关节软骨表面粗糙度对载荷响应的实验研究

Abstract

软骨表面纤维化是骨关节炎的早期迹象，软骨表面损伤与载荷密切相关。本文目的是研究软骨表面粗糙度与载荷之间的关系，通过对新鲜的猪关节软骨施加冲击、压缩、疲劳载荷，每次间隔10 min测量软骨表面粗糙度数值，获得粗糙度在加载前后的变化规律。实验发现，载荷使软骨表面粗糙度增大，增大的数值与载荷大小相关，粗糙度恢复到初始情况的时间与载荷类型和载荷大小相关，冲击载荷对软骨表面粗糙度影响最大，其次是重度疲劳载荷、压缩载荷和轻度疲劳载荷。本文为揭示早期骨关节炎的发病机制和防治关节软骨疾病提供了参考数据。

引言

骨关节炎在中老年人群中有较高的患病率，但近年来，出现了低龄化发病的趋势^[1]。对运动员的一项研究表明，运动员在日常训练过程中，膝关节损伤是最为常见的，且难以治愈。骨关节炎病变的核心是关节软骨。关节软骨是覆盖在关节表面的致密结缔组织，可以分散关节面的压力负荷，减轻震荡，降低关节面的摩擦系数^[2-4]。软骨的表面损伤与载荷密切相关，过度、持续的负载会导致软骨表面磨损、损伤、退变^[5-7]，进而引发骨关节疾病。

由于分辨率不足，在骨关节炎早期软骨表面的变化很难用医学影像观测到。软骨表面纤维化是骨关节炎的早期迹象^[8]，而软骨的平均粗糙度一定程度上可以反映表面纤维化程度，故有些学者用软骨表面的平均粗糙度来反映关节软骨的病理变化。

Maerz等^[9]采用网格参数化描述关节软骨受到创伤后表面粗糙度（Ra）和软骨厚度的变化，用来评估骨关节炎的退行性变化。Newton等^[10]发现采用平均软骨厚度和体积变化描述关节软骨的轻度退行性改变不敏感，如果采用表面粗糙度作为骨性关节炎的形态指标，可用于关节炎的早期诊断。微观上看，软骨表面有凸起和凹陷，Ihnatouski等^[11]利用原子力显微镜扫描出了关节软骨的亚微米表面形貌，对比了健康软骨和磨损软骨粗糙度的算术平均值和峰值，发现磨损软骨的粗糙度均高于健康软骨。Youssef等^[12]从关节软骨组织的横截面捕捉生物斑点信息，提出了一种基于局部对比度测量的模型，获得了关节软骨表面各截面区域的平均粗糙度。

当关节受到载荷作用时，宏观上观察不到软骨表面的变化，但微观上的变化能揭示软骨在载荷作用下表面损伤的机制和过程。异常应力累积可引发关节软骨的病理变化^[13]，软骨病理变化程度是病变时间的体现。鉴于表面粗糙度变化可以反映软骨的病理变化，尤其适用于早期骨关节炎的诊断，本文采用表面轮廓仪测量了关节软骨在冲击载荷、压缩载荷和疲劳载荷作用下的表面粗糙度，研究载荷类型、载荷大小对软骨表面粗糙度的影响，对揭示早期骨关节炎的发病机制和防治关节软骨疾病具有重要意义。

1. 实验材料及方法

1.1. 实验材料

选取屠宰场新鲜屠宰的6～8月龄猪股骨远端滑车部位。制作出厚度5～8 mm带软骨下骨的试件，如图1所示，并用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）将表面油脂和血细胞冲洗干净。为保证软骨样本的力学性能不受影响，减少实验误差，实验过程中用浸润PBS溶液的纱布包裹试件，各实验均在两小时内完成^[14]。

图 1.

Parts of cartilage specimens

部分软骨试件

1.2. 实验方法

首先，将软骨试件用夹具夹持并安装在表面轮廓仪（Form Talysurf i-Series 5，Taylor Hobson，英国）的夹具台上，使软骨表面处于水平位置，然后调整金刚石探针位置，使探针在软骨试件的左侧，并与软骨表面轻微接触，最后让探针沿着软骨表面从一端移动到另一端，记录探针所走的轮廓。其中，表面轮廓仪见图2a，软骨试件夹持如图2b所示。仪器的水平量程为60 mm，探针驱动速度为0.5 μm/s，分辨率16 nm。实验分别对冲击、压缩、疲劳三种载荷进行分析，每种载荷都分为6个实验条件，每种实验条件下准备3个样本，每个样本选择三处不同位置测量表面粗糙度，得到三条数据采集曲线，对各实验条件下的样本进行同样的测量过程，并取其平均值为最终测量结果。样本分别在加载前、加载后、加载后恢复10、20、30、40 min时间点进行数据采集。

图 2.

Picture of surface profiler measurement

表面轮廓仪测量图片

a. 表面轮廓仪；b. 软骨试件放置示意图

a. surface profiler; b. schematic diagram of cartilage specimen placement

1.3. 加载方案

1.3.1. 冲击加载

实验过程中，采用落锤装置对软骨样本施加冲击载荷。将质量0.5 kg钢块从10 cm的高度落下产生的能量设为实验载荷的下限^[15]，用专用夹具夹持软骨样本，软骨表面与落锤表面平行，将质量0.5 kg的钢块分别从10、15、20、25、30、35 cm的高度落下，由动力学公式 可知软骨样本获得的能量分别为0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75 J。

1.3.2. 压缩加载

为了便于比较载荷类型对软骨表面粗糙度的影响，在压缩载荷实验时，载荷大小与冲击实验时受到的作用力大小一致。根据公式，其中m为落锤的质量， 9.8 m/s²为重力加速度，h为落锤的高度，t为落锤与软骨作用的时间，设置为0.1 s^[16]，样本表面受到的作用力分别为12.07、13.66、15.00、16.80、17.25、18.23 N。软骨压缩实验在电磁式动态力学实验系统（M-100，凯尔测控有限公司，中国）上完成，每次压缩的保荷时间为2 min^[17]。

1.3.3. 疲劳加载

软骨疲劳实验在电子万能疲劳试验系统（EUF-1020，凯尔测控有限公司，中国）上完成。为了防止软骨脱水对力学性能造成影响，实验过程中软骨样本一直浸泡在PBS溶液中。疲劳载荷设定在12~18 N之间，载荷采用三角形波形，频率2 Hz^[15]，循环圈数分别设置为10 000、20 000、30 000、40 000、50 000、60 000次^[7]。

2. 结果

2.1. 冲击载荷对软骨表面粗糙度的影响

图3所示是软骨样本在不同的冲击载荷下表面粗糙度的变化曲线。可以看出，软骨受到冲击载荷后，表面粗糙度会立即发生变化，粗糙度的变化与载荷大小有直接关系，粗糙度随着冲击能量的增大而增大，在0.50 J作用下，软骨表面粗糙度只有轻微的增加；在1.75 J作用下，软骨表面的粗糙度达到初始时的4倍，平均粗糙度达到4.3 μm。软骨样本的表面粗糙度随着恢复时间的增加逐渐降低。当冲击能量较小时，在40 min时能恢复到受载前的状态，当冲击能量较大时，在40 min时不能恢复受载前的初始状态。从图中可以看出，在冲击加载达到1.50～1.75 J时，样本表面的粗糙度几乎没有下降的趋势，软骨表面的磨损无法修复。

图 3.

Changes in surface roughness of articular cartilage under impact loads

关节软骨在冲击载荷下表面粗糙度的变化

2.2. 压缩载荷对软骨表面粗糙度的影响

软骨样本在不同的压缩载荷下表面粗糙度的变化如图4所示。由图可以看出，软骨在不同压缩载荷作用下表面粗糙度的变化趋势一致，载荷作用后，表面粗糙度有轻微增加，粗糙度的峰值不是出现在载荷作用后的时刻，有滞后现象；软骨表面粗糙度在载荷去除后逐渐恢复，恢复到初始时的速度与载荷大小相关，载荷作用小，软骨表面粗糙度值波动较小，恢复到初始时的时间短，载荷作用较大时，软骨表面粗糙度值波动较大，恢复到初始时的时间较长。在18 N的压力下，软骨试件恢复40 min后的粗糙度数值与30 min时测得的数值相差较小，没有恢复到初始状态的趋势，说明已经对软骨表面造成不可逆的损伤。

图 4.

Changes in surface roughness of articular cartilage under compressive loads

关节软骨在压缩载荷作用下表面粗糙度的变化

2.3. 疲劳载荷对软骨表面粗糙度的影响

图5所示是软骨样本在一定载荷范围内进行不同圈数疲劳加载的表面粗糙度变化曲线。表面粗糙度的波动情况与疲劳载荷的大小和作用时长有关，疲劳载荷作用时间越长，软骨试件表面的粗糙度变化越显著，疲劳载荷作用时间越短，粗糙度变化就越为平稳。随着测试时间的增长，软骨表面的粗糙度变化都逐渐趋于缓慢。载荷作用时间短的软骨试件，表面恢复到初始状态的时间短，载荷作用时间较长的软骨试件，表面恢复到初始状态的时间长。当载荷作用次数达到50 000～60 000次时，关节软骨就已达到疲劳状态，恢复40 min后软骨表面的粗糙度与初始时的粗糙度数值仍相差较大，如果加载次数继续增加，软骨表面的粗糙度不能恢复到初始状态，关节软骨表面的磨损会加剧，说明在一定程度上对软骨造成了不可逆转的磨损。

图 5.

Changes in surface roughness of articular cartilage under fatigue loads

关节软骨在疲劳载荷作用下表面粗糙度的变化

3. 讨论

本文用表面轮廓仪研究关节软骨表面粗糙度在不同载荷作用下的变化情况，获得了软骨表面粗糙度与载荷间的变化规律，为早期骨关节炎的发病机制研究提供了重要的数据。

本文选取猪关节软骨为实验样本，分别对软骨样本施加冲击载荷、压缩载荷和疲劳载荷。从实验的数据中可以看出，软骨表面粗糙度对载荷响应比较敏感，用软骨表面粗糙度的变化来表征软骨的力学性能和健康状态是可行的。对比三种加载方式，软骨在载荷作用后，表面粗糙度会有波动，随着载荷消失的时间增加而逐渐恢复，而且软骨表面粗糙度的变化程度受到载荷大小和载荷类型的影响。从图6a可以看出，在同等程度受力大小的情况下，冲击载荷使软骨表面粗糙度增加最明显，峰值增量达到0.8～3.4 μm；疲劳载荷和压缩载荷对软骨表面粗糙度影响波动值相当，粗糙度峰值增量主要在0.2～1.0 μm，但在疲劳载荷和压缩载荷作用下也存在着差异，压缩载荷作用后，由于软骨的蠕变性能，表面粗糙度的峰值有滞后现象。从图6b可以看出，载荷消失40 min后，软骨表面粗糙度减小，低强度疲劳载荷作用时，表面粗糙度回落到加载前状态的时间比压缩载荷和冲击载荷作用情况需要的时间短。从冲击载荷作用的实验结果来看，表面粗糙度的变化规律与Verteramo等^[15]的实验结果一致。

图 6.

Comparison of cartilage surface roughness change

软骨表面粗糙度变化比较

a. 加载后粗糙度增量比较；b. 载荷消失40 min后粗糙度与初始时比较。TEST1~6分别对应每类加载实验中的6个实验组

a. comparison of roughness increment after loading; b. comparison of roughness after load disappears for 40 min with the initial time. TEST1－6 correspond to 6 experimental groups in each type of loading experiments, respectively

关节软骨可以承接关节表面传递的载荷，将应力分散到软骨下骨中，其力学性能的实现主要依靠胶原纤维网格和软骨基质完成。软骨基质主要是由游离的水分子和蛋白多糖组成，蛋白多糖嵌入在胶原纤维网格中^[18]，与胶原纤维网格共同作用抵抗和平衡外部压力。不管在静态还是动态的力学条件下，软骨基质中的大、小分子都是不断扩散的^[19]，施加载荷会使这种扩散加快^[20]。关节软骨也具有一定的亲水性，其在人体组织中维持着一种水分的平衡，软骨内水分含量会影响摩擦性能^[21]，这可能与软骨表面粗糙度变化有直接关系。当载荷作用时，表层的水分快速丢失，使得软骨表面缺少一定的润滑，表面凹凸现象加剧，引起表面粗糙度增加，随着恢复中吸收水分，表面粗糙度逐渐恢复到初始的光滑状态。但当载荷破坏了基质中的成分或是胶原纤维网格的结构时，关节软骨的粗糙度很难恢复到加载前的状态，回弹性变差，关节间摩擦力增大，进而改变了软骨的正常力学环境，导致关节软骨病变。表面粗糙度回落过程中有一次波动现象，可能是基质和胶原网格回弹速度有差异造成的，具体原因还需更先进的实验去验证。

从本文的实验结果来看，冲击载荷对软骨损伤最严重，其次是重度疲劳载荷、压缩载荷和轻度疲劳载荷。这与运动医学结论有相似之处。比如一些竞技体育运动员进行跳跃等高难度的训练时，由于冲击载荷过大易造成软骨损伤而引发骨关节炎^[22-23]；长期高强度的健步走运动易造成软骨损伤^[24]；长时间站立人群，尤其是肥胖患者^[25-27]，也会增加骨关节炎风险。关节软骨在合理的负载区间可以达到锻炼的目的，不同载荷方式对软骨细胞的代谢有不同的影响^[28]，但过度的负载可能会诱发细胞应激衰老^[29]，从而导致骨关节炎疾病。实验结果也显示，运动后需充分休息^[30-32]，轻度运动后需休息30～40 min，大运动量后至少休息60 min以上。Dreiner等^[33]基于宇航员在太空微重力环境下长时间太空飞行造成的骨组织退化对跳跃、跑步等四种不同运动状态进行了实验研究，对分泌的血清标志物进行检测，验证了软骨在受载过程中自我平衡的过程，一定的运动受载可以达到关节锻炼的目的，其标志物浓度变化趋势与本实验测得的粗糙度变化趋势一致。蔡振兵^[34]对受到扭转载荷作用后的关节软骨试样进行了苏木精-伊红染色分析，研究发现，未受到载荷作用时的关节软骨表面光滑平整，当载荷作用时，软骨表面会有明显的凸起，随着载荷逐渐增大，软骨表面变形变大，有破损的迹象，其结果也与本文得到的结论相符。

本文的实验样本由于来源不同个体，表面粗糙度存在差异，软骨样本表面有轻微弧度，测试的位置和试件选取的位置也会带来实验误差，但不影响软骨表面粗糙度在载荷下的变化趋势。本文的实验结果从表面粗糙度变化角度为骨关节炎发病机制的研究提供了科学数据，为骨关节炎疾病的防治和关节健康运动指导提供了参考依据。

4. 结论

本文利用表面轮廓粗糙仪测量了关节软骨表面粗糙度在载荷作用前后的变化数值，得到了有意义的实验结果，总结了软骨表面粗糙度随载荷作用的变化规律。本实验发现软骨表面粗糙度对载荷很敏感，载荷作用后，软骨表面粗糙度会增大然后随着时间逐渐回落到初始状态，表面粗糙度波动的峰值和回落时间与载荷类型和大小有关；在软骨可承受的载荷范围内，载荷越大，表面粗糙度波动峰值越大，回落到初始状态的时间越长，其中压缩载荷的波动峰值有滞后现象；冲击载荷对软骨损伤最严重，其次是重度疲劳载荷、压缩载荷和轻度疲劳载荷。

重要声明

利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：门玉涛负责实验设计与文稿审校，刘凯丰负责实验操作、分析与整理数据，刘福龙与张春秋参与论文相关实验结果的提高与分析。

Funding Statement

天津市自然科学基金（18JCYBJC95200）；国家自然科学基金（12072235）；天津市科技支撑重点项目（19YFZCCG00410）；天津科技计划项目（19YFZCSN01150）

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