姜黄素抗人巨细胞病毒感染的体外实验研究

Abstract

This study aimed to investigate the effect of curcumin (Cur) against human cytomegalovirus (HCMV) in vitro. Human embryonic lung fibroblasts were cultured in vitro. The tetrazolium salt (MTS) method was used to detect the effects of Cur on cell viability. The cells were divided into control group, HCMV group, HCMV + (PFA) group and HCMV + Cur group in this study. The cytopathic effect (CPE) of each group was observed by plaque test, then the copy number of HCMV DNA in each group was detected by quantitative polymerase chain reaction (qPCR), and the expression of HCMV proteins in different sequence was detected by Western blot. The results showed that when the concentration of Cur was not higher than 15 μmol/L, there was no significant change in cell growth and viability in the Cur group compared with the control group (P>0.05). After the cells were infected by HCMV for 5 d, the cells began to show CPE, and the number of plaques increased with time. Pretreatment with Cur significantly reduced CPE in a dose-dependent manner. After the cells were infected by HCMV, the DNA copy number and protein expression gradually increased in a time-dependent manner. Pretreatment with Cur significantly inhibited HCMV DNA copies and downregulate HCMV protein expression levels in a concentration-dependent manner, and the difference was statistically significant (P<0.05). In conclusion, Cur may exert anti-HCMV activity by inhibiting the replication of HCMV DNA and down-regulating the expression levels of different sequence proteins of HCMV. This study provides a new experimental basis for the development of anti-HCMV infectious drugs.

引言

人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是一种机会病原体，在人群中具有较高的感染率，可达40%～100%^[1-2]。随着年龄的增加，其感染率逐渐增加。研究表明，30～39岁的成年人其HCMV的感染率为54%，而80岁以上的老年人感染率则达到91%^[3]。一旦该病毒侵入机体，自身免疫系统难以将其完全清除，将长期或终身存在于体内，呈持续性隐性感染或潜伏感染^[4-5]。在机体免疫功能低下时（如感染人类免疫缺陷病毒），或经受过器官骨髓移植以及长期使用免疫抑制剂等特殊人群中，潜伏在体内的HCMV往往容易被激活，继而引起严重的临床症状甚至罹患致死性疾病^[6-8]。而在免疫功能正常的机体中，HCMV感染往往缺乏明显的临床症状，因此通常认为HCMV感染对免疫功能正常的人群没有影响。但是，最近越来越多的研究发现，慢性HCMV感染能够诱导宿主促炎性细胞因子的分泌，同时还可以导致T细胞免疫衰老^[9]，其在健康人群的各种慢性疾病的发病机制中起着重要作用，如动脉粥样硬化、糖尿病、高血压以及炎症性肠病等^[10-13]。此外，HCMV感染还与认知能力下降、功能受损、衰弱的发生密切相关^[14-15]，并导致死亡率增加^[16-17]。因此，慢性HCMV感染在免疫功能正常的人群，尤其是老年人群中的临床意义越来越受到关注和重视。目前美国食品药品监督管理局（food and drug administration，FDA）批准用于HCMV治疗的药物有5种，即更昔洛韦、缬更昔洛韦、膦甲酸钠（phosphonoformic acid，PFA）、西多福韦和福米韦生^[18]，这些药物具有耐药性、肾毒性以及生物利用度低等副作用，而老年人常常伴有肾功能不全，因此寻找新的抗HCMV药物迫在眉睫。来源于植物的化合物由于毒副作用较低，目前已成为抗HCMV药物研究中的热点。姜黄素（curcumin，Cur）是从姜黄的块茎中提取出来的一种疏水性的多酚化合物，为姜黄最主要的活性成分。既往研究发现Cur具有抗炎、抗氧化、抗微生物、抗病毒、抗肿瘤、降血脂、抗动脉粥样硬化以及免疫调节等多种药理活性和生物学作用^[19]，由于其毒副作用小，现已成为研发新药的热点并具有良好的临床应用潜力。研究证实，Cur可以抑制 T 淋巴细胞、B 淋巴细胞和巨噬细胞的活化和增生，以及抗体的产生及淋巴因子的分泌。同时，Cur对急性、亚急性和慢性炎症都有抗炎作用，可以减轻炎性组织中性粒细胞浸润，抑制促炎性细胞因子的产生，如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-8（interleukin-8，IL-8）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）^[20]。目前已尝试将Cur用于炎症性肠病、类风湿关节炎、 哮喘、冠心病、阿尔茨海默病等疾病。Lv等^[21-22]在体内和体外实验均发现Cur能够抑制HCMV的复制，但其具体的实验机制尚不明确。因此，本研究通过体外培养人胚肺成纤维细胞，进一步证实Cur抗HCMV感染活性并探索其相关的分子机制，为寻找新的抗HCMV药物提供实验依据。

1. 材料与方法

1.1. 材料

1.1.1. 细胞与病毒

本实验采用人胚肺成纤维细胞（MRC-5），该细胞为28～32代细胞；HCMV采用Towne病毒株，该细胞和病毒均购自美国国立细胞库公司。

按常规方法将病毒增殖至实验需求量，本实验使用的病毒感染复数（multiply of infection，MOI）为0.02，MOI = 感染性病毒量/细胞数。

1.1.2. 药物

Cur购自Sigma公司。根据说明书配制，配制方法：先用1.357 mL的二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解10 mg的Cur粉末配成20 mmol/L的储存液。使用前加入等量体积的无水乙醇配成10 mmol/L的Cur溶液，根据实验需要，再进一步配制成所需浓度，现配现用。PFA购自Sigma公司，本研究使用的浓度为5 μmol/L。

1.1.3. 主要试剂

杜尔贝科改良培养基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）、胎牛血清、磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）、青霉素、链霉素、谷氨酰胺、胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）、滤纸膜购自美国Millipore公司；增强型化学发光试剂（enhanced chemiluminescence，ECL）显影剂、辣根过氧化物酶购自美国细胞信号技术（Cell Signaling Technology，CST）公司； DMSO购自美国Sigma公司；3-（4, 5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺基苯基）-2H-四唑内盐[3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)- 2H-tetrazolium, inner salt, MTS]细胞增殖与细胞毒性检测试剂盒购自美国Promega公司；DNA提取试剂盒、定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction, qPCR）超混合液与试剂盒购自美国QIAGEN公司；即刻早期（immediate early，IE）基因编码蛋白2（IE2）、长独特序列（unique long，UL） 44（UL44）、UL99抗体购自美国Abcam公司等。

1.1.4. 主要仪器

倒置相差显微镜（TS2，尼康公司，日本）、二氧化碳培养箱（Forma Steri-Cycle 371，赛默飞世尔公司，美国）、高速冷冻离心机（ST16R，赛默飞世尔公司，德国）、台式离心机（Legend Micro 17R，赛默飞世尔公司，美国)、荧光细胞分析仪（Countstar Rigel S2，上海睿钰公司，中国），蛋白垂直电泳仪（165-8033，伯乐公司，美国）、超微量分光光度计（Nanodrop 2000，赛默飞世尔公司，美国）、荧光qPCR仪（Quantistudio 3，赛默飞世尔公司，美国）、酶标仪（epoch 2，伯腾公司，美国）等。

1.2. 方法

1.2.1. MTS法检测Cur对 MRC-5细胞活力的影响

取对数生长期的MRC-5细胞，按每孔5×10³个细胞（体积100 μL）接种于96孔培养板中进行培养。培养24 h后去除培养基，更换含不同浓度Cur（5、8、10、12、15、18、20 μmol/L）的培养基，每个浓度设置3个平行孔，同时设置空白孔（无细胞，只加培养基）和对照孔（有细胞，不加Cur）；培养48 h后，每孔加入20 μL的MTS溶液（5 mg/mL），继续于培养箱中培养4 h；在490 nm处测定各孔的光密度（optical density，OD）值。重复3次实验，取各孔OD值的平均数，计算细胞活力。细胞活力 = ［（加药细胞OD值 − 空白孔OD值）/（对照孔OD值 − 空白孔OD值）］ × 100%。

1.2.2. 蚀斑实验

取对数生长期的MRC-5细胞，培养24 h后，向各孔中分别加入不同浓度的Cur（8、10、12、15 μmol/L），作用2 h后，接种HCMV，同时设有对照组（只有细胞，不加Cur和HCMV）、HCMV组（不加Cur，只加HCMV）和阳性对照组即HCMV+PFA组（加入PFA和HCMV），培养7 d后，去除培养基，PBS清洗1次，加入2%的多聚甲醛固定1 h，然后PBS清洗1次，加入亚甲基蓝溶液染色5 min，用PBS清洗2次，在显微镜下观察各组蚀斑形成单位（plaque forming unit, PFU）的个数。

1.2.3. qPCR检测各组HCMV DNA的复制数

本实验分为以下几个组：① HCMV组：不进行Cur预处理，直接接种HCMV；② HCMV+Cur（8 μmol/L）组：浓度为8 μmol/L的Cur预处理2 h后接种HCMV；③ HCMV+Cur（10 μmol/L）组：浓度为10 μmol/L的Cur预处理2 h后接种HCMV；④ HCMV+Cur（12 μmol/L）组：浓度为12 μmol/L的Cur预处理2 h后接种HCMV；⑤ HCMV+Cur（15 μmol/L）组：浓度为15 μmol/L的Cur预处理2 h后接种HCMV；⑥ HCMV+PFA组：浓度为5 μmol/L的PFA预处理2 h后接种HCMV。上述各组细胞培养至72 h和96 h，收集细胞。采用DNA提取试剂盒提取各组DNA；然后测定各组DNA浓度，将不同的DNA样品稀释成相同浓度；最后进行qPCR。

本文以HCMV UL123基因为模板设计并合成引物，上游引物：5′-TCTGCCAGGACATCTTTCTC-3′，下游引物：5′-GTGACCAAGGCCACGACGTT-3′。在此基础上进行qPCR扩增，反应体系包括：qPCR超混合液10 μL、上游引物+下游引物各0.5 μL、不含DNA酶/RNA酶的蒸馏水4 μL以及DNA 5 μL，总体积为20 μL。反应条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；一共40个循环。扩增结束后，导出结果，分析不同组别HCMV的DNA拷贝数。

1.2.4. 蛋白免疫印迹检测各组HCMV蛋白的表达

本实验分为以下几个组：① 对照组：不进行Cur预处理，不接种HCMV；② HCMV组：不进行Cur预处理，直接接种HCMV；③ HCMV+Cur（10 μmol/L）组：浓度为10 μmol/L的Cur预处理2 h后接种HCMV；④ HCMV+Cur（12 μmol/L）组：浓度为12 μmol/L的Cur预处理2 h后接种HCMV；⑤ HCMV+Cur（15 μmol/L）组：浓度为15 μmol/L的Cur预处理2 h后接种HCMV。培养72 h后，收集细胞。常规提取各组细胞的总蛋白，测定蛋白浓度，蛋白免疫印迹检测HCMV各期蛋白（IE2、UL44、UL99）的表达情况，ECL发光试剂进行荧光显色。将胶片扫描后，计算出条带灰度值，并以β-actin为内参进行校正。

1.3. 统计学方法

本研究采用统计产品与服务解决方案软件SPSS（19.0, SPSS Inc., 美国）进行统计学处理。计量资料采用均数±标准差表示；组间比较采用学生t检验；P<0.05表示差异具有统计学意义。

2. 结果

2.1. Cur对MRC-5细胞活力的影响

如图1所示，当Cur的浓度为18 μmol/L和20 μmol/L时，MRC-5细胞的活力与对照孔相比，受到明显的抑制，差异具有统计学意义（P<0.05）。当Cur的浓度小于等于15 μmol/L时，与对照孔相比，细胞活力及增殖没有明显变化，且与时间的长短没有明显相关性，差异不具有统计学意义（P>0.05）。因此，在本研究的后续实验中，所使用的Cur的最大浓度均为15 μmol/L。

图 1.

Effect of Cur on viability of MRC-5 cells *P < 0.05

Cur对MRC-5细胞活力的影响 *P < 0.05

2.2. Cur对HCMV感染细胞形态学的影响

如图2所示，与对照组相比，HCMV组细胞在感染病毒8 d后细胞几乎全部裂解。HCMV+PFA组的细胞几乎没有裂解。用不同浓度的Cur预处理2 h后，发现在一定浓度范围内，随着Cur浓度的增加，蚀斑数量明显减少，HCMV+Cur（15 μmol/L）组细胞形态基本正常，无明显蚀斑和细胞溶解，与HCMV+PFA组的细胞形态类似。

图 2.

Effect of Cur on cytopathic effect caused by HCMV infection（8 d）

Cur对HCMV感染引起的细胞病变的影响(8 d)

2.3. Cur对HCMV的DNA复制数的影响

采用qPCR方法测定HCMV的DNA拷贝数。本文以HCMV的UL123基因为模板，设计并合成引物。MRC-5细胞接种HCMV 72 h和96 h后收集细胞。如图3所示，随着时间的增加，各组HCMV的DNA拷贝数均增加。经PFA预处理后，HCMV的DNA拷贝数显著减少，差异具有统计学意义（P<0.05）。经Cur预处理后，病毒DNA拷贝数虽然高于HCMV+PFA组，但低于HCMV组，且呈浓度依赖性，差异具有统计学意义（P<0.05）。

图 3.

Effect of Cur on DNA copies of HCMV *P < 0.05

Cur对HCMV DNA载量的影响 *P < 0.05

2.4. Cur对HCMV蛋白表达的影响

HCMV基因组的转录和表达具有明显的时序性，依次为IE、早期（Early，E）和晚期（Late，L）基因，参与病毒复制、转录、翻译及调控等作用。IE基因代表感染早期，是原发或再次感染后最先表达的基因，主要调节宿主细胞基因复制与表达。E基因主要编码HCMV的非结构蛋白，L基因主要合成病毒的结构蛋白，如衣壳、被膜和包膜蛋白。IE2、UL44和UL99分别属于IE、E和L基因所编码的蛋白。本研究发现MRC-5细胞感染HCMV 72 h后，三种HCMV蛋白（IE2、UL44、UL99）均已表达，且最先表达的IE2蛋白含量最多，最晚表达的UL99蛋白含量最少。如图4所示，经Cur预处理后，三种蛋白的表达量均显著降低，且呈浓度依赖性，差异具有统计学意义（P<0.05）。

图 4.

Effect of Cur on protein expression of HCMV

Cur对HCMV蛋白表达的影响

^*P < 0.05

^*P < 0.05

3. 讨论

既往研究发现Cur具有抗肿瘤、抗氧化、抗微生物、抗肿瘤、降血脂以及抗动脉粥样硬化等多种药理活性和生物学作用^[19]。大量研究证实，Cur直接与多种信号生物分子相互作用，具有治疗多种炎症和感染性疾病的潜能。现已发现其可在癌症、关节炎、心血管疾病、神经退行性疾病、炎症性肠病、口腔扁平苔癣、白癜风、牛皮癣、肾脏疾病、动脉粥样硬化及糖尿病等疾病中起作用^[23]。此外，研究还发现，Cur具有抑制某些人类病毒的感染活性，如丙型肝炎病毒 （hepatitis C virus，HCV）、柯萨奇病毒、人乳头瘤病毒 （human papilloma viruses，HPV）、流感病毒等，其共同的抗病毒机制主要包括：减少病毒DNA/RNA表达、蛋白质合成，以及降低病毒滴度；诱导细胞凋亡和细胞病变；抑制磷脂酰肌醇-3激酶/苏氨酸激酶/核因子-κB信号通路、降低局部炎性细胞因子的表达等^[24-28]。

近年来，研究发现HCMV除了在免疫功能低下患者中引起严重的临床症状和导致新生儿畸形与生长阻滞以外，也是引起老年人群发生衰老疾病的主要原因。2012年，Lv等^[21]通过体外实验首次发现Cur能够显著降低HCMV DNA的病毒载量，从而达到抗HCMV活性。Cur抗HCMV活性的机制很复杂，一方面Cur通过直接抑制HCMV的复制减轻细胞组织的损伤；另一方面，它通过抑制感染HCMV细胞凋亡而发挥保护作用。研究人员进一步发现Cur抗HCMV活性可能是改变宿主细胞微环境，如减少IL-6、TNF-α的分泌，抑制HCMV抗原（IE和UL83抗原）的表达^[29]。动物实验表明，Cur能够减少HCMV免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）水平和DNA载量，在受感染的小鼠中，降低血清天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、肌酸激酶、乳酸脱氢酶、TNF-α和IL-6水平，同时也抑制丙二醛含量和上调超氧化物歧化酶和谷胱甘肽水平。此外，还可以预防感染小鼠的心、肺、肝、肾组织发生病变^[22]。

本研究通过MRC-5细胞的体外培养，建立HCMV感染模型，观察Cur对感染HCMV细胞的保护作用。首先，采用MTS方法检测Cur对MRC-5细胞活力和细胞毒性的影响。按照Cur（10、20、30、40、50 μmol/L）的药物浓度梯度进行检测，发现当Cur在20 μmol/L及以上浓度时，对细胞生长产生严重抑制作用。因此，本研究缩小浓度范围，选择不同浓度的Cur（5、8、10、12、15、18、20 μmol/L）继续检测其对细胞活力的影响。结果发现Cur浓度小于等于15 μmol/L时，与对照孔相比，细胞增殖没有受到影响。因此本实验使用Cur的最大浓度为15 μmol/L。接着，本研究采用蚀斑实验直观地观察Cur对HCMV的影响，并且采用FDA批准用于抗HCMV的PFA作为阳性对照组，结果发现MRC-5细胞感染HCMV的5 d后，开始出现蚀斑，随着时间的延长，蚀斑数量逐渐增多；感染8 d后，细胞全部裂解。用不同浓度的Cur预处理2 h后，各组蚀斑数量有所减少，且呈浓度依赖性。HCMV+Cur（15 μmol/L）组与HCMV+PFA组的细胞形态类似，从形态学上表明Cur能够抑制HCMV的侵袭，有效减少蚀斑个数和细胞病变效应。然后，本研究进一步采用qPCR和蛋白免疫印迹方法分别检测Cur对HCMV的DNA拷贝数和HCMV蛋白表达的影响。HCMV进入宿主细胞后，病毒基因的表达分为IE、E和L三个阶段。IE基因编码调控蛋白，主要包括由UL122和UL123基因编码的IE2和IE1两种磷酸化蛋白。IE2蛋白在反馈抑制HCMV的IE基因启动子和激活早期基因启动子方面起主要作用，而IE1能激活IE基因启动子并协助IE2的反式激活。若阻断IE基因的表达，HCMV基因组将无法进行复制，因此可将IE基因作为抗病毒药物的一个重要作用靶点。本研究以UL123基因作为模板，设计并合成相关引物序列检测HCMV的DNA拷贝数。研究发现，随着时间的延长，病毒DNA拷贝数逐渐增多，经过PFA和不同浓度Cur预处理后，病毒DNA拷贝数明显低于HCMV组，虽然PFA抑制HCMV的DNA比Cur更加显著，但Cur也能够抑制病毒DNA的复制，且呈浓度依赖性。E基因的表达是在HCMV基因组合成之前，依赖于IE基因表达产物的存在，主要合成一些促使进入宿主细胞有利于病毒DNA复制。而L基因的表达需要病毒基因组的复制，并依赖于IE或E基因表达产物的激活，主要编码病毒结构蛋白、包膜糖蛋白以及皮层蛋白等^[30-31]。本研究检测了细胞在感染HCMV的72 h后，三种不同时期基因所编码的蛋白表达情况，发现细胞在感染72 h后，HCMV不同时期（IE期、E期和L期）的蛋白（IE2、UL44、UL99）均已表达，且最先表达的IE2的量最高，最晚表达的UL99的量最低，进一步表明HCMV的基因表达具有时序性。经过Cur干预后，三种蛋白的表达水平均显著下降，且呈浓度依赖性，表明Cur能够抑制HCMV不同时序蛋白的表达。尽管既往有研究表明，Cur具有抗HCMV的活性，但都只是从单一角度进行描述。本研究从细胞形态学变化、病毒DNA拷贝数以及HCMV各时序蛋白表达等多方面进一步证实Cur可以通过抑制病毒复制和下调各个时序蛋白的表达发挥抗HCMV活性。

综上所述，本研究利用MRC-5细胞作为HCMV感染的体外模型，证实了Cur作为一种潜在抗病毒药物对抑制HCMV感染具有良好的应用前景，其抗HCMV感染可能是通过抑制HCMV的DNA的复制和下调HCMV不同时序蛋白的表达水平而实现的。该结果为临床使用Cur治疗HCMV感染性疾病提供了实验依据。此外，Cur是否还通过其他作用靶点或分子机制抗HCMV仍不清楚，因此Cur抗HCMV活性还需要进一步研究明确。

重要声明

利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：冷晓主要负责平台搭建、实验指导与安排、论文审阅修订；丁香主要负责实验操作、数据记录与分析、论文撰写；岳冀蓉主要负责数据管理与分析指导；董碧容主要负责实验协调沟通、论文审阅修订。

Funding Statement

国家自然科学基金资助项目（82001482）

National Natural Science Foundation of China