Skip to main content
NCBI home page
Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi = Journal of Biomedical Engineering logoLink to Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi = Journal of Biomedical Engineering
. 2021 Oct 25;38(5):911–918. [Article in Chinese] doi: 10.7507/1001-5515.202103019

两种常见的脱细胞法对真皮脱细胞基质理化特性的影响

Effects of two common acellular methods on the physicochemical properties of dermal acellular matrix

彩仙 杨 1, 继强 郭 1,2, 景辉 王 1, 佳玉 范 1, 彦雪 邢 1, 利 张 2, 美文 安 1,*
PMCID: PMC9927432  PMID: 34713659

Abstract

目前脱细胞基质是一种治疗皮肤损伤的有效修复替代材料，但是关于其性能的系统性评价研究较少。本研究实验组采用两种脱细胞方法制备基质：一种是过氧乙酸（0.2% PAA/4% 乙醇溶液）灭菌后高渗盐水脱细胞（A 组）；另一种是 γ 射线灭菌后 0.05% Trypsin 酶/EDTA 脱细胞（B 组）；对照组进行 PBS 浸泡（C 组），检测三组组织物理特性和化学成分。不同方法处理后，苏木精伊红（HE）染色表明 B 组脱细胞效果良好；A、B 组组织孔隙率均在 84.9% 以上；A 组压缩弹性模量（9.94 ± 3.81）MPa、B 组压缩弹性模量（12.59 ± 5.50）MPa 分别与 C 组相比差异无统计学意义；A、B 组脱细胞基质中胶原蛋白总含量均显著低于 C 组含量（1.662 ± 0.229）mg/g，但胶原Ⅰ/Ⅲ的比值 B 组与 C 组相比差异无统计学意义；扫描电镜（SEM）、原子力显微镜（AFM）观测组织微观结构无明显差异；定性检测各组纤连蛋白和弹性蛋白与 C 组材料基本一致。因此，B 组脱细胞基质作为支架材料性能更好。实验结果说明，采用 γ 射线灭菌、0.05% Trypsin 酶/EDTA 制备的脱细胞基质可用于组织工程皮肤的构建，还可为异种真皮脱细胞基质的制备及裱衬提供参考，为静电纺丝或三维打印组织工程皮肤支架提供理化参数。

Keywords: 组织工程, 人体真皮, 脱细胞基质, 快速构建, 体外培养

引言

脱细胞基质是一种治疗皮肤损伤的有效修复替代材料[1]，制备与人体真皮结构相近的脱细胞基质是当前研究的难点。真皮损伤修复手段主要有自体移植、异种真皮脱细胞基质移植、同种异体真皮脱细胞基质移植，但临床效果不一。目前，国外有关真皮脱细胞基质的主要产品有 AlloDerm 和 AlloDerm RTU 等，国内有“瑞诺”和“桀亚”等，但关于理化性质方面的系统性评价研究较少。

常用的脱细胞基质制备方法包括物理处理、化学处理、生物酶处理或以上几种方法结合起来对组织进行脱细胞处理[2-3]。由于细胞密度、基质密度、组织厚度和形状等原因，不同组织和器官脱细胞的最佳方法不同[4-7]，针对皮肤组织的最优、最快组织工程皮肤构建方法报道较少[8-9]。单纯的物理脱细胞方法对细胞内容物去除效果不佳[10]；化学处理方法中去垢剂如十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）脱细胞效果较强，可以完全去核[11]，但存在细胞外基质（extracellular matrix，ECM）超微结构破坏、生长因子消除和化学试剂残留等问题[12-14]；生物酶处理如 Trypsin 酶可以使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散，可以高特异性地去除细胞残留或不良的 ECM 成分，从致密组织中完全去除细胞核[15-18]。

本研究在前期研究的基础上，简化处理步骤，防止氢氧化钠等对人体会产生危害的试剂残留，选用对人体较安全的酶或高渗盐水进行脱细胞[8, 19-22]，并且增加灭菌的步骤以避免未灭菌人体真皮具有传染性疾病的危害[8]。两步法处理脱细胞基质如下：采用 γ 射线和过氧乙酸（peroxyacetic acid，PAA）两种方法分别对人体皮肤组织进行灭菌[23]，采用 Trypsin 酶和高渗盐水分别进行脱细胞处理。将两组材料理化参数与正常皮肤组织对比分析，得出脱细胞基质的物理结构、生物化学成分等参数，可为异种真皮脱细胞基质的制备及裱衬提供参考，为静电纺丝或三维（three-dimensional，3D）打印组织工程皮肤支架提供理化参数。

1. 材料与方法

1.1. 主要试剂及仪器

主要试剂为 DMEM 培养液（HyClone，美国）、DMSO（生工，上海）、4% 多聚甲醛（C0402，Sigma，美国）、Trypsin 酶/EDTA 液（ScienCell，美国）、过氧乙酸 AB 型（瑞泰奇，山东）、苦味酸天狼星红染液（Sirius Red，F3D，美国）、纤连蛋白染色抗体（Anti-Fibronectin Rabbit pAb，山羊抗兔二抗，赛维尔，武汉）、羟脯氨酸试剂盒（凡科维，青岛）、CCK-8（碧云天，上海）等。主要仪器为超低温冰箱（Eppendorf，德国）、CO2 培养箱（Thermo Forma，美国）、扫描电子显微镜（JSM-7100F，Jeol，日本）、原子力显微镜（L01K180，BRUKE，德国）、荧光显微成像系统（iX70，Olympus，日本）、电热鼓风干燥箱（GZX-9240MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备厂，中国）、万能试验机（Instron 5544，英斯特朗上海材料试验机公司，中国）、酶标检测仪（Rayto Rt2100c，Rayto，美国）、红外光谱仪（Bruker，德国）等。

1.2. 支架材料制备

经过太原理工大学伦理委员会批准，收集山西白求恩医院门诊行包皮环切术的包皮标本。取样后用生理盐水反复冲洗，碘伏消毒，使用含 1% 青-链霉素的 PBS（青霉素及链霉素浓度分别为 10 000 U/mL、10 000 µg/mL）浸润消毒 30 min，PBS 洗 3 遍。随机将 30 例包皮分为 3 组，A 组为过氧乙酸（0.2% PAA/4% 乙醇溶液）灭菌、高渗盐水脱细胞；B 组为 γ 射线灭菌、0.05%Trypsin 酶/EDTA 脱细胞；C 组为对照组，进行 PBS 浸泡处理。

取 A 组样品在摇床上用 0.2% PAA/4% 乙醇溶液灭菌 6 h，用含 1% 青-链霉素的无菌 PBS 冲洗，然后加入浓度为 58.5 g/L 的 NaCl 溶液 100 mL，置于 4℃ 冰箱中 24 h，最后使用含 1% 青-链霉素的无菌 PBS 摇床清洗 24 h。B 组样品使用剂量率为 1 000 Gy/h，总剂量 25 kGy 的 γ 射线照射，再以 0.05% Trypsin 酶/EDTA 液孵育 24 h，最后使用含 1% 青-链霉素的无菌 PBS 摇床清洗 24 h。C 组仅使用含 1% 青-链霉素的无菌 PBS 摇床清洗 24 h。以下检测全部在真皮上进行。

1.3. 检测指标

1.3.1. 支架显微结构检测

将 3 组样品切下后用 PBS 洗涤，甲醛溶液固定，常规乙醇梯度脱水，石蜡包埋，切片，苏木精伊红（hematoxylin eosin，HE）染色，光学显微镜观察脱细胞情况。将 3 组组织使用 2.5% 戊二醛磷酸缓冲液室温固定 4 h，乙醇梯度脱水后冷冻干燥样品，扫描电镜（scanning electron microscopy，SEM）观察并拍照，使用 Image J 统计纤维直径数值。原子力显微镜（atomic force microscopy，AFM）检测：将 2 种（n = 3）脱细胞基质以及对照组样品风干后贴附在直径 35 mm 的培养皿上，室温空气中使用一个探针（模型 NCHV，BRUKER，美国）和 1 Hz 扫描频率在轻敲模式下扫描组织表面，扫描面尺寸为 10 µm × 10 µm。使用 Nanoscope 软件对结果进行评估。

1.3.2. 孔隙率测量及生物力学压缩性能

每组支架（n = 3）冷冻干燥，每个支架干燥后称重记为 m1，置入 50 mL 含体积分数 75% 的乙醇离心管。抽真空至不再有气泡溢出，称含有乙醇和支架材料离心管 m2，将含有乙醇的支架材料取出，称剩余的乙醇及离心管 m3。按式（1）计算孔隙率（P）：

1.3.2. 1

将各组支架（n = 3）制成适当尺寸，每个样品三次测量其厚度，取平均值计算其应变达到 80% 的位移，采用 Instron 5544 万能试验机，设置下降速率为 1 mm/min，结束条件为应变达到 80%。使用文献报道的模型对实验获得的载荷-位移曲线进行分析，按照式（2）计算获得皮肤的整体刚度，其中 F 表示载荷，E 为皮肤的整体刚度，a 为探针半径，s 表示位移，Inline graphic 表示泊松比，此处取值为 0.5。

1.3.2. 2

1.3.3. 胶原总含量和胶原成分比例测定

根据凡科维试剂盒组织样品处理方法处理组织并检测各组样品（n = 3）中羟脯氨酸含量，同时与标准液吸光度值绘制出的标准曲线相比，按羟脯氨酸含量占胶原总含量约 10% 换算出测试样品的胶原总含量。将石蜡切片脱蜡，苦味酸天狼星红染液浸染 1 h，苏木精复染。偏振光显微镜观察三组样品中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原分布情况，通过 Image J 分析各组样品Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的比例。

1.3.4. 纤连蛋白和弹性蛋白检测

将石蜡切片按照操作规程进行脱蜡和水化后，高温修复抗原；滴加 H2O2，室温孵育；滴加一滴非免疫动物血清，室温孵育；滴加一抗和二抗，室温孵育后 DAB 显色和苏木素复染。采用衰减全反射法（attenuated total refraction，ATR），在红外光谱仪波数 4 000～400 cm–1的测试条件下扫描每组样品（n = 3），采集样品的红外光谱。

1.3.5. 细胞活性检测

设置对照孔（仅有细胞），把人真皮成纤维细胞 4～6 代与脱细胞基质（n = 3）共培养于 24 孔板，接种密度为 1 000 个/孔，使用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养细胞 24 h 后，采用 CCK-8 孵育 1 h，在酶标仪 450 nm 处检测对照孔及各组基质的培养液吸光度值。

1.4. 统计学方法

采用 SPSS24.0 软件进行统计学分析。定量数据采用平均值 ± 标准差表示，测试样本为 3，组间比较采用单因素方差分析，检验水准为 0.05。

2. 结果

2.1. 真皮脱细胞效果及脱细胞基质的显微结构

HE 染色中苏木精使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着蓝紫色，伊红使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。各组材料 HE 染色结果见图 1a。C 组作为阴性对照组，真皮中存在大量细胞，A 组基质脱细胞效果较差，分布着较多核酸成分；B 组脱细胞效果良好，基本无核酸成分。SEM 是利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态。使用 SEM 观察了三组材料内部结构（从表面裂缝观察），由图 1b 可见三种材料内部纵横交错的纤维，呈现孔隙较均匀的三维网状结构。

图 1.

Acellularization effect and matrix internal structure of each group (Inline graphic ± SD)

各组材料脱细胞效果及基质内部结构（Inline graphic ± SD）

a. HE 染色图（Bar = 50 μm）；b. SEM 观察材料内部图（Bar = 10 μm）；c.各组材料纤维直径；d.各组材料纤维直径分布情况

a. HE staining diagram (Bar = 50 μm); b. SEM to observe the internal drawing of the material (Bar = 10 μm); c. fiber diameter of each group; d. fiber diameter distribution of each group

图 1

Open in a new tab

统计胶原纤维的直径，A 组为（1.2 ± 0.4）μm，B 组为（1.7 ± 0.7）μm，C 组为（1.7 ± 0.2）μm，直方图如图 1c 所示。每张图统计与随机直线相交的前 5 条纤维，每组共有 15 条纤维，分别按纤维直径小于 1、2、3、4、5 μm 统计各段的纤维直径出现的总频数，得到各组纤维分布情况如图 1d 所示。

从图 1c 和图 1d 中纤维直径分布可以看出，与 C 组纤维直径相比，A 组较大直径的胶原纤维损失严重，表现为仅存在直径 ≤ 3 μm 的纤维，统计纤维分布发现 A 组纤维直径主要集中在 1～2 μm。从不同直径的分布情况看，不同组别之间存在一定的趋势，A 组处理方法纤维直径平均值具有低于其他组的趋势。

AFM 的分辨率为纳米量级，图 2a 是使用 AFM 观察到的三组材料表面微形貌，图 2b 是各组材料微观表面高度，图 2c 是各组材料表面粗糙度结果。A、B、C 组高度分别为（1 577.3 ± 1 204.4）、（2 451.0 ± 404.4）、（1 659.3 ± 605.4）nm；粗糙度分别为 0.746 ± 0.047、0.819 ± 0.007、0.790 ± 0.035。原子力检测支架表面 100 μm2的面积内发现最高高度和粗糙度在 A、B 与 C 组之间差异无统计学意义，即 A、B 组处理方法均未改变基质的微观结构。

图 2.

Surface microstructure of each group (Inline graphic ± SD)

各组材料表面微结构（Inline graphic ± SD）

a. AFM 高度模式图；b.各组材料表面微区高度平均值；c.各组材料表面粗糙度值

a. AFM height pattern diagram; b. average height of microzone on the surface of each group of materials; c. surface roughness of each group of materials

图 2

Open in a new tab

2.2. 脱细胞基质的孔隙率及生物力学压缩性能测试结果

固体材料孔隙率可反映材料的疏密程度。通过测量支架孔隙率，本文发现 A 组（84.9 ± 5.0）%、B 组（86.7 ± 2.1）% 相比 C 组的孔隙率（59.2 ± 9.9）% 均上升，差异有统计学意义，分别为 P = 0.001、P = 0.000。表明细胞脱除使得组织孔隙率增大，具体数值如图 3a 所示。A 组材料的压缩弹性模量最小，为（9.94 ± 3.81）MPa；B 组材料压缩弹性模量最大，为（12.59 ± 5.50）MPa。A 组和 B 组材料的压缩弹性模量与 C 组压缩弹性模量（6.75 ± 2.20）MPa 相比差异无统计学意义（P > 0.05），结果如图 3b 所示。

图 3.

Void fraction and modulus of elasticity in compression of each group (Inline graphic ± SD)

各组材料孔隙率及压缩弹性模量（Inline graphic ± SD）

a.各组材料孔隙率；b.各组材料压缩弹性模量。**表示 P < 0.01，***表示 P < 0.001

a. void ratio of each group of materials; b. modulus of compression elasticity of each group of materials. ** P < 0.01, *** P < 0.001

图 3

Open in a new tab

2.3. 脱细胞基质的胶原总含量及胶原Ⅰ/Ⅲ的比值

检测 A、B、C 组胶原总含量分别为（1.227 ± 0.061）、（1.255 ± 0.025）、（1.662 ± 0.229）mg/g，A、B 组中胶原蛋白总含量均低于 C 组含量，且与 C 组相比差异具有统计学意义，分别为 P = 0.003、P = 0.004，结果如图 4b 所示。在偏振光显微镜下观察，Ⅰ型胶原纤维显示很强的双折光性，为红色或黄色纤维，Ⅲ型胶原显示弱的双折光性，为绿色细纤维，染色结果如图 4a 所示。统计胶原Ⅰ/Ⅲ的比值，发现 B 组（1.003 ± 0.002）与 C 组（1.006 ± 0.007）相比无显著差异，但 A 组（0.999 ± 0.003）与 C 组相比，差异具有统计学意义（P = 0.004），直方图如图 4c 所示。

图 4.

Total collagen content and collagen ratio in each group (Inline graphic ± SD)

各组材料的胶原总含量及胶原比值（Inline graphic ± SD）

a.各组材料天狼星红染色图（Bar = 50 μm）；b.各组材料胶原总含量；c.各组材料胶原比例。*表示 P < 0.05，**表示 P < 0.01

a. Sirius red staining of each group of materials (Bar = 50 μm); b. total collagen content in each group; c. proportion of collagen in each group. * P < 0.05, ** P < 0.01

图 4

Open in a new tab

2.4. 脱细胞基质的纤连蛋白染色及弹性蛋白定性

三组材料纤连蛋白均表现阳性结果，B 组阳性结果较弱，说明 B 组处理方法导致纤连蛋白含量下降，A 组阳性与 C 组程度一致，说明 A 组处理过程中未显著破坏组织的纤连蛋白，染色结果如图 5a 所示。红外谱图中存在弹性蛋白与胶原蛋白、糖胺聚糖、纤连蛋白等蛋白质都有的 1 650 cm–1附近酰胺Ⅰ、1 550 cm–1附近酰胺Ⅱ的特征峰外，还存在弹性蛋白在 3 309.8、1 651、1 539.1、1 238.2 cm–1处的四个特征吸收峰，分别对应于酰胺-A 带中的 N－H 伸缩振动吸收峰、酰胺-Ⅰ带中的 C=O 伸缩振动吸收峰、酰胺-Ⅱ带的 C－N 伸缩振动吸收峰和酰胺-Ⅲ带的 N－H 弯曲振动吸收峰，说明三组材料均存在弹性蛋白，结果如图 5b 所示。

图 5.

The results of fibronectin staining and elastin qualitative determination

各组材料纤连蛋白染色及弹性蛋白定性检测结果

a.纤连蛋白免疫组化染色（Bar = 50 μm）；b.各组材料弹性蛋白红外检测结果

a. fibronectin immunohistochemical staining (Bar = 50 μm); b. infrared detection results of elastin in each group

图 5

Open in a new tab

2.5. 成纤维细胞在脱细胞基质中的增殖情况

接种人真皮成纤维细胞后，对照组（C 组）及 A、B 组材料周围细胞生长状况如图 6a 所示，CCK-8 检测细胞活性直方图如图 6b 所示。24 h 细胞活性检测 A、B 组与对照孔差异无统计学意义。

图 6.

Cell activity around the control hole and materials of each group

对照孔及各组材料周围细胞活性

a.对照孔及各组材料周围细胞生长状况（Bar = 100 μm）；b.对照组与各组材料 CCK-8 细胞活力检测结果

a. growth of cells around the control hole and each group of materials (Bar = 100 μm); b. CCK-8 cell viability test results of control group and each group

图 6

Open in a new tab

3. 讨论

在调节生物物理刺激、生物化学和分子信号以及空间结构方面，天然 ECM 发挥着重要作用。脱细胞组织来自天然 ECM，在植入体内后，随时间延长可逐渐被患者自身的组织所取代[1]。脱细胞方案的理想目标是去除所有的细胞物质，而不影响剩余 ECM 的组成、机械完整性和生物化学活性[22]，但是脱细胞过程总会造成 ECM 的改变。为了研究这种改变，本研究将脱细胞真皮基质与未脱除细胞的皮肤组织进行对比，筛选出理化性能最接近人体正常皮肤的脱细胞基质，其可用于组织工程皮肤的构建，还可为异种真皮脱细胞基质的制备及裱衬提供参考，为静电纺丝或 3D 打印组织工程皮肤支架提供理化参数。

本文使用了两种常用的组织移植物灭菌方法：γ 射线和 PAA。这两种方法灭菌操作简便、高效、安全。γ 射线照射可去除细胞中易引起免疫排斥反应的成分，被广泛应用于药物和脱细胞猪角膜等材料的灭菌[24-26]。由于 γ 射线穿透性强，灭菌同时可因电离作用使细胞死亡。已有研究表明 PAA 可以在低浓度下灭活病毒、真菌和细菌，同时可通过电子转移氧化细胞膜上的基团，从而引发细胞死亡，产生的副产物为水、氧和二氧化碳[3]，对人体较安全。此外，有研究指出先灭菌有利于提高细胞的脱除效率[8]，故本文使用这两种灭菌方法作为脱细胞的前处理。

脱细胞真皮基质要脱除具有免疫抗原性的细胞，本文通过 HE 染色发现 B 组无核酸成分，脱细胞效果优于 A 组，说明酶对细胞脱除具有显著的效果。使用 SEM 和 AFM 观察材料微观结构[27-31]，结果显示 A、B 组材料在微观结构方面与 C 组相比差异均无统计学意义，但 A 组纤维直径相对 B 组与 C 组较小，提示 PAA 灭菌后高渗盐处理对纤维直径的破坏较大。

孔隙率反映材料内部的疏松程度，孔隙率越大，材料内部越疏松，细胞越容易长入材料内部。A、B 组孔隙率均远大于对照组 C 组，而 A 组与 B 组孔隙率相比差异无统计学意义，提示两种方法处理的基质内部孔隙基本一致。一般方法的支架孔隙率约为（74.28 ± 2.06）%[32-34]，而本研究的脱细胞真皮基质孔隙率为（84.9 ± 5.0）% 和（86.7 ± 2.1）%，高于传统方法。检测发现正常组织中间也存在空隙，对比正常组织孔隙率可间接证明本文细胞脱除的有效性。较大的孔隙率初步表明本文脱细胞真皮基质的结构便于细胞长入[35-36]。支架移植后需要包扎治疗，承受压力，故本研究检测脱除细胞前、后的支架压缩弹性模量[37]，结果表明 A 组高渗盐水处理、B 组酶处理后脱细胞真皮基质的压缩弹性模量接近正常皮肤，说明脱细胞处理未影响基质压缩弹性模量。

为了探索本文脱细胞基质在化学组分上是否有利于细胞长入，我们检测了样品脱细胞前、后的组分及含量变化。检测胶原总含量变化发现，与 C 组相比，A、B 组胶原总含量下降，差异具有统计学意义（均为 P < 0.01）。A 组或许是酸性环境加速了胶原蛋白的水解，B 组或许是 γ 射线使胶原缺失[3]。Ⅰ、Ⅲ型胶原是皮肤中含量最多的两种胶原成分，分别占皮肤胶原总量的 80%～85% 和 10%～15%[38]，据文献报道胶原比例与人的年龄与取皮位置有关[39-41]，成人Ⅰ/Ⅲ型胶原比值范围为 1～2。本研究检测这两种胶原比例比值约为 1，与邱林[42]报道的比值 1.2～1.3 相近，且经处理后胶原比例在 B 组与对照组之间差异无统计学意义。说明 B 组很好地保留了胶原比例，即 γ 射线灭菌、酶处理未显著破坏胶原Ⅰ/Ⅲ的比例。两组基质脱细胞后胶原蛋白总含量均有所下降，但是 B 组Ⅰ/Ⅲ型胶原的比例与对照组相比差异无统计学意义，说明 B 组脱细胞后细胞外基质的改变较小。

纤连蛋白可影响细胞的黏附、迁移，本文 B 组纤连蛋白明显少于 C 组，暗示 γ 射线照射和酶处理会使基质损失一部分纤连蛋白，而 PAA 灭菌、高渗盐水脱细胞的纤连蛋白保留效果较好。弹性纤维蛋白与支架弹性相关，故本文通过红外光谱图定性检测了脱细胞前、后各组弹性蛋白[43]，发现 A、B 组与对照组均出现弹性蛋白特征峰，说明两组脱细胞方法对弹性蛋白无影响。脱细胞支架使用目的是要植入人体，要求脱细胞基质对细胞无毒性。A、B 组材料的生物学活性差异无统计学意义，猜测与支架的微观形貌结构差异无统计学意义有关，与材料的化学组分结构、成分相近有关。

综上所述，A 组与 B 组性能对比发现，A 组纤连蛋白保留较好，但细胞脱除效果不如 B 组；B 组对胶原比例的破坏低于 A 组，且细胞脱除效果优于 A 组；基质与细胞共培养 24 h 以上发现，A、B 组基质对细胞生长的影响差异无统计学意义，但这只是短期的培养，若要应用于人体，后期需要检测材料与细胞共培养较长时间细胞的生长状态。

4. 结论

本文认为 γ 射线灭菌后，Trypsin 酶脱细胞对脱细胞真皮基质的理化特性无显著破坏作用，其制备的脱细胞真皮基质的理化特性较 PAA 灭菌后高渗盐脱细胞更接近于对照组。故本文认为 γ 射线灭菌、0.05% Trypsin 酶/EDTA 脱细胞制备脱细胞基质性能较好。本文中 γ 射线灭菌后，Trypsin 酶脱细胞构建的脱细胞基质不仅可以直接用于组织工程皮肤的构建，还可为异种真皮脱细胞基质的制备及裱衬提供参考，为静电纺丝或 3D 打印组织工程皮肤支架提供理化参数。

利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。

Funding Statement

国家自然科学基金（31870934）

The National Natural Science Foundation of China

References

  • 1.范志强, 刘雯恩, 周艳芳, 等 脱细胞生物支架的研究进展. 医学综述. 2019;25(14):2788–2793. doi: 10.3969/j.issn.1006-2084.2019.14.016. [DOI] [Google Scholar]
  • 2.Crapo P M, Gilbert T W, Badylak S F An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 2011;32(12):3233–3243. doi: 10.1016/j.biomaterials.2011.01.057. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 3.Matuska A M, McFetridge P S The effect of terminal sterilization on structural and biophysical properties of a decellularized collagen-based scaffold; implications for stem cell adhesion. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2015;103(2):397–406. doi: 10.1002/jbm.b.33213. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 4.陆莹莹, 许争, 温东朋, 等 脱细胞真皮基质修复组织缺损研究进展. 国际生物医学工程杂志. 2017;40(1):58–61. doi: 10.3760/cma.j.issn.1673-4181.2017.01.013. [DOI] [Google Scholar]
  • 5.Daugs A, Hutzler B, Meinke M, et al Detergent-based decellularization of bovine carotid arteries for vascular tissue engineering. Ann Biomed Eng. 2017;45(11):2683–2692. doi: 10.1007/s10439-017-1892-7. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 6.Floy M E, Mateyka T D, Foreman K L, et al Human pluripotent stem cell-derived cardiac stromal cells and their applications in regenerative medicine. Stem Cell Res. 2020;45:101831. doi: 10.1016/j.scr.2020.101831. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 7.何晶, 敖强 制备细胞外基质材料组织脱细胞方法的研究与热点. 中国组织工程研究. 2020;24(927):7–14. [Google Scholar]
  • 8.Wojciech L, Glik J, Agnieszka K, et al Atomic force microscopy in the production of a biovital skin graft based on human acellular dermal matrix produced in house and in vitro cultured human fibroblasts. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2018;106(2):726–733. doi: 10.1002/jbm.b.33883. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 9.许洁, 金冰慧, 赵应征 大鼠子宫去细胞支架及其细胞外基质凝胶的制备. 生物医学工程学杂志. 2018;35(2):237–243. doi: 10.7507/1001-5515.201704070. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 10.Lehr E J, Rayat G R, Chiu B, et al Decellularization reduces immunogenicity of sheep pulmonary artery vascular patches. J Thorac Cardiovasc Surg. 2011;141(4):1056–1062. doi: 10.1016/j.jtcvs.2010.02.060. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 11.Yang B, Zhang Y, Zhou L, et al Development of a porcine bladder acellular matrix with well-preserved extracellular bioactive factors for tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 2010;16(5):1201–1211. doi: 10.1089/ten.tec.2009.0311. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 12.Ott H C, Clippinger B, Conrad C, et al Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat Med. 2010;16(8):927–933. doi: 10.1038/nm.2193. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 13.Reing J E, Brown B N, Daly K A, et al The effects of processing methods upon mechanical and biologic properties of porcine dermal extracellular matrix scaffolds. Biomaterials. 2010;31(33):8626–8633. doi: 10.1016/j.biomaterials.2010.07.083. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 14.Du L, Wu X, Pang K, et al Histological evaluation and biomechanical characterisation of an acellular porcine cornea scaffold. Br J Ophthalmol. 2010;95(3):410–414. doi: 10.1136/bjo.2008.142539. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 15.Badylak S F, Freytes D O, Gilbert T W Reprint of: Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function. Acta Biomaterialia. 2015;23(Suppl):S17–S26. doi: 10.1016/j.actbio.2015.07.016. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 16.韩巧芳 胰蛋白酶的作用机理. 生物学教学. 2007;264(12):63. doi: 10.3969/j.issn.1004-7549.2007.12.045. [DOI] [Google Scholar]
  • 17.王鹏, 张刚, 李毅, 等 去细胞组织工程异种瓣膜支架制备方法的比较研究. 中国组织工程研究与临床康复. 2007;13(5):3041–3044. [Google Scholar]
  • 18.Gorschewsky O, Puetz A, Riechert K, et al Quantitative analysis of biochemical characteristics of bone-patellar tendon-bone allografts. Biomed Mater Eng. 2005;15(6):403–411. [PubMed] [Google Scholar]
  • 19.田广招, 杨振, 查康康, 等 脱细胞软骨基质对巨噬细胞极化的调控. 中国组织工程研究. 2021;951(22):107–112. [Google Scholar]
  • 20.付勇, 廖斌, 于风旭, 等 脱细胞肠系膜制备生物膜支架的实验研究. 医用生物力学. 2020;35(1):96–100. [Google Scholar]
  • 21.郑建明, 顾汉卿 三种常用脱细胞技术的比较研究. 透析与人工器官. 2006;17(2):38–41. [Google Scholar]
  • 22.李宝兴, 马绍英, 李宝明. 一种同种脱细胞真皮基质制备方法: 201110134511.9. 2011-10-19.
  • 23.胡欣欣. γ射线照射对蛋白质结构和功能影响的研究. 济南: 山东大学, 2015.
  • 24.孙建宇 60Co-γ射线辐照灭菌在中药及制剂中的应用研究. 中国药师. 2006;9(5):464. doi: 10.3969/j.issn.1008-049X.2006.05.040. [DOI] [Google Scholar]
  • 25.王思颖. 辐照消毒与纳米微囊化对骨形态发生蛋白活性的影响研究. 天津: 天津大学, 2015.
  • 26.Islam M M, Sharifi R, Mamodaly S, et al Effects of gamma radiation sterilization on the structural and biological properties of decellularized corneal xenografts. Acta Biomaterialia. 2019;96:330–344. doi: 10.1016/j.actbio.2019.07.002. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 27.涂秋芬, 张怡, 李艳, 等 一种新型的脱细胞组织工程血管支架的构建和评价. 生物医学工程学杂志. 2007;24(2):379–384. doi: 10.3321/j.issn:1001-5515.2007.02.031. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 28.张华, 周团锋, 杨雪, 等 口腔内 3 种合金共存下的离子析出及表面粗糙度的改变. 上海口腔医学. 2020;29(1):46–51. [Google Scholar]
  • 29.关燕清, 钟辉珍, 王笑春, 等 肿瘤坏死因子-α的光化学修饰及其固定化研究. 生物医学工程学杂志. 2006;23(2):346–349. doi: 10.3321/j.issn:1001-5515.2006.02.027. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 30.Feyza G, Bukem T, Etinkaya A, et al The effect of thickness on surface structure of rf sputtered TiO2 thin films by XPS, SEM/EDS, AFM and SAM. Vacuum. 2020;182:109766. doi: 10.1016/j.vacuum.2020.109766. [DOI] [Google Scholar]
  • 31.Javid A, Hekmatshoar M, Hedayatifar L, et al Effect of surface roughness on electrical conductivity and hardness of silver plated copper. Mater Res Express. 2019;6(3):036407. [Google Scholar]
  • 32.魏坤, 辛勇, 艾凡荣 海藻酸钠/纳米氧化锌/生物活性玻璃多孔支架的制备及表征. 硅酸盐通报. 2019;38(278):200–206. [Google Scholar]
  • 33.Dhasmana A, Singh L, Roy P, et al Silk fibroin protein modified acellular dermal matrix for tissue repairing and regeneration. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2019;97:313–324. doi: 10.1016/j.msec.2018.12.038. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 34.姜涛, 张爱君, 李雪阳, 等 人新型脱细胞真皮制备及性状分析. 中国组织工程研究. 2016;20(7):1006–1012. doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.07.013. [DOI] [Google Scholar]
  • 35.王灵平. 猪脱细胞真皮基质的制备与性能研究. 济南: 山东大学, 2011.
  • 36.孙伟. 新型猪膀胱脱细胞基质的制备与理化性能表征. 济南: 山东大学, 2019.
  • 37.Sneddon I N The relation between load and penetration in the axisymmetric boussinesq problem for a punch of arbitrary profile. Int J Eng Sci. 1965;3(1):47–57. doi: 10.1016/0020-7225(65)90019-4. [DOI] [Google Scholar]
  • 38.王成, 荣艳华, 沈佘明, 等 正常皮肤与增生性瘢痕中Ⅰ型和Ⅲ型胶原的含量与比例. 山东大学学报: 医学版. 2016;54(11):64–67. [Google Scholar]
  • 39.宋维旭, 伍津津, 鲁元刚, 等 天狼猩红-偏振光检测组织工程皮肤中胶原的观察. 重庆医学. 2007;36(5):450–453. doi: 10.3969/j.issn.1671-8348.2007.05.029. [DOI] [Google Scholar]
  • 40.刘建国, 王素华, 郑姗姗, 等 稀土氧化钕粉尘染毒大鼠不同时间点Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维含量及 IL-12 表达的研究. 环境卫生学杂志. 2015;5(3):189–193, 201. [Google Scholar]
  • 41.刘策励, 赵雄飞, 黎鳌, 等 烧伤后不同类型胶原在增生性瘢痕发生中的作用研究. 中国组织工程研究. 2001;5(10):36–37. doi: 10.3321/j.issn:1673-8225.2001.10.020. [DOI] [Google Scholar]
  • 42.邱林. 不同年龄增生性瘢痕的胶原构成及影响因素的研究. 重庆: 重庆医科大学, 2002.
  • 43.王晓丽. 弹性蛋白的改性研究. 天津: 天津大学, 2007.

Articles from Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi = Journal of Biomedical Engineering are provided here courtesy of West China Hospital of Sichuan University

RESOURCES