种植体黏膜下微生物在健康种植体和种植体周炎中的构成与差异：一项横断面研究

Abstract

目的

探索种植体黏膜下微生物在健康种植体和种植体周炎中的构成与差异，并分析与临床指标存在相关性的菌种，为种植体周炎的病因学研究提供参考。

方法

采用横断面研究，共纳入49例患者，20例为健康种植体，29例为种植体周炎，共采集49份黏膜下微生物样本进行16S核糖体RNA(16S ribosomal RNA, 16S rRNA)基因高通量测序。对两组样本的多样性、菌群构成和差异物种进行分析和比较，采用Spearman相关性分析评价菌种与探诊深度(probing pocket depth, PPD)之间的相关性。

结果

健康组的α多样性显著低于种植体周炎组[Chao1指数：236.85±66.13 vs. 150.54±57.43，P < 0.001；Shannon指数：3.42±0.48 vs. 3.02±0.65，P=0.032]。主成分分析显示，两组样本的群落结构差异有统计学意义[相似性分析(analysis of similarities, ANOSIM)，R²=0.243，P=0.001]。与健康种植体相比，种植体周炎黏膜下菌斑中的牙周致病菌显著增加，包括红色复合体成员[牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、福赛斯坦纳菌(Tannerella forsythia)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)]、部分橙色复合体成员[中间普氏菌(Precotella intermedia)、缠结优杆菌(Eubacterium nodatum)和微小微单胞菌(Parvimonas micra)]以及一些新型牙周致病菌，如龈沟产线菌(Fillifactor alocis)、苛求依赖杆菌(Fretibacterium fastidiosum)、牙髓卟啉单胞菌(Porphyromonas endodontalis)和Desulfobulbus sp._HMT_041。相关性分析显示，种植体黏膜下微生物中，齿垢密螺旋体(r=0.686, P < 0.001)、福赛斯坦纳菌(r=0.675, P < 0.001)、Fretibacterium sp. (r=0.671, P < 0.001)、Desulfobulbus sp._HMT_041 (r=0.664, P < 0.001)、龈沟产线菌(r=0.642, P < 0.001)、苛求依赖杆菌(r=0.604, P < 0.001)、牙龈卟啉单胞菌(r=0.597, P < 0.001)、牙髓卟啉单胞菌(r=0.573, P < 0.001)的丰度与种植体周PPD呈显著正向相关；空间罗氏菌(Rothia aeria)(r=-0.615, P < 0.001)的丰度与PPD呈显著负相关。

结论

种植体黏膜下微生物在健康种植体和种植体周炎中的群落构成存在明显不同，红色复合体、部分橙色复合体成员以及一些新型牙周致病菌与种植体周炎的发生密切相关；与健康种植体相比，种植体周炎的黏膜下微生物群落具有高物种丰富度及多样性的特点。

随着口腔种植技术的发展，种植修复逐渐在各类牙列缺损、牙列缺失的修复中占据越来越重要的位置。尽管种植体的10年存留率高达96.4%^[1]，但种植失败的情况也时有发生。种植体周炎作为导致远期种植失败最常见的生物学并发症，不仅会引起种植体周软组织炎症，还会破坏种植体周支持骨组织，导致种植体骨结合丧失，最终松动和脱落^[2]。近年来，种植体周炎的发病率呈明显上升趋势，有研究指出，在种植体植入后的两年观察期内，34%的患者和21%的种植体发生了种植体周炎^[3]。

菌斑生物膜作为种植体周感染性疾病发病的始动因素，在种植体周炎的发生、发展中起到重要作用^[4]。既往由于技术的限制，研究多集中于评价几种可疑牙周致病菌在种植体周炎中的作用，但越来越多的证据表明，菌斑生物膜作为一个生态系，其中包含的整体菌群变化较单一细菌更能真实反映疾病的病因。随着高通量测序技术的成熟，观察菌群群落生态结构成为可能。因此，为全面了解健康种植体与种植体周炎相应的黏膜下微生物特征，本研究借助16S核糖体RNA(16S ribosomal RNA, 16S rRNA)高通量测序技术分析两者的黏膜下菌斑，并分析与种植体周探诊深度(probing pocket depth, PPD)可能相关联的细菌，以期为种植体周炎的病因学和发病机制提供一定依据。

1. 资料与方法

本研究为横断面研究，获得北京大学口腔医院生物医学伦理委员会批准(PKUSSIRB-201946080)，所有受试者均在研究开始前签署了知情同意书。

1.1. 研究对象

研究对象选自2020年5月至2021年12月就诊于北京大学口腔医院牙周科，口内含有健康种植体的患者和被诊断为种植体周炎的患者。诊断标准参考2018年牙周病和植体周病国际新分类^[5-6]。

健康种植体的诊断标准：种植体周围黏膜无炎症，表现为色粉、无红肿，无轻探出血或溢脓；PPD与基线相比无增加；X线片检查显示种植体骨高度除因初期骨改建所致骨吸收外无骨丧失。

种植体周围炎的诊断标准：出现种植体周围黏膜的炎症，表现为黏膜色红、组织水肿、轻探诊出血和(或)溢脓。有基线资料(初始X线片及PPD检查)的种植体：PPD较基线检查增加，X线片显示除最初骨改建外存在骨丧失。缺乏初始资料的种植体：轻探出血和(或)溢脓，PPD ≥6 mm，X线片检查显示≥3 mm的骨丧失。

纳入标准：(1)患者全身健康，无明显系统性疾病；(2)不吸烟；(3)口内含有至少一颗种植体，完成上部结构修复并负重≥12个月；(4)患者近6个月未接受牙周及种植体维护治疗。

排除标准：(1)年龄18岁以下或75岁以上；(2)3个月内应用抗生素或免疫抑制剂；(3)不同意参与试验，未签署知情同意书。

1.2. 样本采集和临床检查

所有患者的种植体经初步诊断后，行全口天然牙龈上与种植体黏膜上洁治，其中种植体黏膜上洁治使用配备聚醚醚酮纤维的尖端涂层工作尖的超声仪器(Air-Flow^® Master Piezon, Nyon, EMS，瑞士)。一周后复诊，收集种植体黏膜下微生物样品。为了避免取样操作对临床指标检查和微生物的干扰，于取样前记录种植体颊舌侧两个位点的菌斑指数(plaque index，PLI)。随后用吸潮纸尖法获取种植体黏膜下微生物，具体方法如下：使用棉卷隔湿拟采集的种植体，尖探针去除种植体表面黏膜上菌斑，气枪吹干种植体及局部黏膜表面，将6根剪去尖端2 mm的吸潮纸尖(#35)依次轻轻插入种植体周围6个位点(颊侧近中、颊侧中央、颊侧远中、舌侧近中、舌侧中央、舌侧远中)至有轻微阻力为止，停留30 s后取出，置于无菌Eppendorf管中，于冰盒中保存尽快转移到实验室预处理。

预处理过程：采用套管法洗脱吸潮纸尖，于Eppendorf管中加入350 μL TE缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0)，充分振荡后，离心机离心15 min(13 000 r/min，直径5.5 cm，4 ℃)，去除上清液，沉淀-80 ℃冻存以备DNA提取。

取样完成后进行其他临床指标的检查^[7]，如种植体周PPD、出血指数(bleeding index，BI)、种植体周软组织探诊溢脓情况、边缘骨丧失(marginal bone loss, MBL)。

1.3. 微生物DNA提取和Illumina Miseq测序

使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN Sciences，USA)提取种植体黏膜下微生物总DNA。使用NanoDrop ND-1000分光光度计(Thermo Fisher Scientific, USA)测定DNA浓度和纯度，1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。使用引物338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-GGA-CTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 以PCR扩增细菌16S rRNA基因的V3-V4高变区。根据提取DNA的数量和质量，使用无菌水将样品稀释至1 μg/L，并在-80 ℃储存直至使用。

基于细菌16S rRNA的基因测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成，所有DNA样品的浓度与纯度均符合该公司对于Miseq测序的相关要求。在Illumina PE300平台(Illumina, San Diego, USA)进行测序，原始数据已上传至NCBI Sequence Read Archive (SRA)数据库(接收编号：PRJNA861252)。

1.4. 生物信息学分析与统计分析

经过Illumina MiSeq平台进行测序后得到原始数据，使用QIIME软件(Version 1.9.1)进一步进行数据质控(Reads拼接、Tags过滤、去嵌合体等)得到高质量的序列。采用RDP classifier贝叶斯(Bayes)算法将97%相似水平的操作分类单元(operational taxonomic units，OTU)序列与Human Oral Micro-biome数据库(HOMD-v15.2)进行分类学比对，分类置信度设置为0.7，数据抽平后进行物种注释分析。

根据观测到的OTU数目(Sob指数)绘制物种稀释曲线，在OTU水平计算反应物种丰富度的Chao1指数和反应物种多样性的Shannon指数，评估各样本的α多样性，组间比较借助Wilcoxon秩和检验。在OTU水平进行主成分分析(基于Weighted UniFrac距离), 并采用相似性分析(analysis of similarities, ANOSIM)比较组间菌群结构的差异以评估样本的β多样性。分别在门、属、种水平上进行Wilcoxon秩和检验并行错误发现率(false discovery rate，FDR)校正P值以降低假阳性率，分析组间存在差异的物种。通过Spearman相关性分析评价物种与临床指标之间的相关性。对于人口学数据及临床指标，采用Shapiro-wilk检验进行正态性检验后，方差齐、正态分布的计量资料以均数±标准差表示，通过独立样本t检验比较两组间各项指标的差异，计数资料的比较使用卡方检验。统计及作图软件为SPSS 26.0软件(IBM Corporation)和GraphPad Prism 9，双侧P < 0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 一般情况及种植体临床指标

共纳入49例患者，每例患者选取1颗种植体，包含20颗健康种植体(健康组)和29颗种植体周炎种植体(种植体周炎组)。受试者一般情况及种植体临床指标见表 1，两组年龄、性别、种植体位置差异均无统计学意义(P > 0.05)。与健康组相比，种植体周炎组的PPD、BI、PLI、探诊溢脓等指标差异均有统计学意义(P < 0.001)。

表 1.

受试者与种植体的一般情况

Characteristics of subjects and implants

Parameters	Healthy implants (n=20)	Peri-implantitis (n=29)	F value	χ 2	P value
Data are presented as x±s or n (%). PLI, plaque index; PPD, probing pocket depth; BI, bleeding index; MBL, marginal bone loss.
Age/years	47.6±15.0	54.7±12.9	0.478		0.086
Gender (male/female)	8/12	17/12	0.037		0.208
Position
Anterior maxilla	3 (15.0)	2 (6.9)		1.073	0.784
Posterior maxilla	7 (35.0)	10 (34.5)
Anterior mandibula	1 (5.0)	1 (3.4)
Posterior mandibula	9 (45.0)	16 (55.2)
Mean PLI	0.20±0.34	1.57±0.78			< 0.001
Mean PPD/mm	2.36±0.25	6.20±1.64	30.324		< 0.001
Mean BI	0.14±0.20	2.86±0.72	14.158		< 0.001
Suppuration	0	13 (44.8)		12.203	< 0.001
Mean MBL/mm	0	3.12±1.79	26.634		< 0.001

2.2. 种植体黏膜下微生物测序结果

49份黏膜下微生物样品共获得2 448 590个高质量序列，序列平均长度421 bp，共获得502个OTU，归属于12个门、28个纲、49个目、983个科、148个属和315个种。通过计算代表OTU数目的Sobs指数构建稀释曲线(图 1)，两组样品的稀释曲线均趋于平缓，测序数据量合理。

图 1.

基于观测到的OTU数目绘制稀释曲线

Rarefaction curves based on Sobs index (observed OTU)

OTU, operational taxonomic units.

2.3. 种植体黏膜下菌群构成

门水平上(图 2A)，健康种植体与种植体周炎两组丰度>5%的优势微生物菌门为厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、梭杆菌门(Fusobacteria)，占据所有序列的90%以上。另外的细菌属于糖杆菌门(Saccharibacteria)、互养菌门(Synergistetes)、螺旋体门(Spirochaetes)以及尚未分类的细菌。

图 2.

健康种植体和种植体周炎中种植体黏膜下菌群在门和属水平上的物种构成

Microbial component at phyla and genus level of submucosal microbial in peri-implantitis and health implants

A, at the phylum level; B, at the genus level.

属水平上(图 2B)，共检测出18个丰度 > 2%的优势菌属，其丰度总占比超过全部样本测序比例的70%。分别为链球菌属(Streptococcus)、奈瑟菌属(Neisseria)、放线菌属(Actinomyces)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、梭杆菌属(Fusobacterium)、韦荣球菌属(Veillonella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、普氏菌属(Prevotella)、二氧化碳噬纤维菌属(Capnocytophaga)、劳特罗普氏菌属(Lautropia)、纤毛菌属(Leptotrichia)、依赖杆菌属(Fretibacterium)、克吕沃尔氏菌属(Kluyvera)、月形单胞菌属(Selenomonas)、罗氏菌属(Rothia)、微杆菌属(Mircobacterium)、密螺旋体属(Treponema)和产线菌属(Filifactor)。

2.4. 种植体黏膜下菌群构成差异

健康种植体和种植体周炎两组样本的α多样性和β多样性差异均有统计学意义。种植体周炎组的黏膜下菌群与健康组相比，表现为更高的群落丰富度(Chao1指数236.85±66.13 vs. 150.54±57.43，P < 0.001，图 3A)与多样性(Shannon指数3.42±0.48 vs.3.02±0.65，P=0.032，图 3B)。基于Wighted UniFrac距离的主成分分析结果显示，健康组与种植体周炎组有分开趋势，两组黏膜下菌群结构显著不同(R²=0.243，P=0.001，ANOSIM，图 4)，其中主成分变量(principal component, PC)1解释度为30.84%，PC2解释度为12.8%。

图 3.

健康种植体和种植体周炎中种植体黏膜下菌群的α多样性比较

Comparison the α diversity of submucosal microbial in peri-implantitis and health implants

A, microbial richness presented by Chao1 index; B, microbial diversity presented by Shannon index. *P < 0.05, ***P < 0.001, Wilcoxon rank-sum test.

图 4.

健康种植体和种植体周炎中种植体黏膜下菌群的β多样性比较

Comparison the β diversity of submucosal microbial in peri-implantitis and health implants

ANOSIM, analysis of similarities; PC, principal component.

借助Wilcoxon秩和检验并借助FDR校正P值在不同分类水平筛选两组差异有统计学意义(Corrected P < 0.05)的物种。在门水平(图 5A)，种植体周炎组变形菌门和放线菌门丰度显著低于健康组，拟杆菌门、互养菌门、糖杆菌菌门和螺旋体门的丰度显著高于健康组。在属水平(图 5B)，丰度占比前15位的物种中，有11个菌属在种植体周炎组中的丰度显著高于健康组，分别为卟啉单胞菌属、依赖杆菌属、密螺旋体属、月形单胞菌属、产线菌属、普氏菌属、糖杆菌属-G1[Saccharibacteria (TM7)_G1]、脱硫球菌属(Desulfobulbus)、坦氏菌属(Tannerella)、韦荣氏球菌属-G1(Veillonellaceae_G1)和棒状杆菌属(Corynebacterium)，其余4个菌属在健康组中的丰度显著高于种植体周炎组，分别为消化链球菌属(Peptostreptococcus)、罗氏菌属、克雷伯杆菌属(Klebsiella)和Peptidiphaga。在种水平(图 5C)，丰度占比前15位的菌种中，有11个菌种在种植体周炎组中的丰度显著高于健康组，分别为牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、Fretibacterium sp.、牙髓卟啉单胞菌(Porphyromonas endodontalis)、微小微单胞菌(Parvimonas micra)、龈沟产线菌(Fillifactor alocis)、苛求依赖杆菌(Fretibacterium fastidiosum)、Desulfobulbus sp._HMT_041、福赛斯坦纳菌(Tannerella forsythia)、齿垢密螺旋体(Trponema denticola)、中间普氏菌(Precotella intermedia)和缠结优杆菌(Eubacterium nodatum)，其余4个菌种在健康组中的丰度更高，分别为空间罗氏菌(Rothia aeria)、消化链球菌(Peptostreptococcus stomatis)、Peptidiphaga sp._HMT_183和牙龈二氧化碳噬纤维菌(Capnocytophaga gingivalis)。

图 5.

健康种植体和种植体周炎中种植体黏膜下菌群的构成差异比较

Comparison the component difference of submucosal microbial in peri-implantitis and health implants

A, at the phylum level; B, top 15 most abundant genera; C, top 15 most abundant species. Only taxa that were significantly different between the peri-implantitis and health implants group were plotted (Wilcoxon rank-sum test and FDR-adjusted P < 0.05). FDR, false discovery rate.

2.5. 种植体黏膜下微生物丰度与PPD的相关性分析

在种水平筛选与PPD存在显著相关(P < 0.05)且Spearman相关系数>0.5的菌种，共筛选出9个菌种与PPD呈显著的线性相关关系。如图 6所示，齿垢密螺旋体(r=0.686, P < 0.001)、福赛斯坦纳菌(r=0.675, P < 0.001)、Fretibacterium sp. (r=0.671, P < 0.001)、Desulfobulbus sp._HMT_041 (r=0.664, P < 0.001)、龈沟产线菌(r=0.642, P < 0.001)、苛求依赖杆菌(r=0.604, P < 0.001)、牙龈卟啉单胞菌(r=0.597, P < 0.001)、牙髓卟啉单胞菌(r=0.573, P < 0.001)的丰度与PPD呈显著正相关；而空间罗氏菌(r=-0.615, P < 0.001)的丰度与PPD呈显著负相关。

图 6.

种植体黏膜下菌群中与PPD存在显著相关性的菌种

Species showed significant correlation with PPD in submucosal microbial of peri-implants

Only species with |Spearman correlation coefficient| > 0.5 and P < 0.05 were plotted. PPD, probing pocket depth.

3. 讨论

种植体周炎是一种多因素导致的感染性疾病，了解疾病过程中涉及的微生物学因素尤为重要。de Waal等^[8]使用培养法分析了种植体黏膜下菌斑，发现牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌、具核梭杆菌和福赛斯坦纳菌与种植体周炎有关。然而，口腔内可被培养的细菌大约仅占50%^[9]，培养法会忽视环境中其他潜在可能与种植体周炎相关的细菌类型。还有研究借助棋盘DNA-DNA杂交分析健康种植体与种植体周炎的种植体黏膜下微生物，结果并不支持其检测的特定细菌载量在两者之间存在差别^[10]。近年来，以16S rRNA基因为基础的高通量测序技术已成为当前研究微生物群落组成及其分布的重要手段，MiSeq凭借其测序读长长、测序周期短、通量大等特点，成为使用最为普遍的测序平台，被广泛应用于非培养条件下对口腔菌群群落结构的研究。

本研究发现，种植体周炎与健康种植体相比，黏膜下菌群的物种丰度与多样性更高，这表明前者的黏膜下菌斑中细菌的数量更多、细菌的种类更加多样、菌群结构构成更加复杂，与既往一些研究的结果一致^[11-13]。Socransky等^[14]应用棋盘DNA杂交技术观察到牙周炎龈下细菌的聚集有一定的规律，根据这些微生物的聚集特性将牙周微生物分为了6种复合体，分别以红、橙、黄、绿、紫、蓝命名，该颜色复合体理论得到了口腔微生物界的广泛认可。本研究中应用了该颜色分类法，发现属于红色复合体的成员牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体在种植体周炎中显著高于其在健康种植体中，与Al-Ahmad等^[15]的研究结果一致。此外，本研究还发现橙色复合体的部分成员，如中间普氏菌、缠结优杆菌和微小微单胞菌，同样在两组间存在差异，与da Silva等^[16]的部分检测结果一致。除了检出上述常见的牙周致病菌外，我们还发现一些新型牙周致病菌在种植体周炎中显著增高，如龈沟产线菌、苛求依赖杆菌、牙髓卟啉单胞菌以及目前尚无法培养的Desulfobulbus sp._HMT_041^[17]。未来研究可以从这些新型牙周致病菌作为切入点，进一步分析其在种植体周炎发生、发展中的作用。

以往有文献报道，未经治疗的种植体周炎的进展呈非线性加速模式，其破坏速度快于累及天然牙的牙周炎^[4]，往往在数年内造成种植体周支持骨组织的大量丧失。然而，目前种植体周炎的治疗效果缺乏预测性^[18]，故预防种植体周炎的发生尤为重要，对于有牙周炎病史的患者，种植体植入前应进行牙周治疗，降低牙周致病菌的含量，从而减少由于天然牙牙周炎致病菌残留导致种植体周感染的概率。

既往许多研究报道了可能与种植体周炎有关的致病微生物^{[11-12, 19]}，但鲜少有研究探讨微生物与临床指标之间的联系。Kroger等^[20]通过分析不同严重程度的种植体周炎的黏膜下微生物发现，微生物失调程度与种植体周PPD存在相关性。本研究中，我们通过统计学分析方法确定了9种与PPD加深存在显著相关的细菌，其中有8种与PPD呈正相关，包括齿垢密螺旋体、福赛斯坦纳菌、Fretibacte-rium sp.、Desulfobulbus sp._HMT_041、龈沟产线菌、苛求依赖杆菌、牙龈卟啉单胞菌和牙髓卟啉单胞菌，仅空间罗氏菌与PPD的加深呈显著负相关。

除了关注疾病状态下种植体黏膜下富集的细菌之外，健康状态下黏膜下富集的细菌也值得关注，因为这些细菌或许是有利于种植体健康的细菌。在不同分类水平上，我们均检出了与健康状态种植体有关的微生物种类。属水平上的消化链球菌属、罗氏菌属、克雷伯杆菌，种水平上的空间罗氏菌、消化链球菌、二氧化碳噬纤维菌和Peptidiphaga sp._HMT_183在健康组中的丰度均显著高于种植体周炎组。国外最近有学者开展了一项通过患者口内含化成分为罗伊氏乳杆菌的益生菌片剂治疗种植体周炎的研究^[21]，这提示我们，相较于治疗牙周或种植体周感染应该降低致病菌含量的传统理念，如何有效增加龈下(黏膜下)有益菌的含量或许可以为未来的治疗方案提供新思路。

本研究的不足之处在于取样前一周的洁治可能会对种植体黏膜下微生物造成影响。洁治作为去除龈上(黏膜上)牙菌斑和牙石的主要方法，是牙周与种植体周疾病预防和治疗的重要构成部分^[22-23]，一般认为龈上洁治对于较深牙周袋内的微生物群落影响不大^[24]。同理，对于种植体黏膜下微生物来说，PPD较浅的健康种植体，其黏膜下微生物可能会受到洁治操作的影响，而洁治对于PPD较深的种植体周炎种植体黏膜下微生物的影响较小。

综上，本研究借助Illumina Miseq高通量测序技术对种植体黏膜下微生物群落在健康种植体和种植体周炎中的构成与差异进行了比较全面的分析，结果表明红色复合体、部分橙色复合体成员以及一些新型牙周致病菌与种植体周炎密切相关，并发现了9种与种植体周PPD存在显著相关性的细菌。

Funding Statement

北京市自然科学基金(7214273)、国家自然科学基金(82173647)、北京大学临床科学家计划专项(BMU2019LCKXJ010)

Supported by the Beijing Natural Science Foundation (7214273), the National Natural Science Foundation of China (82173647), and the Peking University Clinical Scientist Program (BMU2019LCKXJ010)