MPa e 9,16 MPa após esterilização com óxido de etileno, raios gama e autoclavagem, respectivamente. Os resultados do teste de flexão mostraram uma resistência média de 0,40 MPa no grupo de controle, e 0,15 MPa, 0,17 MPa e 0,30 MPa após esterilização com óxido de etileno, raios gama e autoclavagem, respectivamente. A compressão máxima observada no grupo esterilizado com óxido de etileno foi estatisticamente diferente à obtida no grupo de controle ( p  = 0,0002), esterilizado com raios gama ( p  = 0,0003) e autoclavado ( p  = 0,0006). A flexão máxima dos espécimes esterilizados com raios gama foi estatisticamente diferente à observada no grupo de controle ( p  = 0,0245). No entanto, a resistência à flexão foi baixa em todos os espécimes.

Conclusão  A esterilização em autoclave não foi associada a diferenças estatisticamente significativas nos testes de compressão ou flexão. Assim, a autoclave foi a melhor opção de esterilização para os biocomponentes à base de hidroxiapatita neste estudo.

Palavras-chave: materiais biocompatíveis, quitosana, transplante ósseo, hidroxiapatita, testes mecânicos

Introdução

Os avanços na área da saúde, aliados à engenharia e outros ramos da ciência, motivados principalmente pelo aumento da expectativa e qualidade de vida, possibilitaram o desenvolvimento de técnicas que buscam restabelecer as funções totais ou parciais de órgãos ou tecidos de indivíduos que sofreram algum tipo de mutilação ou foram acometidas por alguma doença. 1

O envelhecimento faz com que as articulações e os ossos se tornem frágeis, causando dor e restringindo certos movimentos. Assim, implantes ortopédicos, odontológicos e veterinários têm sido aplicados com maior frequência e muitos estudos são realizados para obtenção de equipamentos e, neste caso, materiais de implante como ossos que atendam às novas necessidades médicas. 2

Os biomateriais são mais relevantes em dispositivos implantados de forma temporária ou permanente no corpo humano. Estes biomateriais melhoram o processo de reparação óssea nas áreas odontológica, ortopédica e veterinária, principalmente em fraturas e afecções ósseas, como pequeno defeito ósseo em casos de alongamento ou encurtamento de membros, osteotomias corretivas de adição ou subtração, próteses dentárias e ortopédicas, defeitos ósseos tumorais e pseudoartrose.

Esses materiais diferem dos demais por apresentarem uma combinação de propriedades mecânicas, químicas, físicas e biológicas que viabilizam sua utilização no corpo humano. 2 Dentre os diversos materiais constantemente testados e avaliados em laboratório, estão a hidroxiapatita – com comprovada função osteocondutora – e a quitosana, um biopolímero que pode estimular a liberação de citocinas celulares indutoras. A combinação desses biomateriais consolida suas vantagens em um único composto que acelera o processo de regeneração óssea, em especial nos casos de fraturas com união óssea de má qualidade ou tardia. 3

A hidroxiapatita é uma das cerâmicas mais biocompatíveis devido à sua constituição mineral similar à de ossos e dentes humanos. 4 Tem diversas vantagens, como composição uniforme, alta biocompatibilidade, segurança – não sendo tóxica, alergênica ou cancerígena – e microestrutura completamente controlável (tamanho dos poros). 5 Por isso, tem sido analisada como possível material substituto em implantes ósseos e dentários. 6 Alguns estudos utilizaram a hidroxiapatita com diferentes proporções de cálcio e fósforo para verificar sua função na regeneração óssea com base em sua propriedade osteocondutora. 7 8

Kong et al. 9 realizaram um estudo in vitro para investigação da bioatividade da quitosana/hidroxiapatita e observaram que o composto apresentou melhor bioatividade do que a quitosana sozinha. A quitosana é obtida a partir da quitina, um polissacarídeo encontrado em abundância na natureza, principalmente em crustáceos, insetos e fungos. A quitosana é derivada da quitina por um processo de desacetilação química ou enzimática. 10 As propriedades antimicrobianas e antioxidantes da quitosana levaram a inúmeras aplicações em diferentes campos, inclusive indústria alimentícia, produtos cosméticos e de cuidados pessoais, tratamento de efluentes, produtos farmacológicos e materiais implantáveis. 11 12

Neste estudo foi determinado que não é possível utilizar esses biomateriais, a hidroxiapatita e a quitosana, no corpo humano sem passar pelo processo de esterilização, que fragiliza a estrutura mecânica e altera a resistência desses componentes. Por isso, este estudo visa determinar o melhor método de esterilização que permita a utilização desses materiais sem alteração de suas características e perda de resistência. Portanto, são levantadas hipóteses sobre o melhor método de esterilização. Os métodos de esterilização podem ser divididos em físicos (calor, filtração e radiação) e químicos (compostos fenólicos, clorexidina, halógenos, álcoois, peróxidos, óxido de etileno, formaldeído, glutaraldeído e ácido peracético).

Este estudo, portanto, tem como objetivo analisar o efeito da esterilização na resistência mecânica do osso bovino liofilizado (hidroxiapatita) que foi processado e misturado à quitosana em proporção de 50% em peso. Os espécimes dos diferentes grupos foram submetidos a ensaios de compressão e flexão de acordo com a norma 5833 da International Organization for Standardization (ISO).

Materiais e Métodos

Para este estudo, 10 fêmures bovinos foram obtidos de animais entre 2 e 3 anos de idade provenientes de frigoríficos da Região Sul do Brasil. Um fluxograma dos processos químico e mecânico do estudo foi elaborado para facilitar a execução ( Fig. 1 ).

Fig. 1.

Fig. 1

Open in a new tab

Fluxograma dos processos químicos e mecânicos do estudo experimental.

A princípio, a porção muscular dos ossos foi removida e, em seguida, limpa e desengordurada com peróxido de hidrogênio e solução salina. As lâminas ósseas foram preparadas com serra de fita, submetidas ao ultracongelamento (-70°C) e liofilizadas em equipamento Terroni LS3000 (Terroni Elec., São Carlos, SP, Brasil) ( Fig. 2 ). A liofilização foi realizada por um período de 5 dias para remoção de toda a umidade do osso por sublimação. Depois da liofilização, os ossos foram cortados em blocos, triturados e moídos em equipamento SPLabor (SPLabor. Presidente Prudente, SP, Brazil) modelo 16 com rotação média de 50 RPM utilizando 30 esferas de 8 mm de diâmetro e 80 esferas de 15 mm de diâmetro ( Fig. 3 ). A moagem foi realizada por 6 a 12 horas até atingir a granulometria máxima de 100 µm segundo o equipamento Mastersizer 3000 (Malvern Panalytical. Malvern, Reino Unido) ( Fig. 4 ).

Fig. 2.

Fig. 2

Open in a new tab

Liofilizador Terroni modelo LS 3000.

Fig. 3.

Fig. 3

Open in a new tab

Moinho periquito SPLabor modelo 16.

Fig. 4.

Fig. 4

Open in a new tab

Mastersizer 3000.

Para a mistura, os materiais foram primeiramente pesados em uma balança analítica Shimadzu, modelo AY220. A quitosana foi adicionada ao osso bovino liofilizado em proporção de 50% em peso em um misturador industrial Marconi (Marconi Ltda. Piracicaba, SP, Brasil) por um período de 3 minutos. Para fazer a liga, 3,5 mL de água destilada foram adicionados a cada 10 g de pó. Após a homogeneização, o composto foi inserido em moldes metálicos para confecção dos espécimes. A fabricação e padronização dos moldes obedeceu à norma ISO 5833. Os moldes foram preenchidos com a mistura óssea depois da aplicação do desmoldante WD-40 (Theron Marketing Ltda. Curitiba, PA, Brasil) nos orifícios para facilitar a posterior remoção dos componentes. Moldes metálicos com dimensões de 6 × 12 mm (teste de compressão) e 75 × 10 × 3,3 mm (teste de flexão) foram utilizados ( Fig. 5A e 5B ). Placas de aço 316L foram usadas nas extremidades inferior e superior dos moldes para facilitar a extração da amostra. Um paquímetro foi usado para assegurar a padronização dos espécimes.

Fig. 5.

Fig. 5

Open in a new tab

(A) Matriz de compressão. (B) Matriz de flexão.

Os moldes ficaram imóveis por 7 dias e a remoção foi auxiliada por uma ferramenta extrusora formada pelo cabo de um espelho bucal odontológico (tamanho n° 5). Em seguida, as amostras foram armazenadas ao abrigo da umidade e da luz, em temperatura média de 23°C, para evitar interferência até a aplicação das cargas mecânicas.

Após o processo de calibração, os espécimes foram esterilizados em quatro grupos de 20 unidades cada por meio de autoclave no primeiro grupo, raios gama no segundo e óxido de etileno no terceiro grupo.

Os resultados dos testes mecânicos obtidos após os diferentes processos de esterilização foram comparados por meio da análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de comparação múltipla de médias de Tukey, com intervalo de confiança de 95%. A análise estatística foi realizada com o software Statistica (Statsoft Inc., Tulsa, OK, EUA) versão 7.0. O valor de p  < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Autoclave

A esterilização em autoclave foi realizada no Centro de Esterilização do Hospital São Vicente de Paulo, em Passo Fundo, RS, Brasil. O material foi esterilizado à temperatura de ebulição da água, de 121°C, por 15 minutos.

Uma autoclave Industrial STERIS de 300 L, modelo SV 3043, (Future Health Concepts Inc. Sanford, FL, EUA) foi utilizada seguindo todos os protocolos exigidos pelas Normas Brasileiras de Vigilância Sanitária.

Raios Gama

Os espécimes foram enviados à Companhia Brasileira de Esterilização (EMBRARAD, Cotia, SP, Brasil) para aplicação de raios gama utilizando um Acelerador Linear de Cobalto 60 (Nordion Inc. Ottawa, ON, Canada), modelos JS 7500 e JS 9600.

Todos os controles e a documentação do processo foram realizados como previsto na norma ISO 9001. O processo foi realizado em três tempos de ciclo de 2'18” com o modelo JS 9600 e dois tempos de ciclo de 7'45” com o modelo JS 7500.

Óxido de Etileno

O método de esterilização com gás de óxido de etileno foi realizado em autoclave Baumer (Baumer, São Paulo, SP, Brazil) com capacidade de 700 L por 3 a 4 horas de exposição.

O gás de óxido de etileno é injetado na câmara assim que atinge os níveis de pressão e temperatura ajustados ao tempo de exposição. Após a exposição ao óxido de etileno, o material passa por uma fase de processamento a vácuo com sequência de injeção de nitrogênio para remoção completa do gás e redução do risco de intoxicação

Testes Mecânicos

Os testes foram realizados em equipamento SCHENK (Hangzhou Jizhi Mechatronic Ltd. Hangzhou, China) do Laboratório de Engenharia Mecânica da Universidade de Passo Fundo, na Região Sul do Brasil.

Das 80 amostras, 40 unidades foram submetidas ao teste de flexão e 40 ao teste de compressão. As amostras foram divididas em 60 unidades que passaram pelos processos de esterilização, sendo 20 por autoclavagem, 20 com raios gama e 20 com óxido de etileno, enquanto as outras 20 amostras controles não foram esterilizadas. Os testes foram realizados de acordo com ISO 5833 ( Fig. 6A ).

Fig. 6.

Fig. 6

Open in a new tab

(A) Teste de compressão. (B) Teste de flexão.

Teste de Compressão

De acordo com ISO 5833, as amostras para ensaio de compressão devem ser feitas em matrizes cilíndricas com 6 mm de diâmetro e 12 mm de comprimento. Neste estudo, a velocidade de aplicação da força compressiva foi constante, entre 19,8 e 25,6 mm/min.

Teste de Flexão

O ensaio de flexão segue a norma ISO 5833, que propõe uma resistência mínima à flexão de 1.800 MPa e módulo de flexão superior a partir de 50 MPa. A norma também sugere o registro dos valores de flexão em carga igual a 15 N (inicial) e 50 N ( Fig. 6B ), além da força de ruptura do espécime.

Resultados

Todos os testes de compressão e flexão utilizaram cargas suprafisiológicas para fratura dos espécimes.

Nos testes de compressão, não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos de controle e esterilizado por raios gama ( p  = 0,9634), controle e esterilizado por autoclave ( p  = 0,8170) e esterilizado por raios gama e autoclave ( p  = 0,9784). No entanto, houve diferenças estatisticamente significativas na compressão máxima do grupo esterilizado com óxido de etileno em comparação ao grupo de controle ( p  = 0,0002), esterilizado por raios gama ( p  = 0,0003) e autoclave ( p  = 0,0006). Esses resultados indicam que há perda de resistência à compressão quando as amostras de biomateriais são esterilizadas com óxido de etileno. Assim, o óxido de etileno não é uma boa alternativa para a esterilização do composto estudado.

Considerando a resistência à flexão, não houve diferença estatisticamente significativa entre os espécimes dos grupos de controle e esterilizados com óxido de etileno ( p  = 0,0764), controle e esterilizados em autoclave ( p  = 0,5816), esterilizados com óxido de etileno e autoclave ( p  = 0,4182), esterilizados com óxido de etileno e raios gama ( p  = 0,9954) e dos grupos esterilizados com raios gama e autoclave ( p  = 0,3230). No entanto, houve diferença estatisticamente significativa na flexão máxima dos espécimes esterilizados por raios gama em comparação ao grupo de controle ( p  = 0,0245). Portanto, houve perda significativa de resistência à flexão quando comparando os espécimes que foram esterilizados com raios gama e aqueles do grupo de controle.

Embora não tenham sido observadas diferenças estatisticamente significativas no grupo de controle quanto à resistência à flexão, o óxido de etileno causou uma importante perda de resistência do material. No entanto, baixas resistências à flexão foram observadas em todos os espécimes. Além disso, o grupo esterilizado em autoclave não apresentou diferenças estatisticamente significativas nos testes de compressão ou flexão. ( Tabela 1 , Figs. 7 e 8 ).

Tabela 1. Valores médios de resistência de espécimes esterilizados por diferentes processos.

Processo de esterilização Compressão máxima (MPa) – Valor médio (±DP) Flexão máxima (MPa) – Valor médio (±DP)
Controle 10,25 (±3,14) a 0,40 (±0,24) a
Óxido de etileno 3,67 (±0,88) b 0,15 (±0,06) a, b
Raios gama 9,65 (±3,58) a 0,17 (±0,07) b
Autoclave 9,16 (±2,67) a 0,30 (±0,17) a, b
Open in a new tab

Siglas: DP, desvio padrão. Notas: a, b Letras iguais na mesma coluna indicam valores pertencentes a um mesmo grupo homogêneo, sem diferença estatisticamente significante entre seus componentes segundo o teste de Tukey com intervalo de confiança de 95%.

Fig. 7.

Fig. 7

Open in a new tab

Tensão média à compressão nos diferentes grupos.

Fig. 8.

Fig. 8

Open in a new tab

Tensão média à flexão nos diferentes grupos.

Discussão

Somfai et al. 13 (2010) mencionaram que é interessante utilizar um composto de hidroxiapatita e quitosana, combinando a característica osteocondutora da primeira com a biodegradabilidade e resistência mecânica da segunda. Esses autores relataram que não foi observada degradação completa dos biomateriais após 60 dias, neste caso, em cães. No entanto, Danilchenko et al. 14 (2009) relataram que o mesmo composto, implantado na tíbia de ratos, apresentou boas propriedades osteocondutoras e que sua biodegradação foi praticamente completa, sugerindo que a substituição total do implante de hidroxiapatita/quitosana pelo tecido ósseo recém-formado dentro da falha óssea ocorre até o 24° dia após o implante. Esta diferença é provavelmente decorrente da diferença entre as espécies (a taxa metabólica de ratos é maior do que de cães). Fontes 15 (2009) em um estudo com hidroxiapatita para avaliação da regeneração óssea alveolar em cães, verificou que o biomaterial ainda estava presente aos 60 dias. O autor concluiu que mais estudos são necessários para análise do tempo de biodegradação deste composto.

Segundo Rolim et al. 16 (2018), a resposta biológica é mais favorável quando a quitosana é associada a outros biomateriais. Portanto, é importante continuar as pesquisas científicas com o uso desses biopolímeros naturais, para entender melhor seu papel no comportamento celular e aprimorar metodologias de fabricação que possam ampliar seu uso clínico na regeneração óssea. Com as investigações científicas em curso em todas as áreas relevantes do conhecimento e em biomateriais, espera-se que muitas alterações ósseas – como perda óssea por traumatismo, ressecção óssea por tumores, envelhecimento ósseo e alterações esqueléticas, metabólicas ou genéticas – sejam tratadas por novos protocolos de regeneração óssea.

Como relata Rosito 17 (2006), o processo de liofilização pode causar danos às propriedades do osso, em especial a resistência. No entanto, outros estudos com enxertos ósseos humanos e bovinos liofilizados e congelados na reconstrução do acetábulo de pacientes encontraram similaridades nas propriedades de resistência desses enxertos. Os testes de compressão podem avaliar a resistência do osso liofilizado e observar a ausência de alteração das propriedades mecânicas. 17 Outro estudo sobre ossos liofilizados mostrou um enfraquecimento dos enxertos após os testes. 18 A resistência ao torque também foi aplicada a ossos liofilizados, mostrando uma perda alarmante de 88% da resistência original. 19 Por outro lado, houve relatos de que menor umidade aumenta a resistência mecânica do osso. 20 Além disso, o osso humano liofilizado apresenta maior resistência mecânica à compressão do que o osso fresco.

Embora o aspecto biológico não seja o foco deste estudo, nota-se que Galia 21 (2004) e Kakiuchi et al. 22 (1996) analisaram biópsias realizadas em revisões de próteses de quadril e joelho e observaram sinais de integração do enxerto de hidroxiapatita, caracterizada pela presença de trabéculas ósseas necróticas envoltas por tecido ósseo recém-formado, medula hematopoiética e células adiposas.

Mendes 23 (2006) usou moldes metálicos contendo 48 orifícios cilíndricos com dimensões de 6 × 12 mm para preparar espécimes de cimento ósseo. O autor utilizou uma prensa de teste mecânica universal que foi fixada a uma célula de carga de 49.050 N (5.000 kgf) a uma velocidade de 20 mm/min. Este estudo foi feito com cinco amostras de cinco marcas de cimento ósseo encontradas no mercado. Os testes foram realizados como descrito em ISO 5833. Os testes terminaram quando o cilindro quebrou ou o limite de escoamento foi ultrapassado. Mendes 23 (2006) demonstrou que todas as marcas analisadas estavam de acordo com a norma, pois apresentavam resistência à compressão superior a 80 MPa, enquanto o valor mínimo exigido é de 70 MPa.

Diversos espécimes são analisados nos estudos de liofilização e não há padronização. Em amostras cúbicas, o comprimento varia entre 88 e 100 mm, com largura de 8 a 30 mm e espessuras de 2 a 15 mm. 2 5 21 24 As amostras cilíndricas variam menos e têm entre 10 e 8 mm. 25 26 Com base nesses estudos, escolhemos diferentes tamanhos de amostra para orientar o real significado, já que essa característica pode influenciar o resultado do procedimento. Por fim, essas amostras foram descartadas devido à ausência de diferença significativa nos testes de compressão e flexão.

Para gerar uma amostra completamente seca sem perda de tempo, estudamos a mudança da massa a cada 24 horas do processo e concluímos que o período de 120 horas era satisfatório. Como etapa final antes do uso dos enxertos, a esterilização é necessária para inibir qualquer tipo de antigenicidade que possa prejudicar os pacientes. 27 Uma das primeiras técnicas de esterilização utilizou óxido de etileno como substrato. No entanto, com o tempo, essa técnica deixou de ser empregada por conta de seus efeitos tóxicos. 28 Doses de radiação gama iguais a 25 kGy têm se mostrado promissoras para esterilização de bactérias ósseas, sem prejuízo à resistência; 2 18 27 29 no entanto, há relatos de casos nos quais a persistência de príons (partículas de proteínas infecciosas) e do vírus da imunodeficiência humana (HIV) só podiam ser eliminados com doses maiores de radiação. 27 A perda de resistência mecânica é observada com doses mais altas de radiação gama. 30 31 O processo de autoclave, que prevê a aplicação de temperatura superior a 120°C para exterminar riscos de infecção ao receptor, pode ser utilizado como opção de esterilização. 2 14 21 26 27 Em contrapartida, esse processo reduz significativamente a resistência mecânica do enxerto ósseo. 14 Ainda não há consenso sobre o melhor método para esterilização de ossos liofilizados. 25

Além disso, o processo de esterilização por óxido de etileno é normalmente realizado com temperatura na faixa de 40°C a 60°C, umidade relativa com ponto ótimo entre 40% e 80% e concentração de gás acima de 400 mg/L (ponto ótimo de eficiência), em ciclos com duração média de 3 a mais de 10 horas. 30 Este método foi utilizado devido à baixa temperatura no processo de esterilização, em que não há deformação dos insumos.

Em comparação a estudos anteriores, foi possível verificar que não houve diferença estatisticamente significativa na resistência à flexão entre os espécimes dos grupos de controle e esterilizados com óxido de etileno ( p  = 0,0764), controle e esterilizados em autoclave ( p  = 0,5816), esterilizados com óxido de etileno e autoclavagem ( p  = 0,4182), esterilizados com óxido de etileno e raios gama ( p  = 0,9954) e grupos esterilizados com raios gama e autoclavagem ( p  = 0,3230). No entanto, houve diferença estatisticamente significativa na flexão máxima dos espécimes esterilizados por raios gama quando comparados ao grupo de controle ( p  = 0,0245). Embora não tenha havido diferença significativa em relação ao grupo de controle, o óxido de etileno causou perda de resistência do material. Portanto, a autoclavagem parece ser a melhor opção para esterilização do biomaterial em análise, pois não provocou perdas significativas de resistência tanto à compressão quanto à flexão.

Conclusão

O presente estudo avaliou a influência dos processos de esterilização (autoclave, óxido de etileno e raios gama) em biocomponentes contendo hidroxiapatita e quitosana na proporção de 50% em peso. Os diferentes processos de esterilização avaliados podem causar diferentes perdas de resistência em relação ao biomaterial não esterilizado. O processo de esterilização em autoclave não causou perda significativa de resistência à compressão e flexão, mostrando-se uma boa opção para a esterilização dos biocomponentes à base de hidroxiapatita aqui estudados.

Articles from Revista Brasileira de Ortopedia are provided here courtesy of Sociedade Brasileira de Ortopedia e Traumatologia

RESOURCES