Abstract
目的
构建负载桑黄素的碳点紫外光交联壳聚糖（ultraviolet-cross-linkable chitosan-carbon dots-morin，NMCM）水凝胶，通过体内外实验观察其能否修复软骨损伤，并探讨相关机制。
方法
取壳聚糖联合甲基丙烯酰酐制备紫外光（ultraviolet，UV）交联壳聚糖、联合丙烯酰胺制备碳点，两者混合后加入桑黄素溶液，在UV下照射交联，获得NMCM水凝胶，检测其缓释性能。取关节置换患者自愿捐赠的正常及膝关节骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）软骨组织，分离培养软骨细胞并经甲苯胺蓝染色鉴定。取第3代KOA软骨细胞，首先分别与12.5、25.0、50.0 µmol/L桑黄素及负载该浓度桑黄素的NMCM水凝胶混合培养，细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）法检测上述浓度桑黄素及水凝胶对软骨细胞增殖的影响；然后与负载50 µmol/L桑黄素的NMCM水凝胶共培养，免疫荧光染色检测Ⅱ型胶原蛋白（collagen type Ⅱ，COL-Ⅱ）水平、2，7-二氯二氢荧光素二乙酸酯探针检测活性氧水平。取4周龄SD大鼠20只，构建右后肢膝关节软骨损伤模型，随机分为两组（n=10）；其中实验组软骨缺损处注射负载25 µmol/L桑黄素的NMCM水凝胶，对照组不作处理。术后4周，取标本micro-CT观察股骨髁软骨缺损修复情况，大体观察缺损部位并行国际软骨修复协会（ICRS）大体评分，番红-O固绿染色及COL-Ⅱ免疫组织化学染色观察软骨和软骨下骨并行ICRS组织学评分，Western blot以及实时荧光定量PCR检测软骨组织中TNF-α、NF-κB、基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）、COL-Ⅱ蛋白及mRNA表达。
结果
实验成功构建负载不同浓度桑黄素的NMCM水凝胶，其短时间内药物释放速度较快，24 h后速度逐渐放缓，96 h时释放量接近于0，此时药物累积释放率达88%。浓度≤50 µmol/L的桑黄素对软骨细胞无毒性作用，且在NMCM水凝胶干预下，软骨细胞增殖能力提高（P<0.05）。NMCM水凝胶可提高KOA软骨细胞中COL-Ⅱ水平（P<0.05），降低活性氧水平（P<0.05），但尚未达正常水平（P<0.05）。动物实验显示，实验组术后4周关节面粗糙，软骨缺损可见，但其周围有组织修复，关节间隙仍保持正常；对照组关节面更粗糙，软骨缺损未见组织修复。与对照组相比，实验组软骨细胞较多，COL-Ⅱ表达增强，ICRS大体及组织学评分均较高（P<0.05）；MMP-13、NF-κB、TNF-α蛋白及mRNA相对表达量降低，COL-Ⅱ蛋白及COL-2a1 mRNA升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。
结论
NMCM水凝胶能促进大鼠膝关节软骨细胞增殖、抑制软骨细胞分解代谢，抵抗氧化应激反应，保护软骨细胞，促进软骨修复。
Keywords: 膝关节, 骨关节炎, 桑黄素, 碳点, 壳聚糖水凝胶, 大鼠
Abstract
Objective
To construct a ultraviolet-cross-linkable chitosan-carbon dots-morin (NMCM) hydrogel, observe whether it can repair cartilage injury by in vivo and in vitro experiments, and explore the related mechanism.
Methods
The chitosan was taken to prepare the ultraviolet (UV)-cross-linkable chitosan by combining methacrylic anhydride, and the carbon dots by combining acrylamide. The two solutions were mixed and added morin solution. After UV irradiation, the NMCM hydrogel was obtained, and its sustained release performance was tested. Chondrocytes were separated from normal and knee osteoarticular (KOA) cartilage tissue donated by patients with joint replacement and identified by toluidine blue staining. The 3rd generation KOA chondrocytes were co-cultured with the morin solutions with concentrations of 12.5, 25.0, 50.0 µmol/L and NMCM hydrogel loaded with morin of the same concentrations, respectively. The effects of morin and NMCM hydrogel on the proliferation of chondrocytes were detected by cell counting kit 8 (CCK-8). After co-cultured with NMCM hydrogel loaded with 50 µmol/L morin, the level of collagen type Ⅱ (COL-Ⅱ) of KOA chondrocytes was detected by immunofluorescence staining, and the level of reactive oxygen species (ROS) was detected by 2, 7-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) probe. Twenty 4-week old Sprague Dawley rats were selected to construct a articular cartilage injury of right hind limb model, and were randomly divided into two groups (n=10). The cartilage injury of the experimental group was repaired with NMCM hydrogel loaded with 25 µmol/L morin, and the control group was not treated. At 4 weeks after operation, the repair of cartilage injury was observed by micro-CT and gross observation and scored by the International Cartilage Repair Association (ICRS) general scoring. The cartilage tissue and subchondral bone tissue were observed by Safranine-O-fast green staining and COL-Ⅱ immunohistochemistry staining and scored by ICRS histological scoring. The expressions of tumor necrosis factor α (TNF-α), nuclear factor κB (NK-κB), matrix metalloproteinase 13 (MMP-13), and COL-Ⅱ were detected by Western blot and real-time fluorescence quantitative PCR.
Results
NMCM hydrogels loaded with different concentrations of morin were successfully constructed. The drug release rate was fast in a short period of time, gradually slowed down after 24 hours, and the amount of drug release was close to 0 at 96 hours. At this time, the cumulative drug release rate reached 88%. Morin with a concentration ≤50 µmol/L had no toxic effect on chondrocytes, and the proliferation of chondrocytes improved under the intervention of NMCM hydrogel (P<0.05). NMCM hydrogel loaded with morin could increase the level of COL-Ⅱ in KOA chondrocytes (P<0.05) and reduce the level of ROS (P<0.05), but it did not reach the normal level (P<0.05). Animal experiments showed that in the experimental group, the articular surface was rough and the defects were visible at 4 weeks after operation, but the surrounding tissues were repaired and the joint space remained normal; in the control group, the articular surface was rougher, and no repair tissue was found for cartilage defects. Compared with the control group, the experimental group had more chondrocytes, increased COL-Ⅱ expression, and higher ICRS gross and histological scores (P<0.05); the relative expressions of MMP-13, NF-κB, and TNF-α protein and mRNA significantly decreased (P<0.05), and the relative expressions of COL-Ⅱ protein/COL-2a1 mRNA significantly increased (P<0.05).
Conclusion
NMCM hydrogel can promote chondrocytes proliferation, down regulate chondrocyte catabolism, resist oxidative stress, protect chondrocytes from cartilage injury, and promote cartilage repair.
Keywords: Knee, osteoarthritis, morin, carbon dots, chitosan hydrogel, rat
膝关节骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种常见的慢性关节退行性疾病，主要病理改变为关节软骨损伤，而软骨组织自我修复能力较差，一旦损伤难以自愈[1-2]。目前临床治疗软骨损伤方式较多，但疗效均不理想。抑制炎症介质产生是治疗KOA的重要环节。桑黄素是一种提取自桑科植物的天然黄酮类化合物[3]，本课题组前期基于软骨细胞炎症损伤相关通路的研究提示，12.5、25.0 µmol/L桑黄素可以缓解IL-1β诱导的炎症反应，降低影响软骨降解的关键物质基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）表达，减少软骨组织中Ⅱ型胶原蛋白（collagen type Ⅱ，COL-Ⅱ）和蛋白多糖的流失，通过激活NF-κB信号通路对抗OA抑制软骨细胞外基质的降解，维持软骨细胞表型，发挥延缓关节退变的作用[4-5]。
构建一种能在软骨损伤局部持续释放药物因子，同时保持一定力学强度的缓释载体是KOA治疗的研究方向[6-7]。壳聚糖是一种天然高分子化合物，生物毒性低、易降解，在生物工程及药物递送等领域应用广泛[8-9]。利用甲基丙烯酰酐改性获得的壳聚糖水凝胶，具有副作用小、释放动力学可控以及与壳聚糖相比生物相容性更高等优势，可作为一种高效载体[10-11]。但是单纯负载药物的壳聚糖水凝胶在体内降解情况无法定量研究。
在人工合成材料研究中，碳点是一种碳源纳米粒子，主要成分为sp3/sp2比例杂化的碳原子，具有抗氧化作用，可保护细胞减少氧化应激损伤，在运载药物等方面有着良好表现[12-14]。而且将碳点荧光探针与紫外光（ultraviolet，UV）交联壳聚糖水凝胶复合后，通过荧光图像即可定量研究水凝胶在体内降解过程。本研究通过甲基丙烯酰酐对壳聚糖进行改性，引入碳点，制备负载桑黄素的碳点UV交联壳聚糖（UV-cross-linkable chitosan-carbon dots-morin，NMCM）水凝胶，探索其对大鼠关节软骨损伤的作用及其机制。
1. 材料与方法
1.1. 实验动物及主要试剂、仪器
4周龄SD大鼠20只，雌雄不限，体质量65～80 g，平均73 g，由哈尔滨医科大学附属第一医院动物实验中心提供。
桑黄素标准品、DMEM-F12培养基（大连美仑生物技术有限公司）；壳聚糖（脱乙酰度91.4%；青岛海汇生物工程有限公司）；FBS、0.25%胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶（GIBCO公司，美国）；细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8；北京北仁化学科技有限公司）；活性氧检测试剂盒（MCE公司，美国）；Bradford蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；甲基丙烯酸酐（纯度94%）、光引发剂I2959（Sigma-Aldrich公司，美国）；青-链霉素双抗（HyClone公司，美国）；cDNA逆转录试剂盒（Roche公司，瑞士）；RNA提取试剂盒（QIAGEN公司，德国）；丙烯酰胺（上海联迈生物工程有限公司）；过硫酸铵（Amresco公司，美国）。
高速离心机（Thermo公司，美国）；倒置显微镜（Nikon公司，日本）；荧光显微镜（Leica公司，德国）；恒温细胞培养箱（Binder公司，德国）；500 Fast RT-PCR仪（Applied Biosystems公司，美国）；Odyssey红外光扫描成像系统（LI-COR公司，美国）；Cytation5细胞成像微孔板检测系统（Biotek公司，美国）；Quntum GX micro-CT仪（PerkinElmer公司，美国）。
1.2. NMCM水凝胶制备及检测
1.2.1. UV交联壳聚糖制备
按照1∶100比例将甲基丙烯酰酐滴入1%（W/V）壳聚糖乙酸溶液中，60℃下持续搅拌12 h；加入NaHCO3将溶液调至中性，在去离子水下透析4 d；冷冻干燥，获得UV交联壳聚糖。
1.2.2. 碳点制备
将1 g壳聚糖和4 g丙烯酰胺加入30 mL去离子水中，随后加入22.5 mg过硫酸铵，超声下溶解；溶液转移至50 mL反应釜中，反应温度220℃，反应时间12 h；室温下冷却，以离心半径6.3 cm，10 000 r/min离心5 min；0.22 µmol/L微孔过滤器过滤；50%乙醇水溶液透析6 h，去离子水透析6 h，每隔2 h换液；以离心半径6.3 cm，10 000 r/min离心5 min，获得碳点溶液。
1.2.3. NMCM水凝胶制备
将桑黄素用PBS稀释至浓度10.0、12.5、25.0、50.0、75.0、100.0 µmol/L。将制备的UV交联壳聚糖、碳点以及光引发剂I2959（上述溶液浓度分别为2%、800 μg/mL、1.5‰），加入至不同浓度桑黄素溶液中，每100毫升桑黄素溶液中加入UV交联壳聚糖2 g、碳点10 mL、光引发剂I2959 150 μg；震荡搅拌1 h；在强度10 mW/cm2 UV下照射30 s，形成水凝胶。见图1。
图 1.
Preparation of NMCM hydrogel
NMCM水凝胶制备
a. UV照射下交联；b. 交联后样品
a. Crosslinking under UV irradiation; b. The cross-linked hydrogel sample
1.2.4. NMCM水凝胶缓释性能检测
首先测定桑黄素标准曲线。使用酶标仪于波长390 nm处测量上一步骤中制备的各浓度桑黄素溶液吸光度（A）值，绘制桑黄素标准曲线图，拟合标准曲线方程为y=0.005 04x+0.047 6。
然后，取负载100.0 µmol/L桑黄素的NMCM水凝胶5 mg，置于50 mL离心管中，加入40 mL PBS；于恒温水浴摇床进行缓释测试，温度设定为37℃、震荡速度15 r/min。于震荡后1、2、3、4、5、6、12、24、48、72、96 h，从管中各取出1 mL溶液，同时补充相同体积PBS。采用酶标仪测量各时间点溶液A值，利用桑黄素标准曲线方程计算桑黄素浓度，绘制累积释放曲线。实验重复3次。
1.3. 体外细胞实验
1.3.1. 软骨细胞分离、培养及鉴定
① 软骨细胞分离及培养：软骨组织均由2021年1月—6月于我院行关节置换患者自愿捐赠，包括20例因KOA手术者（KOA软骨组织）以及20例因股骨颈头下型骨折手术者（正常软骨组织）。于超净工作台切取关节软骨组织，置于含1%青-链霉素双抗的DMEM-F12培养基保存。实验前将软骨组织切成体积为2～3 mm3的碎块，冲洗干净后置于培养瓶中；加入0.25%胰蛋白酶5 mL，于恒温培养箱中消化30 min，吸弃胰蛋白酶；加入5 mL配置的0.2%Ⅱ型胶原酶/DMEM-F12培养基，于37℃、5%CO2条件下消化12 h；经孔径为100 µm的滤网过滤；以离心半径12 cm、1 500 r/min离心5 min；将离心管底部沉淀用含10%FBS的DMEM-F12重悬，反复吹打均匀后置于培养瓶中，于37℃、5%CO2条件下培养。每日倒置显微镜下观察细胞形态并隔天换液。待细胞贴壁达80%～90%时进行传代。取处于对数增长期的第3代细胞进行后续实验。
② 软骨细胞鉴定：将KOA软骨细胞接种至6孔板，每孔1×105个，于37℃、5%CO2条件下培养8 h后，倒置显微镜下观察细胞形态；待细胞贴壁后换液，此后隔天换液，继续培养至孔内80%细胞贴壁后进行甲苯胺蓝染色。
弃原培养基，PBS洗涤1 min×3次，注意轻柔操作避免细胞脱落；加入4%多聚甲醛，室温下固定10 min；弃多聚甲醛，加入甲苯胺蓝染色液，每孔2 mL；室温下染色5 min；每孔加入2 mL蒸馏水，轻柔振荡培养板，混合均匀后继续染色15 min；吸弃全部染色液，加蒸馏水清洗30 s×2次。每孔加入3 mL蒸馏水以完全浸没孔底，倒置显微镜下观察细胞形态。
1.3.2. 桑黄素细胞毒性检测
采用CCK-8法检测桑黄素细胞毒性。取KOA软骨细胞，采用DMEM-F12培养基制成细胞悬液，接种至96孔板，每孔1×104个细胞。于37℃、5%CO2条件下采用DMEM-F12培养基培养，待软骨细胞完全贴壁后，吸弃培养基并分为4组，包括对照组以及12.5、25.0、50.0 µmol/L桑黄素组，每组3个复孔。其中，对照组加入无血清DMEM-F12培养基，其余组分别加入含对应浓度桑黄素的无血清DMEM-F12培养基。继续培养24 h后吸弃上清，避光条件下加入CCK-8溶液，每孔100 μL，孵育4 h；于酶标仪波长450 nm处检测各孔A值。
1.3.3. NMCM水凝胶对软骨细胞增殖影响检测
取KOA软骨细胞同上法制成细胞悬液并接种至96孔板，每孔5×103个细胞；将其分为4组，分别为对照组以及负载12.5、25.0、50.0 µmol/L桑黄素的NMCM水凝胶组，每组3个复孔。其中，对照组加入含10%FBS的DMEM-F12培养基，其余组在此基础上加入负载对应浓度桑黄素的NMCM水凝胶50 μg。于37℃、5%CO2条件下培养24、48、72、96 h后行CCK-8法检测。
1.3.4. COL-Ⅱ免疫荧光染色观察
实验分为3组，正常软骨细胞组、KOA软骨细胞组、KOA软骨细胞+负载50 µmol/L桑黄素的NMCM水凝胶组（KOA软骨细胞+水凝胶组），每组3个复孔。取正常及KOA软骨细胞，同上法制成细胞悬液后接种至96孔板，每孔1×104个细胞，待细胞贴壁后孵育24 h；KOA软骨细胞+水凝胶组每孔置入50 μg 水凝胶，其余两组不作处理；继续培养24 h后弃上清液及水凝胶，PBS洗涤。室温下，加入4%多聚甲醛固定10 min；PBS洗涤5 min×3次；加入0.5%Triton X-100 10 min；吸弃上清液后再次洗涤，37℃封闭1 h；加1 μg/mL COL-Ⅱ一抗，每孔100 μL，置于4℃冰箱过夜；避光条件下加入荧光二抗100 μL，孵育1 h；吸弃二抗后洗涤3次；每孔加入DAPI 100 μL，染色5 min；荧光显微镜下观察染色情况，阳性染色细胞核呈蓝色、COL-Ⅱ呈绿色。每组取3个视野，使用荧光酶标仪测算荧光强度值。
1.3.5. 活性氧检测
实验分为4组，正常对照组、阳性对照组、KOA软骨细胞组、KOA软骨细胞+负载50 µmol/L桑黄素的NMCM水凝胶组（KOA软骨细胞+水凝胶组），每组3个复孔。取正常及KOA软骨细胞，同上法制成细胞悬液后接种至6孔板，每孔1×105个细胞。前两组接种正常软骨细胞，后两组接种KOA软骨细胞，且KOA软骨细胞+水凝胶组同时加入对应的NMCM水凝胶150 μg。隔天换液，继续培养。
按照活性氧检测试剂盒说明书操作。配置2，7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）溶液，以无血清培养基为溶剂，溶液浓度为10 µmol/L；以同样比例配置Rosup（活性氧阳性对照）溶液。待细胞长满孔内80%时原位装载荧光探针。除阳性对照组每孔加入1.5 mL Rosup溶液外，其余各组每孔加入1.5 mL DCFH-DA溶液。于37℃孵育20 min后洗去多余探针3 min×3次。装载完成后，将培养板置于荧光酶标仪检测，选取FITC参数设置进行图像收集，计算荧光强度值。
1.4. 动物体内实验
1.4.1. 构建大鼠膝关节软骨损伤模型
将20只大鼠随机分为实验组及对照组，每组各10只。两组腹腔内注射2%戊巴比妥钠（2.5 mL/kg）麻醉后，固定于手术台。取右后肢膝关节，于髌韧带内侧纵向弧形切开约1.5 cm，分离各层组织，打开关节囊。将髌骨推向外侧滑脱，暴露股骨髁滑车负重区域。用钻头在负重区钻一直径1 mm、深至软骨下骨的圆形缺损。实验组软骨缺损处注射含25 µmol/L桑黄素的NMCM水凝胶，UV照射30 s 进行交联；对照组缺损处旷置处理。生理盐水反复冲洗术区，注意避免水凝胶脱落，逐层缝合关闭切口。
术后伤肢不固定，3 d内每天肌肉注射青霉素1次（10万U/次）。造模4周后处死全部大鼠进行观测。
1.4.2. 观测指标
① micro-CT检测：完整切取大鼠右后肢，置于4%多聚甲醛固定72 h后行micro-CT检查，条件设定为体素尺寸18 pm、电压80 kV、电流100 μA、暴露时间15 min。
② 大体及组织学观察：micro-CT检测后，以原手术切口入路暴露膝关节，伸直下肢并向外侧轻推髌骨，暴露关节面。钝性分离关节周围软组织，剪断前、后交叉韧带及内、外侧副韧带，去除软组织，获得股骨髁软骨标本。大体观察软骨修复情况，并根据国际软骨修复协会（ICRS）制定的软骨修复大体评分系统[15]进行大体评分并分级。
大体观察后，取两组部分股骨髁软骨标本置于4%多聚甲醛固定72 h，10%EDTA溶液脱钙，当针头刺入无阻力时结束脱钙。石蜡包埋、切片，片厚6 μm。取部分切片行番红-O固绿染色，光镜下观察软骨与软骨下骨，并根据ICRS软骨修复组织学评价量表[15]进行组织学评分。取部分切片行COL-Ⅱ免疫组织化学染色，倒置显微镜下观察软骨组织与软骨下骨。
③ 实时荧光定量PCR检测：取两组部分股骨髁软骨标本，采用实时荧光定量PCR检测TNF-α、NF-κB、MMP-13、COL-Ⅱ（COL-2a1）、GAPDH的mRNA表达。按照RNA提取试剂盒说明书提取标本总RNA，以逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增。使用Primer5.0软件选择引物序列（表1）。反应条件：预变性95℃、30 s，变性60℃、5 s，退火60℃、30 s。以GAPDH为内参，采用2−ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。实验重复3次。
表 1.
Primer sequences of real-time fluorescence quantitative PCR
实时荧光定量PCR引物序列
| 基因 Gene |
引物序列 Primer sequence |
| TNF-α |
上游 5′-TCAGCCTCTTCTCATTCCTGC-3′ Forward 下游 5′-TTGGTGGTTTGCTACGACGTG-3′ Reverse |
| NF-κB | 上游 5′-TATGTGGAGATCATTGAGCAGC-3′ Forward 下游 5′-CGTCTTAGTGGTATCTGTGCTT-3′ Reverse |
| MMP-13 |
上游 5′-TGACAGGCTCCGAGAAATG-3′ Forward 下游 5′-CGTTGTATTCACCCACATCAG-3′ Reverse |
| COL-2a1 |
上游 5′-CATCGAGTACCGATCACAGAAG-3′ Forward 下游 5′-GCCCTATGTCCACACCAAAT-3′ Reverse |
| GAPDH |
上游 5′-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3′ Forward 下游 5′-TGAGCTTGACAAAGTGGTCG-3′ Reverse |
④ Western blot检测：取两组部分股骨髁软骨标本，加入RIPA裂解液，4℃条件下裂解1 h，酶标仪测量蛋白浓度。根据BCA蛋白测定结果，向齿槽中加入适量蛋白进行电泳。电泳完成后转移至聚偏二氟乙烯膜，在摇床上封闭1～2 h，加入TNF-α（1∶500）、NF-κB（1∶500）、MMP-13（1∶500）、COL-Ⅱ（1∶500）一抗，4℃孵育12 h。吸弃一抗，静置1 h后TBST洗涤10 min×3 次；加入二抗（1∶3 000），4℃孵育2 h。洗涤后置于成像分析仪中成像，Image J软件分析上述KOA相关标志蛋白及软骨细胞表型相关蛋白表达情况，以β-actin作为内参，计算目的蛋白相对表达量。
1.5. 统计学方法
采用SPSS26.0统计软件进行分析。计量资料进行正态性检验，如符合正态分布，数据以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。
2. 结果
2.1. NMCM水凝胶缓释性能检测
NMCM水凝胶中桑黄素在早期释放速度较快，1 h时累积释放率为12%；24 h开始释放变缓，96 h时释放量接近于0，提示药物释放达平衡点，此时累积释放率为88%。累积释放曲线见图2。
图 2.
Drug release curve of NMCM hydrogel
NMCM水凝胶累积释放曲线
2.2. 体外细胞实验
2.2.1. 软骨细胞形态观察及鉴定
培养的KOA软骨细胞大小均一，呈圆球形；24 h后细胞完全贴壁，状态良好；4 d后细胞增多，呈不规则排列；8 d后细胞进一步增多，密度增大且分布紧密，贴壁状态稳定。传代后软骨细胞无明显纤维化，细胞仍呈圆球形。见图3a～e。甲苯胺蓝染色后KOA软骨细胞形态正常，呈圆球形；细胞质呈紫红色，细胞核大而圆、染色后呈蓝紫色，其中可见正在分裂的细胞，生长情况良好。鉴定结果提示分离培养细胞为软骨细胞。见图3f。
图 3.
Morphological observation and identification of KOA chondrocytes under inverted microscope
倒置显微镜下KOA软骨细胞形态观察及鉴定
a～e. 原代细胞培养2 h、8 h、4 d、8 d以及第3代软骨细胞形态（×100）； f. 甲苯胺蓝染色（×40）
a-e. Morphology observation of primary cells cultured for 2 hours, 8 hours, 4 days, and 8 days and the 3rd generation (×100); f. Toluidine blue staining (×40)
2.2.2. 桑黄素细胞毒性检测
与对照组比较，各浓度桑黄素组A值均增加，提示浓度≤50.0 µmol/L的桑黄素溶液对软骨细胞无毒性作用。其中12.5、25.0 µmol/L桑黄素组与对照组差异有统计学意义（P<0.05）。见图4。
图 4.
The toxic effect of morin on chondrocytes detected by CCK-8 assay
CCK-8法检测桑黄素细胞毒性
*与对照组比较P<0.05
*Compared with the control group, P<0.05
2.2.3. NMCM水凝胶对软骨细胞增殖影响检测
培养后各时间点，NMCM水凝胶组A值均较对照组增加（图5）。其中，24、96 h时各NMCM水凝胶组与对照组差异均有统计学意义（P<0.05）；48、72 h时负载12.5、25.0 µmol/L桑黄素的NMCM水凝胶组与对照组差异有统计学意义（P<0.05）。
图 5.
Effect of the NMCM hydrogel loaded with different concentrations of morin on chondrocyte proliferation detected by CCK-8 assay
CCK-8法检测负载不同浓度桑黄素的NMCM水凝胶对软骨细胞增殖影响
2.2.4. COL-Ⅱ免疫荧光染色观察
荧光显微镜下见各组均呈阳性染色（图6）。 KOA软骨细胞组及KOA软骨细胞+水凝胶组COL-Ⅱ荧光强度值分别为0.06±0.04、0.92±0.03，均低于正常软骨细胞组（1.00±0.02）；KOA软骨细胞+水凝胶组高于KOA软骨细胞组；组间差异均有统计学意义（P<0.05）。
图 6.
Observation of COL-Ⅱ immunofluorescence staining (Fluorescence microscope×40)
COL-Ⅱ免疫荧光染色观察（荧光显微镜×40）
a. 正常软骨细胞组；b. KOA软骨细胞组；c. KOA软骨细胞+水凝胶组
a. Normal chondrocyte group; b. KOA chondrocyte group; c. KOA chondrocyte+NMCM group
2.2.5. 活性氧检测
正常对照组、阳性对照组、KOA软骨细胞组、KOA软骨细胞+水凝胶组荧光强度值分别为1.00±0.01、2.20±0.05、2.04±0.09、1.71±0.06。其中，KOA软骨细胞组荧光强度值高于正常对照组及KOA软骨细胞+水凝胶组，KOA软骨细胞+水凝胶组高于正常对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图7。
图 7.
The level of ROS in chondrocytes detected by DCFH-DA probe (Fluorescence microscope×60）
DCFH-DA探针检测软骨细胞活性氧水平（荧光显微镜×60）
a. 正常对照组；b. KOA软骨细胞组；c. KOA软骨细胞+水凝胶组；d. 阳性对照组
a. Normal control group; b. KOA chondrocyte group; c. KOA chondrocyte+NMCM group; d. Positive control group
2.3. 动物体内实验
2.3.1. micro-CT观察
术后每组各有1只动物造模处感染，排除实验，两组各9只纳入观测。术后4周micro-CT观察示，实验组关节面粗糙，软骨缺损仍可见，但关节间隙正常；对照组关节软骨变薄，关节面与实验组相比更粗糙，软骨缺损无修复迹象，关节间隙变窄。见图8。
图 8.
Micro-CT observation of two groups at 4 weeks after operation
术后4周两组micro-CT观察
箭头示软骨缺损处 a、b. 实验组正侧位；c、d. 对照组正侧位
Arrow for the cartilage injury a, b. Anteroposterior and lateral views of the experimental group; c, d. Anteroposterior and lateral views of the control group
2.3.2. 大体观察
术后4周实验组股骨髁关节面粗糙，NMCM水凝胶已降解，软骨缺损仍可见，其周围有组织修复，以纤维组织为主；对照组关节面更粗糙，软骨缺损未见修复组织。见图9。实验组ICRS大体评分为（3.7±0.7）分，高于对照组的（0.9±0.6）分，差异有统计学意义（t=−8.980，P<0.001）。根据ICRS大体评分，实验组软骨修复达Ⅲ级5只、Ⅳ级4只；对照组均为Ⅳ级。
图 9.
Gross observation of cartilage injury in the two groups
两组软骨缺损大体观察
箭头示软骨缺损处 a. 股骨髁软骨缺损模型；b. 实验组NMCM水凝胶修复后；c. 术后4周对照组；d. 术后4周实验组
Arrow for the cartilage injury a. Femoral condylar cartilage injury model; b. The cartilage injury was repaired with NMCM hydrogel in the experimental group; c. Control group at 4 weeks after operation; d. Experimental group at 4 weeks after operation
2.3.3. 组织学观察
① 番红-O固绿染色：两组软骨与软骨下骨分界清晰。实验组软骨细胞较多，软骨组织较厚，关节面粗糙；对照组与实验组相比，关节软骨变薄，软骨细胞少，关节面更粗糙，可见软骨缺损。实验组ICRS组织学评分为（3.4±0.9）分，高于对照组的（1.8±1.1）分，差异有统计学意义（t=–3.560，P=0.026）。② COL-Ⅱ免疫组织化学染色：两组染色均呈阳性，但实验组染色较对照组深。见图10。
图 10.
Histological observation of the two groups at 4 weeks after operation (Inverted microscope×40）
术后4周两组组织学观察（倒置显微镜×40）
箭头示软骨缺损处 a、b. 实验组及对照组番红-O固绿染色；c、d. 实验组及对照组COL-Ⅱ免疫组织化学染色
Arrow for the cartilage injury a, b. Safranine-O-fast green staining of the experimental and control groups; c, d. COL-Ⅱ immunohistochemistry staining of the experimental and control groups
2.3.4. Western blot及实时定量 PCR检测
实验组MMP-13、NF-κB、TNF-α蛋白及mRNA相对表达量均较对照组降低，COL-Ⅱ蛋白及COL-2a1 mRNA相对表达量升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图11。
图 11.
The targeted protein and gene expressions of the two groups
两组软骨组织目的蛋白及基因表达观测
a. 蛋白电泳图 1：对照组 2：实验组 Mr：相对分子质量；b. 目的蛋白相对表达量 *与对照组比较P<0.05；c. 目的基因相对表达量 *与对照组比较P<0.05
a. Electrophoregram 1: Control group 2: Experimental group Mr: Relative molecular mass; b. Relative expressions of the targeted proteins *Compared with the control group, P<0.05; c. Relative expressions of the targeted genes *Compared with the control group, P<0.05
3. 讨论
KOA最主要的病理改变为软骨损伤进行性加重，如果能修复填充软骨缺损，抑制炎症介质持续破坏软骨，就能延缓疾病进展。目前，负载治疗药物的缓释材料为软骨修复提供了可能[16-18]。
壳聚糖是一种优秀缓释载体，并且可以通过引入基团进行改性，以改进性能或改变交联方式[19]。本研究中通过加入甲基丙烯酰酐对壳聚糖进行改性并引入碳点，以降低壳聚糖的分子间作用力，使其具有中性pH环境下的高溶解性。不同于既往研究中复杂的交联条件或较长的交联时间，UV交联壳聚糖能够在短时间的UV照射下快速交联，且在负载桑黄素后表现出良好的缓释性能。我们前期研究表明桑黄素在诸如降低氧化应激水平、抑制炎症细胞增殖、减轻炎症反应等方面均有良好表现[4]。但既往关于桑黄素的细胞毒性研究未采用人软骨细胞，因此未能确定其对于人来源软骨细胞的毒性，而且桑黄素作用于软骨细胞的最适浓度缺乏定量实验支持。本研究结果表明，12.5、25.0、50.0 µmol/L桑黄素溶液均对人软骨细胞无毒性，而且可促进软骨细胞增殖。而在细胞增殖实验中，当桑黄素溶液浓度增加至50 µmol/L时，软骨细胞增殖速度无显著增高，提示软骨细胞增殖能力对较高浓度的桑黄素无浓度依赖性。因此，在进行复合药物缓释时，可以选择浓度较低的桑黄素溶液即可达到理想药理作用。
在KOA软骨细胞中活性氧表达水平往往异常升高[20]，其通过多种通路参与软骨损伤发生，是诱发KOA的重要因素。本研究在壳聚糖加入的碳点中掺有氮元素，其作为电子供体赋予碳点良好的抗氧化功能[21]，配合桑黄素的抗氧化作用，有效降低了KOA软骨细胞中的活性氧水平，提示桑黄素及碳点具有抗氧化作用，可共同保护软骨细胞，减少氧化应激损伤。NF-κB是一种与软骨细胞凋亡紧密相关的信号通路，在KOA发病过程中具有重要作用。TNF-α同时作为NF-κB的上、下游因子，与其构成正反馈环路，放大了促进细胞凋亡的作用。本研究中，桑黄素下调了NF-κB、TNF-α表达水平，且其下游炎症因子MMP-13水平也下降。COL-Ⅱ作为细胞外基质的重要组成成分，在KOA发生时表达水平显著降低。本研究结果提示，桑黄素可降低细胞中MMP-13水平，进而减少细胞外基质分解，提高细胞中COL-Ⅱ水平。在细胞免疫荧光染色检测中同样发现，负载桑黄素的NMCM水凝胶对软骨细胞中COL-Ⅱ的正常合成代谢有着积极影响。而在动物体内实验中，实验组大鼠膝关节面形态更接近正常，大体评分及组织学评分更高、修复评估分级更高，与上述体外实验结果一致。
综上述，碳点UV交联壳聚糖水凝胶具有优秀的缓释性能，负载桑黄素后能够起到保护软骨细胞的作用。作为一种理想的治疗软骨损伤载药体系， NMCM水凝胶具有在UV照射下快速交联、长期缓释的特点，临床有望联合膝关节镜技术，于微创条件下进行关节内UV照射交联，为KOA软骨损伤提供修复基质和缓释药物。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案经哈尔滨医科大学附属第一医院临床试验伦理委员会批准（2020HX031），哈尔滨医科大学附属第一医院动物使用与福利伦理审查委员会批准（2022099）；实验动物使用许可证号：SYXK（黑）2021-004
作者贡献声明 曲彦隆：研究设计、修改论文；关正瑞：研究实施、论文撰写；南飞、刘思遥：数据收集及统计学分析；刘禄萌：文献整理、行政支持
Funding Statement
黑龙江省自然科学基金资助项目（LH2019H020）；北京康盟慈善基金会医学科研发展基金项目（YXKY-HX2002）
Science and Technology Plan Project of Heilongjiang Province (LH2019H020); Medical Research Development Fund Project of Beijing Health Alliance Charitable Foundation (YXKY-HX2002)
References
- 1.Sharma L Osteoarthritis of the knee. N Engl J Med. 2021;384(1):51–59. doi: 10.1056/NEJMcp1903768. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 2.Peng H, Ou A, Huang X, et al Osteotomy around the knee: The surgical treatment of osteoarthritis. Orthop Surg. 2021;13(5):1465–1473. doi: 10.1111/os.13021. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 3.孙雅军, 张艳芳, 许惠敏, 等 桑色素调节NLRP3/Caspase-1通路改善大鼠实验性自身免疫性甲状腺炎的研究. 四川大学学报 (医学版) 2021;52(2):229–234. [Google Scholar]
- 4.Qu Y, Wang C, Liu N, et al Morin exhibits anti-inflammatory effects on IL-1β-stimulated human osteoarthritis chondrocytes by activating the Nrf2 signaling pathway. Cell Physiol Biochem. 2018;51(4):1830–1838. doi: 10.1159/000495684. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 5.Qu Y, Zhou L, Wang C Mangiferin inhibits IL-1β-induced inflammatory response by activating PPAR-γ in human osteoarthritis chondrocytes. Inflammation. 2017;40(1):52–57. doi: 10.1007/s10753-016-0451-y. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 6.裴志伟, 王建忠 原位3D生物打印技术在骨和软骨损伤修复中的研究进展. 中国修复重建外科杂志. 2022;36(4):487–494. doi: 10.7507/1002-1892.202111043. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 7.涂鹏程, 马勇, 潘娅岚, 等 负载威灵仙总皂苷丝素蛋白微载体复合软骨细胞促进兔膝关节软骨缺损修复的实验研究. 中国修复重建外科杂志. 2022;36(3):343–351. [Google Scholar]
- 8.Aliabadi M, Chee BS, Matos M, et al. Microfibrillated cellulose films containing chitosan and tannic acid for wound healing applications. J Mater Sci Mater Med, 2021, 32(6): 67. doi: 10.1007/s10856-021-06536-4.
- 9.Turley JL, Moran HBT, McEntee CP, et al. Chitin-derived polymer deacetylation regulates mitochondrial reactive oxygen species dependent cGAS-STING and NLRP3 inflammasome activation. Biomaterials, 2021, 275: 120961. doi: 10.1016/j.biomaterials.2021.120961.
- 10.Sun M, Wang T, Pang J, et al Hydroxybutyl chitosan centered biocomposites for potential curative applications: A critical review. Biomacromolecules. 2020;21(4):1351–1367. doi: 10.1021/acs.biomac.0c00071. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 11.Luo J, Shi X, Li L, et al An injectable and self-healing hydrogel with controlled release of curcumin to repair spinal cord injury. Bioact Mater. 2021;6(12):4816–4829. doi: 10.1016/j.bioactmat.2021.05.022. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 12.Wang H, Mu Q, Wang K, et al Nitrogen and boron dual-doped graphene quantum dots for near-infrared second window imaging and photothermal therapy. Appl Mater Today. 2019;14:108–117. doi: 10.1016/j.apmt.2018.11.011. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 13.孙思佳, 吴頔, 张贾鹤, 等 超小型锰掺杂金纳米簇及微环境响应的肿瘤可视化诊疗. 中国科学: 化学. 2021;51(9):1259–1268. [Google Scholar]
- 14.Liu Y, Hu S, Zhang G, et al. Pattern-based recognition of proteins by an array of fluorescent carbon-nanodot receptors. Talanta, 2020, 209: 120551. doi: 10.1016/j.talanta.2019.120551.
- 15.Kumar R, Pierce DM, Isaksen V, et al. Comparison of compressive stress-relaxation behavior in osteoarthritic (ICRS Graded) human articular cartilage. Int J Mol Sci, 2018, 19(2): 413. doi: 10.3390/ijms19020413.
- 16.Freitag J, Wickham J, Shah K, et al Real-world evidence of mesenchymal stem cell therapy in knee osteoarthritis: a large prospective two-year case series. Regen Med. 2022;17(6):355–373. doi: 10.2217/rme-2022-0002. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 17.Levinson C, Lee M, Applegate LA, et al An injectable heparin-conjugated hyaluronan scaffold for local delivery of transforming growth factor β1 promotes successful chondrogenesis. Acta Biomater. 2019;99:168–180. doi: 10.1016/j.actbio.2019.09.017. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 18.Xu J, Feng Q, Lin S, et al Injectable stem cell-laden supramolecular hydrogels enhance in situ osteochondral regeneration via the sustained co-delivery of hydrophilic and hydrophobic chondrogenic molecules. Biomaterials. 2019;210:51–61. doi: 10.1016/j.biomaterials.2019.04.031. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 19.Cao Z, Su C, Sun X, et al. Enhanced mechanical properties of hydroxybutyl chitosan hydrogel through anchoring interface effects of diatom biosilica. Carbohydr Polym, 2022, 296: 119975. doi: 10.1016/j.carbpol.2022.119975.
- 20.Koike M, Nojiri H, Ozawa Y, et al. Mechanical overloading causes mitochondrial superoxide and SOD2 imbalance in chondrocytes resulting in cartilage degeneration. Sci Rep, 2015, 5: 11722. doi: 10.1038/srep11722.
- 21.Ji Y, Yue L, Cao X, et al. Carbon dots promoted soybean photosynthesis and amino acid biosynthesis under drought stress: Reactive oxygen species scavenging and nitrogen metabolism. Sci Total Environ, 2022, 856(Pt 1): 159125. doi: 10.1016/j.scitotenv.2022.159125.