Abstract
微电极作为外部电子设备与内部神经核团之间的接口，在动物机器人、深度脑刺激、神经假体等方面都起着重要的作用。针对现有微电极制作装置价格高昂且制作工艺复杂等问题，本文提出了一种基于开源电子原型平台（Arduino）和三维打印技术的双绞微电极制作装置，并验证了其电极制作性能及神经刺激性能。实验结果表明，在微电极制作过程中，电极丝的正向绞合圈数一般应设置为其长度的 1.8 倍左右较适宜，逆向绞合圈数与长度无关，一般为 5 左右。与同类产品相比，本文所提装置不仅价格低廉、制作简单并具有较好的扩展性，对于微电极制作的个性化、普及化以及降低实验成本都有着积极的促进意义。
Keywords: 双绞微电极, 三维打印, 神经刺激, 动物机器人
Abstract
As an interface between external electronic devices and internal neural nuclei, microelectrodes play an important role in many fields, such as animal robots, deep brain stimulation and neural prostheses. Aiming at the problem of high price and complicated fabrication process of microelectrode, a microelectrode twisting machine based on open source electronic prototyping platform (Arduino) and three-dimensional printing technology was proposed, and its microelectrode fabrication performance and neural stimulation performance were verified. The results show that during the fabrication of microelectrodes, the number of positive twisting turns of the electrode wire should generally be set to about 1.8 times of its length, and the number of reverse twisting rings is independent of the length, generally about 5. Moreover, compared with the traditional instrument, the device is not only inexpensive and simple to manufacture, but also has good expandability. It has a positive significance for both the personalization and popularization of microelectrode fabrication and the reduction of experimental cost.
Keywords: twisted microelectrode, three dimensional printing, neural stimulation, animal robot
引言
对大脑特定核团神经电刺激以诱发动物特定运动行为已成为控制科学、神经科学、医学等前沿交叉学科的研究热点，目前已广泛应用于视觉[1-2]、运动功能的恢复[3]，以及对帕金森病、阿尔茨海默症、癫痫等疾病的治疗[4-6]。作为大脑特定核团神经电刺激的必备元器件之一，微电极是连接大脑内部神经核团与外界电子设备的接口，起着利用电信号激励或抑制神经活动以实现功能性电刺激的重要作用[7]。简易廉价微电极制作装置的研制对于满足微电极植入的个性化需求以及降低实验成本都有着积极意义。
在形形色色的神经刺激微电极中，双绞微电极由于制作简单且易于植入，在大脑特定核团神经电刺激调控中得到了广泛应用[8-9]。但是，目前双绞微电极的制作主要依赖于商业产品，如微电极制作装置 tetrode spinner（2.0，Neuralynx Inc.，美国），其价格昂贵且对操作人员要求较高。2009 年，Nguyen 等[10]基于开源电子原型平台 Arduino Uno（Arduino LLC，意大利）设计开发了一款简易的微电极制作装置（tetrode master），极大地降低了其制作成本。2020 年，Newman 等[11]在已有装置 tetrode machine（SpikeGadgets LLC，美国）基础上设计了一款新的制作装置（twister 3），提高了其制作速度。但是无论是 tetrode master[10]还是 twister 3[11]，其制作成本依然比较高昂，而且部分元器件国内也不易购买。
针对此问题，本文受 tetrode master[10]电极制作装置的启发，利用开源电子原型平台 Arduino Uno（Arduino LLC，意大利）和三维（three-dimensional，3D）打印技术设计并制作了一款简易的双绞微电极制作装置，并提供了该装置包含的核心元器件型号及数量。此外，还分析了利用该装置制作双绞微电极过程中电极丝长度和绞合圈数之间的对应关系，并利用鸽子机器人从侧面进一步验证了电极的刺激效果。与同类产品相比，本文提供的双绞微电极制作装置价格更加低廉，而且都可以通过主流购物网站获得，制作简单。
1. 装置的整体设计与制作
双绞微电极由工作电极和反电极组成，在微电极的制作过程中，首先需要将工作电极丝和反电极丝进行绞合（即缠绕），然后利用热风枪将电极丝绝缘层表面进行加热熔化，以使两根电极丝能够互相粘接、固定在一起[12]。基于这一过程，双绞微电极制作装置主要由机械和电子两部分组成，机械部分的作用主要是用于电极丝的固定和支撑，而电子部分主要是用于电极丝的绞合，互相配合完成双绞微电极的制作。
1.1. 机械部分组成
双绞微电极制作装置的机械部分主要包含了绞合装置和支撑杆两部分，整体如图 1 所示。其中支撑杆由两个相互垂直的支撑杆和底板组成，用于电极丝的固定。在水平支撑杆的端部有两个开槽，用于绞合过程中防止电极丝的移动，如图 1 右侧局部图所示。绞合装置处于支撑杆和控制器之间，用于电极丝旋转过程中保持电极丝的垂直拉伸状态，主要由线夹、夹持杆和导引柱三部分组成，图 1 给出了其结构示意图和实物图，其中导引柱采用上窄下宽的机械结构，在绞合中对夹持杆起到固定作用，这两部分都是由 3D 打印技术制作完成。
图 1.
Mechanical component of the instrument
装置的机械部分组成
1.2. 电子部分组成
双绞微电极制作装置的电子部分主要是指用于电极丝绞合的控制器，元器件分布和内部电路原理图如图 2 所示。本文设计的制作装置核心元器件都是常用器件，控制器核心元器件包括微控制器开源电子原型平台 Arduino Uno（Arduino LLC，意大利）、舵机（MG 996R，辉盛舵机，中国）、电源适配器（9V DC 650 mA）、电位器、光敏电阻、液晶显示屏（LCD 1602，华田信科，中国）、蜂鸣器等。其中微控制器用于整个电路的逻辑控制和信息传输，舵机用于驱动绞合装置进行旋转，包括瞬时针绞合和逆时针绞合，电位器用于设置舵机旋转的圈数，光敏电阻则用于判断绞合装置圈数的变化，而且这种改变可以实时显示在液晶屏上，当绞合装置的旋转达到了设定的圈数时会通过蜂鸣器进行提示。
图 2.
Electronic component of the instrument
装置的电子部分组成
2. 装置的使用与双绞微电极的制作流程
双绞微电极的制作过程中，从电极丝的截取到电极制作完成大致包含 7 个步骤，其中固定、绞合和热熔是三个关键步骤，制作流程如图 3 所示。
图 3.
Process of the microelectrode fabrication
双绞微电极的制作流程
具体流程描述如下：
截取：将电极丝按一定长度截断，电极丝截取的长度与旋转的圈数具有正相关关系，电极丝越长需要旋转的圈数越多，一般 25 cm 长度最佳。
固定：将电极丝通过绞合装置和支撑杆固定在制作装置上，要保证电极丝在固定后处于垂直拉伸状态，可以用手指轻轻触碰电极丝以确定电极丝拉伸度，不宜过紧也不宜太松。
绞合：绞合包含两个步骤，顺时针绞合和逆时针绞合。当电极丝固定完成后，打开控制器开关，控制器按事先设定的圈数进行旋转。控制器首先按顺时针旋转以使电极丝进行绞合，然后按逆时针旋转，逆时针旋转的主要目的是泄力，即将顺时针旋转后过多的力泄掉，以使电极丝绞合后处于平衡状态。
热熔：热熔的目的是将电极丝表面的绝缘层熔化后再黏合在一起，保证电极丝不会分离，并具有一定的硬度，图 3 中绞合和热熔步骤上的电极丝截面图示意了这一变化过程。
卸取：用剪刀从支撑杆处将电极丝剪断，并松开线夹，将粘接固定后的电极丝从制作装置上取下。
测试和截断：测试的目的是为了判断两股电极丝是否短路，由于电极丝在热熔过程中如果操作不当，极易将电极丝表层的绝缘层熔化过多以使其短路。测试时首先将电极丝端部的绝缘层剥离，然后将万用表置于蜂鸣档，并将红黑表笔分别与两股电极丝端部导线相连，以判断两股电极丝之间是否短路。如果两股电极丝之间是相互绝缘的，则用剪刀根据实际需要将电极丝分别截取成不同的小段，此时即可获得电极丝成品。
焊接：将电极丝和电极座用电烙铁进行焊接，以便于电极的植入和刺激信号的输入。
3. 装置的性能验证
3.1. 电极制作性能测试
在双绞微电极制作性能测试中，测量了电极丝长度与绞合圈数的对应关系，结果如图 4 所示。由图 4 可知，当电极丝处于初始状态时，由于电极丝的拉力较小，使得夹持杆一般处于底部或接近底部的状态，随着两股电极丝在控制器的旋转下逐渐绞合，向上的拉力会逐渐增大，而导引柱上窄下宽的机械结构会给夹持杆一个挤压力，阻止电极丝将夹持杆拉出，使电极丝能一直处于拉伸状态。
图 4.
Performance test results of the microelectrode fabrication
电极制作性能测试结果
为了获得电极丝长度和绞合圈数之间的对应关系，将夹持杆在初始状态和拉伸状态，即电极丝开始绞合和绞合完成时所处的位置进行标记，保证不同长度电极丝在绞合过程中具有相同的初始状态和拉伸状态，结果如图 4 右图所示，图中小图为绞合后不同长度电极丝（左）和典型长度时夹持杆拉伸状态（右）。由图 4 可知，电极丝长度与旋转圈数基本呈线性正相关关系，随着电极丝长度的增加，旋转圈数成比例增加。线性拟合结果显示，旋转圈数一般应设置为电极丝长度的 1.8 倍左右最适宜。
3.2. 电极刺激效果测试
为了测试上述双绞微电极的使用效果，利用鸽子为模式动物，从侧面验证电极的刺激性能，结果如图 5 所示。根据文献结果，将焊接后的双绞微电极植入鸽子中脑对侧的丘间核（intercollicularis，ICo），利用直流电刺激诱导鸽子进行相应的转向行为[13]。实验选用 6 只健康成年家鸽，体重 450～550 g，雌雄各半，实验经过了黄淮学院伦理审查委员会审查。微电极植入前，鸽子进行全身麻醉，固定于脑立体定位仪（ST-5ND-C，成都仪器厂，中国）上。参考脑立体定位图谱[14]，确定 ICo 区植入位置（A 2.00 mm，M 3.00 mm，D 7.00 mm），去除颅骨和硬脑膜后进行微电极植入。待 5～7 d 鸽子康复后，利用程控刺激器（YC-2，成都仪器厂，中国）进行运动行为诱导。
图 5.
Performance test results of the microelectrode stimulation
电极刺激性能测试结果
如图 5 电刺激原理图所示，当双绞微电极植入 ICo 脑区之后，利用刺激器将一定量的电流（微安级）经其中一股电极流入，然后经 ICo 区从另一股电极流出，形成回路，从而激活相应核团神经元，诱导出特定运动行为。通过对双侧 ICo 区进行电流刺激（方波，幅值 100 μA，频率 80 Hz，占空比 50%）[15]，6 只鸽子都可以诱导出相对应的运动行为，即连续刺激左侧 ICo 区可以诱导鸽子进行顺时针旋转，相应地连续刺激右侧 ICo 区则会诱导鸽子进行逆时针旋转，20 次实验正确率 100%。图 5 给出了自由运动状态、刺激诱导顺时针旋转和刺激诱导逆时针旋转效果。由图 5 可知，电刺激诱导出被动的鸽子转向行为与自由运动状态下主动的转向行为有明显区别，这一结果也从侧面进一步验证了双绞微电极的性能。
3.3. 与同类产品性能对比
除了电极制作性能和电极刺激效果两部分测试外，本文又进一步与现有同类产品对比了其核心部件的性能。如表 1 所示，给出了本文设计的微电极制作装置的核心元器件及其型号和数量。由表 1 可知，本文设计的制作装置核心元器件都是常用器件，微控制器使用的是开源电子原型平台 Arduino Uno（Arduino LLC，意大利），伺服电机使用的是舵机（MG 996R，辉盛舵机，中国），显示屏使用的是液晶显示屏（LCD 1602，华田信科，中国），外壳、支撑杆和绞合装置用 3D 打印或亚克力板制作，这些器件都十分容易获得或进行加工，而且价格也十分低廉，总造价不超过 350 元人民币。
表 1. Component composition of the instrument.
设备的元器件组成
| 名称 | 元器件 | 型号 | 数量 | 单位 |
| 控制器 | 微控制器 | Arduino Uno，Arduino LLC，意大利 | 1 | 个 |
| 伺服电机 | MG996R，辉盛舵机，中国 | 1 | 个 | |
| 液晶显示屏 | LCD1602，华田信科，中国 | 1 | 个 | |
| 电源适配器 | 9 V DC 650 mA | 1 | 个 | |
| 外壳 | 3D 打印或亚克力板加工 | 1 | 个 | |
| 其它元器件 | 电容、电阻、开关、蜂鸣器等 | 1 | 套 | |
| 支撑杆 | 底板 | 亚克力板加工 | 1 | 块 |
| 直线光轴导轨 | 直径 10 mm | 2 | 根 | |
| 固定器件 | 卧式支撑座、十字座等 | 1 | 套 | |
| 绞合装置 | 线夹 | 6 cm 直全齿 | 1 | 个 |
| 夹持杆 | 3D 打印 | 1 | 个 | |
| 导引柱 | 3D 打印 | 1 | 个 |
在与国际同类产品性能对比中，本文选用了三款比较典型的微电极制作装置：tetrode machine（SpikeGadgets LLC，美国）、twister 3[11]、tetrode spinner（2.0，Neuralynx Inc.，美国），分别对比其微控制器、伺服电机、液晶显示屏、电源适配器、支撑杆、自动热熔、绞合装置、绞合方式及总造价等 9 种参数，结果如表 2 所示。
表 2. Performance comparison of core components with traditional products.
与同类产品核心部件的性能对比
| 名称 | tetrode machine | twister 3 | tetrode spinner 2.0 | 本文 |
| 微控制器 | Arduino Due | Teensy LC | 未知 | Arduino Uno |
| 伺服电机 | 标准半桥 | TMC 2130 | 未知 | 舵机 MG996R |
| 液晶显示屏 | 无 | 无 | 有 | 有 |
| 电源适配器 | 110 V | 12～24 V DC | 12 V | 9 V DC |
| 支撑杆 | 无 | 无 | 有 | 有 |
| 自动热熔 | 有 | 无 | 无 | 无 |
| 绞合装置 | 商业化定制 | 光机械器件、3D 打印 | 商业化定制 | 3D 打印 |
| 绞合方式 | 自由悬挂 | 弹簧片、磁铁 | 磁铁 | 机械夹紧 |
| 总造价/元 | 约 60 000 | 未知 | 约 24 000 | 350 |
由表 2 可知，尽管本文的设计不如 tetrode machine 功能齐全、不如 twister 3 驱动性能出众、不如 tetrode spinner 2.0 制作精良，但是在总体造价上本文的设计要远远低于前三款产品，而且机械化绞合方式更加稳定。
4. 讨论
用电刺激取代自然激励，以纠正神经回路错误或者调控运动行为为目标的大脑微电流刺激是神经调控研究的有效手段。作为连接特定神经核团和刺激器之间的接口，双绞微电极在其中起到了重要作用。针对神经电刺激的双绞微电极，通过借鉴 tetrode master[10]电极制作装置的思路，利用开源电子原型平台 Arduino Uno，并结合 3D 打印技术研制了一款简易的双绞微电极制作装置，并验证了其制作性能和刺激效果。研究结果表明，利用上述双绞微电极制作装置制作双绞微电极时，控制器的正向旋转圈数大概为电极丝长度的 1.8 倍左右较为适宜，逆向旋转圈数与电极丝长度无关，一般设置为 5 圈较为合适。
本文设计的双绞微电极制作装置共包含控制器、绞合装置和支撑杆三部分，不仅结构简单、操作方便，而且价格低廉，具体表现如下：① 该装置功能具有较强的扩展性，不仅适合两股电极丝的双绞刺激微电极的制作，也可以用作四股电极丝的检测电极的制作，只需增加支撑横杆上凹槽的数量即可，如图 1 局部图所示；② 对于控制器，相对目前存在的电极制作装置，该控制器的元器件极易获得，都可以从国内主流购物网站上购买，而且价格低廉；③ 对于绞合装置，采用 3D 打印设计，有效保证了加工的精度，而且绞合装置紧口型的结构设计使操作更方便。
由于电极丝的长度与控制器的绞合圈数密切相关，在电极丝绞合中发现，电极丝的长度在 25 cm 左右时绞合的效果最佳。绞合的圈数除了受电极丝长度制约外，也会受到电极丝固定后初始状态、绞合完成后的拉伸状态、电极丝的硬度、电极丝的直径等影响，因此在电极丝绞合时除了参考理论数据外，也要结合实际的经验进行判断。此外，电极丝绞合完成后的热熔粘接固定也十分关键，如果熔化过度会使两股电极丝之间短路，而熔化不足则起不到粘接固定的效果，因此在实际操作中也需要根据经验判断，采用循序渐进的策略，逐步加大热熔的时间，避免热熔过度而导致电极丝报废。
基于动物自身运动系统，通过采用大脑微电流刺激，对动物运动行为进行调控实现的动物机器人，由于在灵活性、稳定性、能源效率方面具有较大优势。因此最后本文利用鸽子为模式动物，利用鸽子机器人验证了双绞微电极的应用效果。尽管鸽子机器人的行为诱导受植入靶点、刺激参数、刺激器性能等多种因素影响，但是作为刺激器与神经靶点之间的连接接口，微电极的好坏会直接影响植入的效果，进而也会影响行为诱导的效果。因此鸽子机器人的刺激结果也从侧面验证了双绞微电极制作装置的性能。综上可知，本文展示的双绞微电极制作装置结构简单、价格低廉、易于实现，对于微电极制作的个性化、普及化以及降低实验成本都有着积极的促进意义。
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
Funding Statement
国家自然科学基金资助项目（61673353）；河南省科技厅科技攻关项目（182102210099）；黄淮学院国家级科研项目培育基金（XKPY-2018006）
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