不同频率磁刺激对离体脑片神经元兴奋性及电压门控型钾通道影响的研究

Abstract

经颅磁刺激作为一种无创的神经调控技术，广泛地应用于神经和精神类疾病的临床治疗，但其神经调控的作用机制尚不清楚。本文旨在从神经元电生理角度研究不同频率的磁刺激对离体脑片神经元兴奋性和电压门控型钾通道的影响。实验分为刺激组和对照组，刺激组对急性分离的小鼠脑片分别施加同一强度（0.3 T）下不同频率（20 Hz 和 0.5 Hz）的磁刺激（500 个脉冲）。利用全细胞膜片钳技术记录海马齿状回颗粒神经元的静息膜电位、动作电位和电压门控型钾通道电流。结果显示，20 Hz 磁刺激显著增加了动作电位的发放个数以及单个动作电位的最大斜率，降低了动作电位的阈值、半波宽和达峰时间，提高了海马神经元的兴奋性；降低了钾通道的电流峰值，瞬时外向钾通道的失活曲线明显左移，失活后复活的时间常数明显增大。0.5 Hz 磁刺激则显著抑制了神经元兴奋性，提高了钾通道的电流峰值，但通道的动力学特征没有明显变化。结果提示，海马齿状回颗粒细胞电压门控钾通道的动力学特征和神经元的兴奋性，可能是磁刺激进行神经调控的潜在机制之一。

引言

重复经颅磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS）是一种非侵入性的神经刺激技术。该技术依据电磁感应原理，利用变化的电流流经线圈时产生变化的磁场^[1]，磁场几乎无衰减地穿透颅骨等高阻抗组织^[2]，在大脑中诱导产生刺激电流^[3]。目前，经颅磁刺激已广泛应用于神经与精神性疾病的治疗中^[4-6]，在阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease，AD）、抑郁症、脑瘫等科学研究与临床治疗中取得了显著成果^[7-10]。

研究显示，rTMS 对大脑的调控作用与神经元兴奋性有关。长期施加 1 Hz 的 rTMS 可改变海马 CA1 区锥体细胞膜上离子通道、静息膜电位和动作电位阈值，提高神经元的兴奋性^[11]。rTMS 在提高大脑齿状回（dentate gyrus，DG）颗粒细胞神经兴奋性的同时可改善与年龄相关的认知损伤^[12]。长期暴露在高频 rTMS 下的老年小鼠神经兴奋性降低和与年龄相关的认知障碍得到明显改善，同时电压门控型钙通道动力学发生改变^[13]。rTMS 对神经调控的作用与频率有关，低频 rTMS 可通过降低大脑皮层神经元的兴奋性来抑制神经元活动，高频 rTMS 可通过促进神经元兴奋性来改善大脑脑区的功能^[14-15]。

已有研究从电生理、分子、行为认知等不同层面对磁刺激的作用进行了探索^[16]，但磁刺激的作用效果不尽相同，作用机制仍不明确^[17]，对离体脑片施加磁刺激后神经兴奋性的变化及其机制的研究鲜有报道。电压门控型钾离子通道具有参与调控细胞兴奋性和静息电位的作用^[18]，是调节神经元兴奋性水平的机制之一^[19-20]，主要包括瞬时外向钾通道电流（transient outward potassium current，I_A）和延迟整流钾通道电流（delayed rectifier potassium current，I_K），I_A 是膜电位复极化早期外向电流的主要成分，在细胞放电模式、动作电位的产生及放电频率等方面发挥着很重要的作用^[21-22]。I_K 的幅值可直接影响动作电位幅度和频率，对细胞兴奋性有至关重要的影响^[23-24]。不同频率的磁刺激是否是通过改变钾离子通道的动力学特征调节神经元的兴奋性还有待验证。本文旨在探究不同频率的磁刺激对离体脑片海马 DG 区颗粒神经元兴奋性和电压门控型钾离子通道动力学的影响，并提出假设：高频磁刺激可以提高神经元的兴奋性，低频磁刺激则是抑制其兴奋性，磁刺激对离体脑片海马 DG 区颗粒细胞神经兴奋性的调节作用可能是通过对电压门控钾离子通道的调控实现的。

1. 材料与方法

1.1. 实验动物及实验设计

研究采用 4～5 周左右的雌性昆明小鼠共 8 只，购买自北京华阜康生物科技有限公司。在室温为（25 ± 1）℃、湿度为 60% 左右的环境中饲养小鼠，自由取水和进食，光照与黑暗交替循环。在脑片制备结束之后，将脑片随机分为实验组（高频 20 Hz，低频 0.5 Hz）与对照组，实验组在施加磁刺激之后立即进行全细胞脑片膜片钳电生理实验，对照组在孵育结束之后直接进行电生理实验，实验重复 3 次。所有动物实验均获得河北工业大学与华北理工大学伦理委员会批准，且符合实验动物伦理学要求和使用规范（实验动物许可证号：SYXK（冀）2015-0038；伦理审查编号：LX201886）。

1.2. 磁刺激实施

取孵育之后的脑片置于磁刺激线圈之下，接受特定频率磁刺激。采用依瑞德 CCY-IA 型号的刺激仪及型号为 Y064 的小动物刺激线圈进行实验，使用重复磁刺激模式，刺激参数为高频 20 Hz，低频 0.5 Hz，刺激强度约为 0.3 T，刺激脉冲个数均为 500 个。

1.3. 电生理实验

1.3.1. 溶液配制

人工脑脊液的成分为（mmol/L）：NaCl 124，KCl 3，CaCl₂ 2，MgCl₂ 2，NaH₂PO₄ 1.625，NaHCO₃ 26，glucose 11，HEPES 5，用 NaOH 将 pH 调至 7.4，渗透压 310～320 mOsm，温度保持在 30 ℃，通氧（95% O₂/5% CO₂）使之饱和，在此环境下脑片可存活 8～10 h。

切片液的成分为（mmol/L）：KCl 2.5，CaCl₂ 1，MgCl₂ 6，NaH₂PO₄ 1.625，NaHCO₃ 26，glucose 11，sucrose 220，pH 为 7.4，渗透压为 300～305 mOsm。

全细胞电流钳的电极内液成分为（mmol/L）：K-glu 125，NaCl 15，MgCl₂ 2，CaCl₂ 1，EGTA 11，HEPES 10，Na-ATP 3，Na-GTP 0.3，调节 pH 为 7.2～7.3，渗透压为 285～290 mOsm。使用前用 0.22 μm 滤膜进行过滤。

钾电流记录细胞外液成分为（mmol/L）：NaCl 130，KCl 5，CaCl₂ 2，MgCl₂ 1，glucose 10，HEPES 10，TTX 0.001，CdCl₂ 0.2，用 NaOH 将 pH 调至 7.4，通氧（95% O₂/5% CO₂）使之饱和。

钾电流记录的电极内液成分为（mmol/L）：KCl 140，MgCl₂ 2，EGTA 10，HEPES 10，Mg-ATP 2，用 KOH 将 pH 调至 7.2。使用前用 0.22 μm 滤膜进行过滤。

1.3.2. 急性分离脑片的制备

小鼠在注射水合氯醛 10 min 之后进入麻醉状态，迅速断头取脑，将大脑浸入冰水混合且通氧的切片液中，1～2 min 之内取出，使用德国徕卡 VT1200S 型号的震动切片机将小鼠脑切成 300 μm 厚的切片，并将切片移入氧饱和的 30 ℃ 恒温人工脑脊液中孵育 40 min。

1.3.3. 全细胞脑片膜片钳

将接受磁刺激之后的脑片移至德国 HEKA 膜片钳设备上的脑片记录槽内，在低倍镜下找到目标脑区 DG 区，换到高倍水镜之下找到清晰饱满、立体感强的颗粒细胞，安装充灌有电极内液的玻璃微电极，在正置显微镜下进行封接破膜，进行全细胞脑片膜片钳记录。

采用全细胞电流钳记录模式，记录海马 DG 区颗粒神经元的静息膜电位、150 pA 刺激 500 ms 的去极化电流下的动作电位发放个数，以及 150 pA 刺激 30 ms 的去极化电流下的单个诱发动作电位。分析了神经元的静息膜电位，动作电位的发放个数以及单个动作电位的阈值、半波宽、达峰时间和最大斜率。

采用全细胞电压钳记录模式，记录细胞的电压门控型钾通道电流，包括 I_A 和 I_K。分析了两种钾电流的 I-V 曲线和激活特性，以及 I_A 的失活特性和复活特性。

1.4. 数据统计分析

数据分析采用 One-way ANOVA 分析方法，每组实验样本数量为 6（n = 6），统计结果以均值 ± 标准差的方式呈现，检验水准为 0.05。

2. 数据分析结果

2.1. 不同频率磁刺激对离体脑片海马 DG 区神经元放电的影响

为了探究不同频率的磁刺激对神经元静息膜电位和诱发动作电位的影响，在进行全细胞电流钳记录时，分别给予细胞 0 pA 电流和长时程电流刺激（幅值 150 pA，时长 500 ms），结果显示在施加 20 Hz 磁刺激脑片的细胞上观察到自发放电（spontaneous firing），如图 1a 所示。对静息膜电位的分析表明，20 Hz 磁刺激组的静息膜电位明显高于对照组和 0.5 Hz 磁刺激组，0.5 Hz 磁刺激之后的静息膜电位明显低于对照组，统计学结果见图 1b。记录到的诱发动作电位示意图如图 1c 所示，对放电个数的分析表明，20 Hz 磁刺激显著增加了动作电位的个数，0.5 Hz 磁刺激与对照组相比，放电个数明显减少，统计学结果见图 1d。

图 1.

Analysis of membrane potential and the number of APs released

膜电位及动作电位发放个数分析

a. 自发放电；b. 静息膜电位；c. 诱发动作电位；d. 动作电位个数. ^*P < 0.05，^***P < 0.001

a. spontaneous firing; b. resting membrane potential; c. evoked firing; d. the number of APs released. ^*P < 0.05, ^***P < 0.001

探究不同频率的磁刺激对单个动作电位相关电特性指标的影响，给予细胞短时程的电流刺激（幅值 150 pA，时长 30 ms），所用的指标包括：动作电位的阈值、半波宽、达峰时间和最大斜率。统计学分析结果如图 2 所示。对动作电位阈值的分析表明，20 Hz 磁刺激组动作电位阈值较对照组与 0.5 Hz 磁刺激组均有明显降低，0.5 Hz 磁刺激组与对照组相比阈值明显向去极化方向移动，结果如图 2a 所示。对动作电位半波宽的分析表明，20 Hz 磁刺激组动作电位半波宽较对照组与 0.5 Hz 磁刺激组均有明显缩短，0.5 Hz 磁刺激组半波宽与对照组相比显著延长，结果如图 2b 所示。对动作电位达峰时间的分析表明，20 Hz 磁刺激组动作电位达峰时间较对照组与 0.5 Hz 磁刺激组均有明显缩短，0.5 Hz 磁刺激组的达峰时间与对照组相比显著延长，统计学结果见图 2c。对动作电位最大斜率的分析表明，20 Hz 磁刺激组动作电位最大斜率较对照组与 0.5 Hz 磁刺激组均有明显增大，0.5 Hz 磁刺激组与对照组相比最大斜率明显减小，统计学结果见图 2d。

图 2.

Data analysis of related electrical characteristics of action potential (AP)

动作电位相关电特性数据分析

a. 动作电位阈值；b. 半波宽；c. 达峰时间；d. 最大斜率. ^*P < 0.05，^**P < 0.01，^***P < 0.001

a. the threshold of AP; b. AP half width; c. time to AP peak amplitude; d. the maximum slope. ^*P < 0.05, ^**P < 0.01, ^***P < 0.001

2.2. 不同频率磁刺激对离体海马 DG 区神经元电压门控型钾离子通道的影响

2.2.1. 磁刺激对 I_A 和I_K 电压和电流（I-V）曲线的影响

为了排除其他电压门控离子电流对钾电流的影响，在记录外液中加入终浓度为 0.001 mmol/L 的 TTX 和 0.2 mmol/L 的 CdCl₂ 来阻断电压门控钠通道和钙通道。单独记录 I_A 和I_K 时，外液中还需加入终浓度为 25 mmol/L 的 TEA 阻断延迟整流钾电流来记录 I_A，或者加入终浓度为 3 mmol/L 的 4-AP 阻断瞬时外向钾电流来记录 I_K。

记录 I_A 的刺激参数为：在 Whole-cell 记录模式下，将膜电位钳制在 − 100 mV，给予 − 50～+ 90 mV 的去极化阶梯电压，步阶为 10 mV，时长为 200 ms，刺激脉冲及电流示意图见图3a。

图 3.

Analysis of current and voltage (I-V) curves

电流和电压（I-V）曲线的分析

a. I_A 刺激脉冲、示意图及I-V曲线；b. I_K 刺激脉冲、示意图及I-V曲线. ^*P < 0.05，^**P < 0.01，^***P < 0.001 vs 对照；^#P < 0.05，^##P < 0.01，^###P < 0.001 vs 0.5 Hz

a. stimulation pulse, schematic diagram and I-V curve of I_A; b. stimulation pulse, schematic diagram and I-V curve of I_K. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control; ^#P < 0.05, ^##P < 0.01, ^###P < 0.001 vs 0.5 Hz

记录 I_K的刺激参数为：在 Whole-cell 记录模式下，将膜电位钳制在 − 50mV，给予 − 50～+ 90 mV 的去极化阶梯电压，步阶为 10 mV，时长为 300 ms，刺激脉冲及电流示意图见图3b。

以膜电位为横坐标，离子电流峰值为纵坐标作I_A 和I_K 的 I-V 曲线，如图3 所示。从图中可以看出，磁刺激对 I_A 和 I_K 的影响是具有电压依赖性的，在不同的电压刺激下，离子电流的峰值反应不同。对I_A 的 I-V 曲线分析表明，从 − 20 mV 开始，实验组与对照组产生显著差异，20 Hz 磁刺激明显抑制了 I_A 电流峰值，0.5 Hz 磁刺激则明显提高了 I_A 电流峰值；实验组之间在 − 40 mV 开始出现显著差异。I_K 的 I-V 曲线显示，与对照组相比，20 Hz 磁刺激和 0.5 Hz 磁刺激分别在 + 20 mV 和 + 70 mV 开始出现显著差异；实验组之间在 + 20 mV 开始出现显著差异。可以看出磁刺激对 I_A 电流峰值的影响要早于 I_K，可能是由于瞬时外向钾通道的开放要早于延迟整流钾通道。

2.2.2. 磁刺激对 I_A 和I_K 激活动力学的影响

为了分析磁刺激对两种钾电流激活动力学的影响，作出了I_A 和I_K 的激活曲线。记录 I_A 的刺激参数为：在 Whole-cell 记录模式下，先将膜电位钳制在 − 100 mV，给予时长为 400 ms 的 − 110 mV 的超极化条件脉冲，之后给予 − 50～+90 mV、步阶为 10 mV、时长为 150 ms 的测试脉冲，刺激脉冲及电流示意图见图 4a。记录 I_K 的刺激参数为：在 Whole-cell 记录模式下，先将膜电位钳制在 − 50 mV，给予时长为 400 ms 的 − 110 mV 的超极化条件脉冲，之后给予 − 50～+ 90 mV、步阶为 10 mV、时长为 150 ms 的测试脉冲，刺激脉冲及电流示意图见图 4b。激活曲线是根据不同的测试电压与其对应下的电导绘制，利用公式G = I/(V_m − V_rev)将记录到的电流值转换成电导值，其中V_m 表示膜电位，V_rev 表示翻转电位，G表示某一测试电压下的电导，I表示不同测试电压下记录到的电流峰值。以G/G_max 为纵坐标，不同的膜电位为横坐标，绘制钾离子电流的激活曲线，然后用 Boltzmann 方程 G/G_max = 1/{1 + exp［(V_m − V_1/2)/k］}拟合散点图得到 V_1/2 和k。V_1/2 为激活动力学的半数激活电压，k 为斜率因子。对照组以及不同频率刺激下的I_A 和 I_K 的稳态激活曲线如图 4 所示，经统计学分析得出磁刺激对 I_A 和 I_K 的激活动力学没有显著影响。I_A 和 I_K 激活曲线的拟合参数见表 1。

图 4.

Analysis of activation curves

对激活曲线的分析

a. I_A 刺激脉冲、示意图及激活曲线；b. I_K 刺激脉冲、示意图及激活曲线

a. stimulation pulse, schematic diagram and activation curve of I_A; b. stimulation pulse, schematic diagram and activation curve of I_K

表 1. Effects of magnetic stimulation with different frequencies on activation kinetic parameters of I_A and I_K.

不同频率的磁刺激对 I_A 和I_K 激活动力学参数的影响

组别	IA 激活曲线的参数			IK 激活曲线的参数
	半数激活电压 V1/2/mV	斜率因子 k		半数激活电压 V1/2/mV	斜率因子 k
20 Hz	13.30 ± 1.06	28.36 ± 1.36		1.97 ± 0.98	24.97 ± 0.94
对照	16.85 ± 0.65	25.78 ± 0.81		4.86 ± 0.48	24.30 ± 0.45
0.5 Hz	13.30 ± 0.82	28.93 ± 1.07		5.00 ± 0.61	23.99 ± 0.57

2.2.3. 磁刺激对 I_A 失活动力学的影响

电压门控钾电流分为延迟整流钾电流和瞬时外向钾电流，延迟整流钾电流的通道特性为延迟激活且缓慢失活，瞬时外向钾电流的通道特性是快速激活和快速失活，因此通道的失活特性和复活特性只针对瞬时外向钾电流而不考虑延迟整流钾电流。采用的刺激参数为双脉冲刺激：先将膜电位钳制在 − 100 mV，给予 − 110～+10 mV、步阶为 10 mV、时长为 80 ms 的预脉冲刺激，然后给予+50 mV、时长为 80 ms 的测试脉冲刺激，记录的电流示意图如图5a 所示。用各测试电压下的电流峰值与预脉冲的电压绘制失活曲线，I/I_max 为纵坐标，预脉冲电压为横坐标，用 Boltzmann 方程I/I_max = 1/{1+exp［(V_m − V_1/2)/k］}拟合散点图得到V_1/2 和k。V_1/2 为失活动力学的半数失活电压，k为斜率因子。刺激组和对照组拟合失活散点图得到的参数如表2 所示，20 Hz 磁刺激之后的I_A 失活曲线较对照组发生了明显的左移，半数失活电压由（ − 50.65 ± 0.26）mV 变为（ − 56.69 ± 0.39）mV，0.5 Hz 磁刺激组的半数失活电压与对照组之间没有显著差异，实验组与对照组之间的斜率 k 均没有显著差异。

图 5.

Analysis of inactivation and recovery curves of I_A

对I_A 失活和失活后复活曲线的分析

a. 刺激脉冲、示意图及失活曲线；b. 刺激脉冲、示意图及复活曲线

a. stimulation pulse, schematic diagram and inactivation curve; b. stimulation pulse, schematic diagram and recovery curve

表 2. Effects of magnetic stimulation with different freque ncies on inactivation and recovery kinetic parameters of I_A.

不同频率的磁刺激对 I_A 失活和复活动力学参数的影响

组别	IA 失活曲线参数			IA 复活曲线参数
	半数失活电压V1/2/mV	斜率因子k		时间常数τ/ms
注：*P < 0.05 vs 对照；##P < 0.01，###P < 0.001 vs 0.5 Hz
20 Hz	− 56.69 ± 0.39*##	8.62 ± 0.34		10.36 ± 0.57*###
对照	− 50.65 ± 0.26	8.73 ± 0.23		6.97 ± 0.66
0.5 Hz	− 48.55 ± 0.23	7.95 ± 0.21		5.50 ± 0.40

2.2.4. 磁刺激对 I_A 失活后复活动力学的影响

采用的刺激参数为双脉冲刺激：将膜电位钳制在 − 100 mV，给予细胞一个+50 mV、时长为 80 ms 的预脉冲刺激，间隔 1～256 ms 之后，再给予细胞一个+50 mV、时长为 80 ms 的测试脉冲刺激，记录的电流示意图如图 5b 所示。在不同的时间间隔下，预脉冲刺激得到的电流峰值为I₁，测试脉冲得到的电流峰值为I₂，I₂/I₁ 作为纵坐标，不同的时间间隔作为横坐标来绘制I_A 的复活曲线。画出散点图之后，用单指数方程I₂/I₁ = A+B exp( − t/τ) 进行拟合，得到时间常数τ，拟合结果见表 2，统计结果表明 20 Hz 磁刺激较 0.5 Hz 磁刺激与对照组的时间常数明显延长，而 0.5 Hz 磁刺激组与对照组之间没有明显区别。

3. 讨论

大脑海马区受损会使学习记忆能力衰退，在老化过程中和一些神经退行性疾病中是易受损伤的区域^[25]。DG 区是海马体的重要组成部分，在情景记忆、空间记忆和对新环境的探索等行为学实验中起着重要作用。有研究显示，大脑皮层 DG 通路的功能障碍及神经元损伤与老年人群中最常见的神经退行性疾病 AD 的病理状态有关^[26]。神经元作为一种可兴奋细胞，在受到刺激之后产生动作电位的能力称为神经元的兴奋性。神经元的自发放电、静息膜电位和动作电位的发放频率是衡量其兴奋性的重要指标。

本研究结果显示，20 Hz 磁刺激组出现自发放电，静息膜电位向去极化方向移动，动作电位发放个数显著高于对照组，表明高频磁刺激可以提高神经元的兴奋性，0.5 Hz 磁刺激组则结果相反。对单个动作电位的电特性的分析结果显示，施加 20 Hz 磁刺激之后的神经元阈值明显降低，表明神经元兴奋性提高。动作电位的半波宽是指峰值一半的时间跨度，代表整个动作电位的时程长短^[22]；达峰时间是指从刺激开始到动作电位峰值的时间，时间越短代表离子通道的开放与关闭的速度越快，去极化的过程越快^[27]；最大斜率出现在动作电位上升支，代表膜电位去极化的最大速度，这些变化与细胞膜上的电压门控性钠通道和钾通道的开放密切相关^[11]，高频磁刺激后神经元动作电位的半波宽和达峰时间明显缩短，最大斜率显著增加，表明电压门控离子通道特性在一定程度上受到了磁刺激的影响。有研究报道，在施加长期磁刺激之后，大鼠海马 CA1 区的细胞阈值降低，最大上升斜率增大，神经元的兴奋性提高^[11]，与本研究中动作电位阈值及其最大斜率的变化结果一致。有研究显示，神经元兴奋性提高的同时，达峰时间明显增加，动作电位的上升支主要是由于电压门控钠通道的开放导致大量钠离子内流^[22]，造成该指标差异的原因可能是外加刺激对电压门控钠通道的动力学特征的影响不同，因此，不同频率的磁刺激对离体脑片海马 DG 区神经元钠离子通道的影响是下一步要探究的工作。

钾离子通道作为人体中种类最多、分布最广的离子通道，在调节静息膜电位和形成动作电位的过程中担任着重要的角色^[28]。带电离子（如 Na⁺、K⁺、Cl⁻、Ca²⁺等）的跨膜运动会表现为一定的膜电位，磁刺激在穿透脑组织产生磁场的过程中可能会影响离子通道蛋白，导致带电离子的泄露从而改变细胞内外的离子分布^[29]，为带电离子的跨膜运动提供驱动力，进而改变细胞膜电位。不同频率的磁刺激诱导的神经元兴奋性不同与突触可塑性和长时程增强效应相关，高频刺激更易促进与突触可塑性相关基因的表达^[30]。已有研究表明磁刺激可诱导细胞膜去极化并促进神经元突触谷氨酸受体上的钙离子内流，增加突触后膜上谷氨酸受体的数量进而提高神经元的兴奋性^[29]。目前，关于磁刺激的作用机制的研究尚无明确定论，其临床治疗效果也不统一。因此，继续探讨磁刺激作用的神经机制仍是未来生物电磁方面的研究重点。

4. 结论

20 Hz 磁刺激明显改变了急性分离的脑片海马 DC 神经元的静息膜电位和动作电位及其自身电特性，提高了其神经兴奋性，以电压依赖的方式抑制了两种电压门控钾离子通道的电流幅值，明显将 A 型钾通道的失活曲线向左移动，即半数失活电压向超极化方向移动，复活时间延长。0.5 Hz 磁刺激对钾离子通道动力学无明显影响，但改变了细胞的静息膜电位及其他电特性，并明显提高了钾通道的电流峰值。根据以上结果，我们得出：高频磁刺激可显著促进离体脑片海马 DG 区颗粒细胞的兴奋性，低频磁刺激则抑制神经元的兴奋性，其部分作用可能是通过改变电压门控钾离子通道的动力学特征来实现的。

利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。

Funding Statement

国家自然科学基金重点项目（51737003）；国家自然科学基金面上项目（51677053，52077057）；国家自然科学基金青年基金（51507046）