聚天冬氨酸－多巴胺接枝聚合物－铁（Ⅲ）配合物用于磁共振可视化光热治疗剂

Abstract

This study aims to explore the potential of polyaspartic acid grafted dopamine copolymer (PAsp-g-DA) chelated Fe³⁺ for magnetic resonance imaging (MRI) visual photothermal therapy. Polyaspartic acid grafted copolymer of covalently grafted dopamine and polyethylene glycol (PAsp-g-DA/PEG) was obtained by the ammonolysis reaction of poly succinimide (PSI), and then chelated with Fe³⁺ in aqueous solution. The relaxivity in vitro, magnetic resonance imaging enhancement in vivo and photothermal conversion effect at 808 nm were investigated. The results showed that polymeric iron coordination had good near-infrared absorption and photothermal conversion properties, good magnetic resonance enhancement effect, and good longitudinal relaxation efficiency under different magnetic field intensities. In summary, this study provides a new magnetic resonance visual photothermal therapeutic agent and a new research idea for the research in related fields.

引言

癌症是人类普遍关注的一种疾病，其治疗方法主要是手术、放疗和化疗，但因副作用大导致总体治疗效果并不理想^[1-2]。光热疗法是一种新兴的癌症治疗方法，肿瘤组织摄取光热转换剂将激光能量转换为热能，从而杀死癌细胞，实现癌症微创治疗^[3]。但是，光热转换剂是否被肿瘤组织有效摄取及其在肿瘤组织中的富集时间和代谢情况都是影响光热治疗效果和制定治疗计划的关键参数。因此，急需一种无创的医学影像手段实时观察治疗剂在肿瘤组织的分布与代谢。磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）因其无电离辐射以及软组织对比度和图像分辨率高而广泛应用于临床医学影像诊断领域。磁共振成像造影剂可改变局部组织磁共振成像信号，被广泛用于细胞、基因或药物载体的磁共振成像标记和生物体内可视化研究^[4-7]。本文旨在设计和制备一种具有磁共振对比增强效果的光热转换剂——磁共振可视化的光热治疗剂。大量文献报道^[8-10]，聚多巴胺具有较好的光热转换效率，被广泛用于光热治疗研究，同时聚多巴胺可与顺磁性金属离子螯合用于磁共振造影剂。但是多巴胺（dopamine，DA）的聚合物机制较复杂，较难实现可控聚合，且多巴胺聚合物成分复杂，很难实现转化应用，通常获得粒径较大的聚多巴胺微球。聚天冬氨酸是一种类似多肽（具有良好生物相容性）的高分子材料，在体内具有可降解、毒副作用小等特点。将多巴胺接枝修饰到聚天冬氨酸上可获得类似聚多巴胺的结构和功能。另外，聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）具有良好生物相容性，可在生物体内形成水合保护层，阻止蛋白吸附，在材料表面修饰PEG可提高其在体内的稳定性。因此，本文以聚天冬氨酸为骨架，部分接枝多巴胺和聚乙二醇，并螯合顺磁性三价铁离子获得聚天冬氨酸－多巴胺接枝聚合物－铁（Ⅲ）配合物，通过研究其弛豫效能、近红外光吸收、光热转换及动物体内磁共振成像效果等性能，探讨其在磁共振可视化光热治疗中的应用潜力。

1. 材料与方法

1.1. 聚天冬氨酸－多巴胺/聚乙二醇接枝聚合物的合成

称取0.5 g聚琥珀酰亚胺（poly succinimide，PSI，分子量7 000 Da）和0.5 g端氨基聚乙二醇（amine-terminated polyethylene glycol，PEG-NH₂，分子量550 Da）置于反应瓶中，加入二甲基亚砜充分溶解。再称取0.25 g多巴胺盐酸盐，用1 mL二甲基亚砜和0.2 mL三乙胺溶解后，在氩气保护下一并加入到反应瓶中。在80 ℃下搅拌反应24 h，加入0.2 g氢氧化钠和3 mL水，60 ℃下继续反应24 h。用0.1 mol/L盐酸调节pH至6.0，将反应溶液置于透析袋（截留分子量：3 500 Da）中，透析 24 h。收集透析袋中溶液，冻干得到聚天冬氨酸－多巴胺/聚乙二醇接枝聚合物（polyaspartic acid grafted dopamine and polyethylene glycol，PAsp-g-DA/PEG）。

1.2. 聚天冬氨酸－多巴胺/聚乙二醇接枝聚合物－铁（Ⅲ）配合物制备

将100 mg PAsp-g-DA/PEG溶解在100 mL超纯水中，将0.507 mL的FeCl₃溶液（Fe：85.5 mmol/L）加入到PAsp-g-DA/PEG溶液中，用0.5 mmol/L的NaOH调节pH至7.0，冻干后用少量水溶解，透析48 h，得到聚天冬氨酸－多巴胺/聚乙二醇接枝聚合物－铁（Ⅲ）配合物（polyaspartic acid grafted dopamine，Fe³⁺ and polyethylene glycol，PAsp-DAFe/PEG）溶液。取一定量的PAsp-DAFe/PEG溶液，经浓硝酸分解后用超纯水稀释至标样浓度范围，通过原子吸收光谱检测溶液中铁浓度。

1.3. 主要仪器和设备

0.5 T核磁共振造影剂弛豫率分析仪（PQ001-20-015V，上海纽迈电子科技有限公司，中国），1.41 T小核磁分析仪（minispec mq60，布鲁克（北京）科技有限公司，中国），3.0 T磁共振成像系统（Discovery MR750，GE公司，美国），大鼠专用线圈（Animalcoil WK601，Magtron，美国)，400 MHz高分辨魔角旋转探头（BRUKER 4 mm DUI，布鲁克拜厄斯宾有限公司，瑞士），紫外可见分光光度计（UV-1900i，日本岛津仪器有限公司），光纤耦合激光系统（VCLHLGD0024991，北京宏蓝光电科技有限公司，中国），红外热像仪（Fotric226s，青岛科创贸易有限公司，中国），呼吸麻醉机（MatrxVME2，Midmark，美国)，皖仪原子吸收光谱仪（WYS2000，安徽皖仪科技股份有限公司，中国）。

1.4. 实验动物

实验动物为健康SD大鼠3只，无疾病史，年龄4～8周，体重110～150 g，均购于川北医学院实验动物中心。动物实验许可证编号：SYXK（川）2018-076。用呼吸麻醉机对大鼠进行异氟烷吸入性麻醉，将大鼠尾巴清洗干净，置于大鼠专用线圈中，经尾静脉注射PAsp-DAFe/PEG，在GE3.0 T磁共振成像系统中对大鼠进行核磁共振扫描。本项目实验研究符合《赫尔辛基宣言》的原则。

1.5. 弛豫效能测试

柠檬酸铁溶液经HEPES缓冲溶液（100 mmol/L，pH=7.4）稀释至铁浓度0.10、0.19、0.30、0.40、0.51 mmol/L，PAsp-DAFe/PEG溶液经磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液，10 mmol/L，pH=7.4）稀释至铁浓度0.12、0.24、0.48、0.97、1.94 mmol/L，置于测试瓶中，室温下(25 ℃)分别采用0.5 T弛豫率分析仪、1.41 T小核磁分析仪、临床3.0 T磁共振成像系统测定T₁弛豫效能（r₁）和T₂弛豫效能（r₂）。

1.6. 紫外－可见光吸收光谱

分别取少量PAsp-g-DA/PEG、PAsp-DAFe/PEG溶液于比色皿中，加入PBS缓冲液，稀释到0.5 mg/mL（聚合物浓度），以PBS溶液为对照，进行紫外吸收光谱测定，平行测定两次取其一。

1.7. 光热转换

分别取PBS、PAsp-g-DA/PEG溶液及不同多巴胺浓度的PAsp-DAFe/PEG溶液各1 mL于EP管中，用808 nm近红外激光（光功率密度：5 W/cm²）照射每个EP管中的溶液，持续10 min，并用红外热像仪记录每1 min溶液温度变化。选取多巴胺浓度1.3 mmol/L的PAsp-DAFe/PEG溶液予以近红外光照射10 min，然后停止照射15 min，持续循环4次，并在该过程中记录每1 min温度变化。

1.8. 大鼠体内磁共振增强成像

整个扫描过程均使用呼吸麻醉机给予大鼠异氟烷持续吸入性麻醉（麻醉浓度1%～2%，氧流量800～1 500 mL/min）。将麻醉下的大鼠放入GE3.0 T磁共振大鼠专用线圈中，俯卧位，头先进，行平扫和增强扫描。平扫和增强扫描均采用如下序列和参数：T₁加权成像（T₁-weighted imaging，T₁WI），重复时间 = 6 ms，回波时间 = 3 ms，层厚 = 0.8 mm，视野 = 120 mm × 120 mm，激励次数 = 2～3。在完成冠状位平扫后尾静脉注射PAsp-DAFe/PEG（Fe：2.5 mg/kg剂量）以0.1 mL/s的速率推入，进行增强扫描，序列同平扫，于不同时间点对大鼠体部行磁共振扫描。在此基础上测量在不同时间点肝脏、肾脏同一层面的信号强度变化，分析该造影剂在大鼠体内的增强效果及代谢情况。

2. 结 果

2.1. PAsp-g-DA/PEG合成与表征

本文以PSI为原料，通过其氨解反应获得了共价接枝多巴胺和聚乙二醇的聚天冬氨酸接枝聚合物PAsp-g-DA/PEG。实验中对原料和产物进行了¹H核磁谱表征，结果如图1所示。PAsp-g-DA/PEG谱图中增加了多巴胺苯环特征峰（峰3、4、5）和聚乙二醇特征峰（峰6、7），证明多巴胺和聚乙二醇成功共价接枝到聚天冬氨酸侧链上。通过对聚天冬氨酸、多巴胺和聚乙二醇特征峰进行积分，计算得本批次产物的多巴胺接枝率约为30%，聚乙二醇接枝率约为15%。多巴胺和聚乙二醇的接枝率可通过调节反应投料比以及反应温度进行有效控制。

图 1.

¹H NMR spectra and characteristic peak labeling of PSI (DMSO) and PAsp-g-DA/PEG (D₂O)

PSI（DMSO）和PAsp-g-DA/PEG（D₂O）的¹H核磁谱图及特征峰标注

2.2. PAsp-DAFe/PEG弛豫效能的表征

实验首先测试了不同浓度样品的纵向和横向弛豫时间（Ti，i = 1或2），再将其倒数（1/Ti）与铁离子浓度（C_Fe）做曲线，曲线的斜率即是造影剂的纵向和横向弛豫效能（r_i，i = 1或2）。实验中分别在0.5 T弛豫率分析仪、1.41 T小核磁分析仪和3.0 T磁共振成像系统下测试了PAsp-DAFe/PEG的r₁和r₂，并以柠檬酸铁作为对照（见表1）。结果显示，柠檬酸铁溶液在0.5～3.0 T下弛豫效能较低。根据文献推测柠檬酸铁可能难以应用于临床磁共振增强成像^[11]。相同磁场强度下PAsp-DAFe/PEG的r₁明显高于柠檬酸铁，并且r₂/r₁更低，是一种良好的T₁磁共振造影剂。

表 1. T₁ and T₂ relaxation efficiency of samples (r₁ and r₂ units: Fe mmol⁻¹·L· s⁻¹).

样品的T₁、T₂弛豫效能（r₁、r₂单位：Fe mmol⁻¹·L· s⁻¹）

样品	0.5 T				1.41 T				3.0 T
	r 1	r 2	r2/r1		r 1	r 2	r2/r1		r 1	r 2	r2/r1
柠檬酸铁	0.91	2.16	2.37		0.73	2.80	3.83		0.84	4.33	5.15
PAsp-DAFe/PEG	2.12	2.46	1.16		2.22	2.81	1.27		2.70	2.99	1.11

2.3. 紫外－可见光吸收光谱

分别将少量PAsp-g-DA/PEG和PAsp-DAFe/PEG均匀分散在PBS溶液中，进行吸光度测试，研究其紫外－可见光吸收性能。结果如图2所示。图2中很明显地观察到两种物质在波长220～900 nm间有典型的吸收带，其中300～900 nm间PAsp-DAFe/PEG的吸收值始终高于PAsp-g-DA/PEG，而PAsp-g-DA/PEG在300 nm左右表现出较好的吸收峰，并且展示了两者在近红外光波长区域中的吸收性能，结果显示，PAsp-DAFe/PEG具有更加明显的近红外光吸收。

图 2.

Ultraviolet -visible absorption spectra

紫外－可见光吸收光谱图

2.4. 光热转换

与同类研究^[12]相似，本文以波长808 nm、光功率密度为5 W/cm²的近红外激光作为光源，考察不同浓度PAsp-DAFe/PEG水溶液在近红外激光照射下温度随时间的变化。温度变化曲线如图3a所示，DA浓度为0.26 mmol/L的PAsp-DAFe/PEG溶液10 min内温度从26 ℃升至38.5 ℃。随着样品浓度增加，溶液的温度也随之提高，当DA浓度达到1.30 mmol/L时溶液10 min内温度上升至57.6 ℃，超过了癌细胞的耐受温度（50 ℃）^[13]。在相同条件下对照组PAsp-g-DA/PEG温度仅升高至32 ℃，PBS水溶液温度仅升高至29.8 ℃，说明PAsp-g-DA/PEG与Fe³⁺螯合后大大增加了聚合物的光热转换能力。图3b为PAsp-DAFe/PEG（DA：1.30 mmol/L）水溶液反复经过近红外光照射（10 min）然后停止照射（15 min）持续循环4次的温度随时间变化的曲线，结果显示每次循环曲线基本一致且温度均能达到第一次照射时所达到的最高温度，说明PAsp-DAFe/PEG具有良好的光热稳定性。图3c为808 nm近红外激光照射10 min的热成像图，直观地显示了样品在808 nm近红外激光照射下温度的变化和分布。

图 3.

Photothermal conversion and stability of PAsp-DAFe/PEG

PAsp-DAFe/PEG光热转换及稳定性

a. 光热转换示意图；b. 光热稳定性示意图；c. 热成像图。不同浓度的PAsp-DAFe/PEG：① DA：0.26 mmol/L；② DA：0.65 mmol/L；③ DA：1.30 mmol/L

a. schematic diagram of photothermal conversion; b. schematic diagram of photothermal stability; c. diagram of thermal image. Different concentrations of PAsp-DAFe/PEG: ① DA: 0.26 mmol/L; ② DA: 0.65 mmol/L; ③ DA: 1.30 mmol/L

2.5. 大鼠体内磁共振增强成像

图4为尾静脉注射PAsp-DAFe/PEG前和注射后1、10、20、30、1 440、2 880 min行磁共振扫描采集的肾脏和肝脏动态增强图像。PAsp-DAFe/PEG可通过血液循环分散在大鼠体内，并可能富集于某些器官，本研究经过信号强度对比分析，检测了组织富集及信号改变情况。图4a中可观察到大鼠在增强前肝脏和肾脏呈低信号，在造影剂注射完成后直接行磁共振扫描，肝肾的亮度均高于增强前的水平。图4b可观察到肝脏信号值在1 min达到最高，在1 min到24 h的信号强度逐渐降低，但始终高于增强前肾脏信号强度，直到48 h后信号强度恢复到增强前水平；肾脏信号值在1 min达到最高，然后信号强度逐渐降低，在48 h其信号强度降至增强前水平。结果说明PAsp-DAFe/PEG具有较好的体内增强成像效果，可通过肾脏较快排泄，少量残留体内经过48 h逐渐代谢完全。

图 4.

Liver and kidney magnetic resonance imaging and signal intensity changes in rats

大鼠肝、肾磁共振成像和信号强度变化

a. 3.0 T磁共振T₁WI扫描大鼠肝、肾图像；b. 大鼠肝、肾信号强度变化

a. T₁ weighted magnetic resonance imaging of liver and kidney in rats at 3.0 T; b. changes of signal intensity of liver and kidney in rats

3. 讨论

本文设计和制备了一种以聚天冬氨酸为骨架，接枝修饰多巴胺和聚乙二醇的接枝聚合物配体PAsp-g-DA/PEG，并螯合顺磁性Fe³⁺，研究其作为磁共振可视化光热转换剂的潜力^[14]。磁共振可视化的光热治疗剂应同时具有良好的磁共振成像增强效果和较高的光热转换效率。药物通过静脉注射进入体内后，一方面，具有良好的磁共振成像增强效果才能有效示踪药物体内分布，通过磁共振信号变化有效观察在病变组织的聚集与代谢情况；另一方面，具有较高的光热转换效率，才能保证将近红外激光转换为足够的热量杀死肿瘤细胞。磁共振成像中，弛豫效能是评价造影剂产生对比增强效果的重要指标^[15-16]，本文选择临床常用磁场（0.5 T、1.5 T和3.0 T）测试了PAsp-DAFe/PEG的T₁和T₂弛豫效能（r₁和r₂）。结果显示PAsp-DAFe/PEG的r₁在2~3 mmol^-1·L·s⁻¹，明显高于Fe³⁺（实验中以柠檬酸铁溶液为对照），接近于临床用钆剂^[17]，具有良好的磁共振T₁造影增强效果。在临床3.0 T磁共振的大鼠成像实验中，通过尾静脉注射PAsp-DAFe/PEG，大鼠肝脏和肾脏T₁加权图像呈现出良好的对比增强效果，磁共振信号明显增高，随后逐渐降低，48 h后肝肾器官的信号值恢复到正常水平，造影剂基本被代谢掉。光热转换方面，实验测试了PAsp-DAFe/PEG紫外－可见光吸收波谱和808 nm近红外激光下的光热效应。紫外－可见光吸收波谱显示，PAsp-DAFe/PEG在280 nm和600 nm波长处出现两个较大吸收峰。在近红外光区域PAsp-DAFe/PEG比PAsp-g-DA/PEG表现出更强的吸收。从电子转移角度分析，Fe³⁺是一种高氧化态的过渡金属离子，具有未充满的d轨道，可以作为电子接受体；聚合物中含有多巴胺分子，多巴胺分子结构中含有很多邻苯二酚结构（可氧化性配体），可以作为电子给予体。因此，Fe³⁺与邻苯二酚结构发生氧化还原，随Fe³⁺还原能力增强，电荷转移吸收带向长波长移动。Fe³⁺具强氧化能力，颜色加深，螯合铁离子后的共聚物在近红外光区域的吸光度更高^[18]。近红外激光具有一定的生物组织穿透效果^[19]，近红外光热治疗剂更具发展优势。从808 nm近红外激光下的光热曲线可以看出，当DA浓度为1.3 mmol/L时PAsp-DAFe/PEG溶液在10 min内温度可升至57.6 ℃，产生较好的加热效果。在肿瘤热疗过程中，肿瘤组织温度达到41～46 ℃即会刺激机体产生免疫应答，对肿瘤细胞发挥非特异性的杀伤作用^[20-22]。因此，PAsp-DAFe/PEG既是一种良好的磁共振造影剂，也是具有很大潜力的近红外光热治疗剂，有望在磁共振可视化的光热治疗中发挥巨大作用。

Fe³⁺为一种顺磁性金属离子，是生物体内的一种必需元素，生物安全性高于临床中常用的钆造影剂，但弛豫效率较低^[23]，提高其在磁共振增强成像中的组织对比度是一项重大的挑战。多巴胺上的邻苯二酚结构对Fe³⁺具有较高的螯合能力，该特性已在生物体和仿生系统中得到了广泛应用^[24-25]。聚多巴胺与生物体内黑色素相似，具有较好的光热转换效果，近年来广泛用于光热转换剂研究。聚天冬氨酸是一种生物降解性好、安全无毒的氨基酸聚合物，被广泛用于环境、卫生、农业、日化等领域，是一种较理想的药物载体。将多巴胺接枝到聚天冬氨酸上同样可以获得类似聚多巴胺结构，聚合物上的多价邻苯二酚基团可有效螯合Fe³⁺同时获得磁共振造影和光热转换效果。聚天冬氨酸侧链上含有大量羧基，未接枝多巴胺的游离羧基可进一步修饰活性分子，实现聚合物的多功能化。本文修饰了具有良好生物相容性的聚乙二醇，以增加其在血液循环中的稳定性^[26]。聚天冬氨酸侧链的羧基可与带氨基的分子通过缩合方式化合链接，但往往反应活性较低，不能获得较高的接枝率。本文选择了聚天冬氨酸的前体聚琥珀酰亚胺为原料，与多巴胺、端氨基聚乙二醇氨解，一步获得接枝多巴胺和聚乙二醇的聚天冬氨酸接枝聚合物。实验结果显示该制备方法接枝效率高且接枝率可通过投料比调节。

本研究证实了该配合物在磁共振可视化的条件下进行光热治疗的潜力，但808 nm波长的近红外激光能穿透的组织深度有限，可以考虑应用于较浅部位的癌细胞或肿瘤组织的光热治疗。例如食管癌，可以考虑制作近红外激光－内镜装置，找到食管癌所在的位置后经近红外激光照射治疗或者通过微创手术对处于较深部位的肿瘤组织实施近红外激光照射治疗。

综上所述，本研究设计制备的PAsp-DAFe/PEG具有较好的磁共振增强成像效果和良好的近红外光热转换能力。该聚合物各成分均为生物相容性材料，具有较大的临床转化潜力，可为磁共振可视化光热治疗肿瘤提供新的方法及思路。

重要声明

利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：杜亮参与实验设计、数据收集与分析及论文写作，卢福麟参与数据收集和论文修改，吴昌强参与实验设计与指导工作。

伦理声明：本研究通过了川北医学院伦理委员会的审批（批文编号：[2021]79号）。

Funding Statement

国家自然科学基金（81601490）；南充市市校战略合作科研项目（20SXQT0306）

The National Natural Science Foundation of China