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Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi = Journal of Biomedical Engineering logoLink to Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi = Journal of Biomedical Engineering
. 2022 Oct 25;39(5):1022–1032. [Article in Chinese] doi: 10.7507/1001-5515.202111040

荧光共振能量转移聚合物胶束及其作为药物载体的研究进展

Research progress on the fluorescence resonance energy transfer-based polymer micelles as drug carriers

Linrui JIANG 1, Ni ZENG 1, Qingshan MIAO 1, Changqiang WU 2, Shaoyun SHAN 1, Hongying SU 1
PMCID: PMC9927713  PMID: 36310492

Abstract

Polymer micelles formed by self-assembly of amphiphilic polymers are widely used in drug delivery, gene delivery and biosensors, due to their special hydrophobic core/hydrophilic shell structure and nanoscale. However, the structural stability of polymer micelles can be affected strongly by environmental factors, such as temperature, pH, shear force in the blood and interaction with non-target cells, leading to degradations and drug leakage as drug carriers. Therefore, researches on the structural integrity and in vivo distribution of micelle-based carriers are very important for evaluating their therapeutic effect and clinical feasibility. At present, fluorescence resonance energy transfer (FRET) technology has been widely used in real-time monitoring of aggregation, dissociation and distribution of polymer micelles (in vitro and in vivo). In this review, the polymer micelles, characteristics of FRET technology, structure and properties of the FRET-polymer micelles are briefly introduced. Then, methods and mechanism for combinations of several commonly used fluorescent probes into polymer micelles structures, and progresses on the stability and distribution studies of FRET-polymer micelles (in vitro and in vivo) as drug carriers are reviewed, and current challenges of FRET technology and future directions are discussed.

Keywords: Fluorescence resonance energy transfer, Polymer micelles, Fluorescent probe pairs, Drug carrier

引言

聚合物胶束是由双亲性共聚物在水溶液中自组装形成的外部亲水、内部疏水的核/壳结构纳米粒子。因其具有临界胶束浓度（critical micelle concentration，CMC）低、尺寸小、制备简单、增容性好、动力学稳定性高、毒性低以及易于进行表面功能基团修饰等优点，常被用于污水处理、环境净化、微量物质的富集以及生物医学领域。尤其是作为药物载体应用时，胶束疏水内核可装载各种抗癌药物，提高药物的稳定性和溶解度而不改变药物的结构和性能；同时，其亲水外壳易进行化学修饰从而实现高效精准的靶向药物递送；另外，胶束的纳米级粒径使其具有一定的被动靶向功能[1]。因此，聚合物胶束已成为最具吸引力的油溶性抗癌药物载体之一[2-3]。

但是，聚合物胶束是一种通过疏水效应、静电作用等可逆稳定力的作用而形成的热力学自组装结构，在复杂的体内/外环境下不可避免地会被多种失稳机制所瓦解，从而造成药物泄漏、蛋白质吸附、蛋白质渗透以及被稀释到临界胶束浓度以下等情况。这些局限性使得胶束类纳米载体系统的体内应用及临床转化受到了极大限制[4]。因此，研究聚合物胶束的体内外稳定性、进入机体后的体内分布情况及代谢行为，对胶束结构功能设计及判断其作为生物医学材料的应用潜力至关重要[5]。例如，胶束在血液中的稳定性和完整性作为一个基础而又非常重要的课题一直受到人们的高度重视，因此，各领域学者提出多种稳定性检测方法并进一步用于聚合物胶束结构稳定性的研究。例如：高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）[6]、凝胶渗透色谱法（gel permeation chromatography，GPC）[7]、动态光散射（dynamic light scattering，DLS）[8]、荧光信号表征CMC值和荧光共振能量转移技术（fluorescence resonance energy transfer，FRET）等。其中，FRET技术基于荧光团之间的非辐射能量转移原理，具有高信噪比、高比率荧光读数、高时空分辨率等优点[9]，可实时监测聚合物胶束体内/外完整性以及定量测定分子之间的距离[10-12]，已经成功用于检测纳米药物与生物环境的相互作用，指导纳米药物的开发等相关研究[13-15]。因此，越来越多的研究人员通过物理包埋或化学键合的方法将荧光探针与两亲性聚合物复合形成FRET-聚合物胶束，使胶束具备荧光性能，继而或以荧光对模拟药物，或进一步采用疏水药物与荧光染料形成FRET探针对，并在一定的激发波长下通过成像手段来监测FRET-聚合物胶束在体内/外的药物释放、动力学行为和FRET比率等，以此作为其稳定性及分布情况的评价指标。这种由FRET探针对与聚合物胶束复合形成的FRET-胶束为探究胶束在生物医学方面实际应用的可行性，以及实现诊疗一体化提供了一种途径。

本文简单介绍了聚合物胶束的性质及其作为药物载体的稳定性以及FRET技术的工作原理，着重综述了几类常用的FRET荧光探针与聚合物胶束复合形成FRET-聚合物胶束的方法，以及通过荧光光谱分析判断FRET-聚合物胶束的体内/外团聚和解离行为，并对FRET-聚合物胶束作为药物载体方面的应用前景和挑战进行了总结和展望，希望能为聚合物胶束稳定性研究及其作为生物医用材料的应用研究提供一定的参考。

1. 荧光共振能量转移技术

FRET是指当两个荧光分子间距足够小时，供体荧光分子通过偶极-偶极相互作用将能量以非辐射的方式转移给邻近的受体荧光分子，使得供体的荧光强度较其单独存在时降低（荧光猝灭），而受体分子的荧光强度大大增强（敏化荧光）的现象[11]，该技术是监测两个或多个荧光团之间非辐射能量转移及分子间距的重要手段。20世纪40年代后期Theodor Förster首次观察到了FRET现象，并提出了著名Förster理论公式（1），因此它也被称为Förster共振能量转移[16]。

1. 1

其中，Inline graphic 是辐射速率（通常小于 Inline graphic 数量级），Inline graphic 是Förster半径。

Förster公式的提出为非辐射能量传递提供了定量的解释，解决了围绕荧光猝灭实验的谜题，揭示了FRET现象的原理[17]。从那时起FRET技术就在各种研究领域逐渐取得了重大应用研究进展，尤其是在生物医学领域的诊疗一体化研究方面得到了广泛应用。产生FRET现象需要两个先决条件：第一是供体荧光分子的发射光谱和受体荧光分子的吸收光谱必须要有超过30%的光谱重叠；第二是供体分子和受体分子的距离要足够近（< 10 nm）[18]，来自供体转移的发射能量通常会触发与之相距1～10 nm内的受体发射荧光[19-23]，从而产生一种非放射性能量转移行为，即FRET现象，如图1所示。

图 1.

图 1

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Schematic representation of specific requirements of fluorescent probes for FRET phenomena and signal detection. Reprinted with permission from ref. [11] (Sanders et al. 2021). Copyright 2021 Portland Press

荧光探针对产生FRET现象及信号检测的特殊要求示意图[11]

由于FRET技术的这种独特机制，使其具有非常高的灵敏度、选择性、较低的测量时间以及不受其他溶剂或分子的干扰等优点。因此，FRET技术已成为高度灵敏的检测工具，用来探测生物领域中各种复杂现象[24-27]，尤其是将荧光探针对与聚合物胶束结合并通过共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy，CLSM）成像技术和公式（2）计算FRET效率[28]等手段来监测胶束在体内外的完整性、体内分布以及药物控释精准程度等，已成为该领域的重点研究方向。

FRET效率计算公式：

1. 2

其中，E是FRET效率，IDA是胶束中受体存在时供体的荧光积分强度，ID是胶束中没有受体时供体的荧光积分强度。

值得注意的是，FRET效率尤其对供体和受体之间的距离变化高度敏感，这可能是由感知域的断裂及随后的供体和受体的扩散、FRET荧光探针对的构象变化以及机械张力三方面引起的[12]。并且，对于不同的荧光探针，在监测聚合物胶束稳定性以及载药性能时，所展示的现象与机制也有所不同。目前常用于研究FRET-聚合物胶束结构及性能的FRET策略主要有两种：① 荧光猝灭的FRET-ON到荧光恢复的FRET-OFF：形成胶束时因为猝灭剂的存在荧光消失，胶束解离时荧光与猝灭剂分开，逐渐恢复荧光强度[29]；② 受体荧光增强的FRET-ON到受体荧光减弱的FRET-OFF：即形成胶束时有明显的供体能量转移现象，胶束解离或在酶存在下使受体结构发生改变时FRET现象消失[30-32]。本文依据这两种策略，对常用的几种FRET荧光探针复合聚合物胶束的方法、产生的FRET现象以及FRET-聚合物胶束的稳定性、体内外分布情况和载药性能研究进展进行了综述。

2. 几种常用的FRET-聚合物胶束

FRET-聚合物胶束是指将FRET荧光探针对与聚合物胶束通过物理/化学作用复合形成的具有FRET现象的胶束团聚体。荧光探针对的种类及复合方式是决定所获得聚合物胶束的FRET行为及应用性能的关键。常见的荧光染料有花菁（cyanine，Cy）类[33]、亲酯性二烷基碳菁（dialkylcarbocyanines）类[34]、异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）[35]、香豆素6[36]和罗丹明B（Rhodamine B，RhB）[37]等。大部分研究以荧光团模拟脂/水溶性的药物，通过记录FRET信号的变化，研究药物在体内/外的分布情况以及从纳米载体中释放的动力学信息，指示胶束的团聚与解离行为[38]。由于FRET效率对供体和受体之间的距离变化高度敏感，所以对荧光染料的选择也有要求。这一部分将主要介绍三类常用的荧光染料与聚合物胶束结合方法及相关结构性能的研究进展。

2.1. 花菁类聚合物胶束

大多数染料在结构上都和唯一经过美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）认证的菁类染料-吲哚花菁绿（indocyanine green，ICG）有相似之处[39]。Cy染料即在其结构上引入了磺酸基团、N-羟基琥珀酰亚胺活性酯等基团来增加它的溶解性或提高活性[40]。与其他常见染料如FITC、香豆素6和罗丹明B相比，Cy类染料具有更高的荧光稳定性、更好的自荧光分离能力和更小的细胞损伤性[41-42]。因其独特的共轭骨架结构以及优良的荧光性能，被广泛应用于聚合物胶束团聚与解离以及生物成像研究。

Fu等[43]采用第一种FRET策略，即在FRET-胶束中染料和猝灭剂聚集时，特定的猝灭剂会猝灭荧光染料的荧光（FRET-ON），而当染料和猝灭剂分离以阻断FRET过程时，染料的荧光信号再次出现（FRET-OFF）。该研究通过可逆加成-断裂链转移（reversible addition-fragmentation chain transfer，RAFT）聚合、开环聚合和点击反应合成了聚甲基丙烯酸乙二醇酯（POEGMA）与聚L-天冬氨酸（PBLA）的两亲共聚物，进一步采用N，N-二异丙基乙二胺（DIEDA）和N，N-二丁基乙二胺（DBEDA）对PBLA链段进行氨基化反应，制得了可电离多种叔胺的两亲性嵌段共聚物。所得嵌段共聚物可在中性pH条件下自组装形成稳定的胶束，并在弱酸性条件下解体。利用该聚合物的氨基分别与羧基修饰的Cy5.5和猝灭剂（fluorecent quencher，FQ）通过酰胺反应偶联并自组装形成具有pH敏感性的FRET-聚合物胶束。对FRET-胶束在不同环境pH作用下的FRET现象及释药行为研究表明：FRET效率与猝灭剂加入量成正比，且在pH 6.5～4.0环境下，释药率可高达80%以上；而pH 7.0～11条件下，其释药率仅为35%。这是因为酸性条件下猝灭剂上的叔胺基逐渐被质子化，胶束发生解体从而表现为较低的稳定性，而在中性及碱性环境下胶束稳定性高。类似的，Ruan等[44]也采用了同样的荧光染料Cy5.5和猝灭剂FQ，制备了具有还原/氧化响应性的FRET-胶束。Cy5.5的羧基与多聚赖氨酸（PLYS）类嵌段聚合物POEGMA-PLYS的氨基以酰胺反应偶联获得两亲性聚合物POEGMA-b-PLYS-Cy（PCy），猝灭剂的羧基与POEGMA-SS聚合物的羟基通过酯化反应偶联为含有二硫键的聚合物POEGMA-SS-Q（PFQ）（见图2a）。PCy与PFQ混合自组装形成具有氧化/还原响应性的PCQ胶束。通过荧光光谱分析和紫外光谱研究表明：FRET效率同样与Cy5.5/FQ比值有关，且因PCQ胶束具备氧化/还原响应性，当其处于高谷胱甘肽（glutathione，GSH）浓度环境时，POEGMA和FQ之间的二硫键断裂导致FQ脱落，胶束瓦解，对阿霉素（doxorubicin，DOX）24 h内累计释放量可达60%，相对于不含GSH的PBS介质中药物释放率18%而言有显著提升（见图2b）。这类环境响应型FRET-胶束可实现装载药物的刺激响应释放，是一类具有潜在应用价值的智能载药系统。

图 2.

Preparation and drug release properties of PCQ micelles

PCQ胶束制备及释药性能

a. PCy及PFQ两亲共聚物的合成路线；b.最佳Cy/FQ物质的量之比的荧光强度及PCQ@DOX胶束DOX释放曲线[44]

a. the synthetic route of the PCy and PFQ amphiphilic copolymer; b. fluorescence intensity in optimum molar ratio of Cy/FQ and DOX delivery curves of the PCQ@DOX micelles. Reprinted with permission from ref. [44] (Ruan et al. 2018). Copyright 2018 American Chemical Society

图 2

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与染料和猝灭剂组成的FRET-聚合物胶束发生荧光猝灭（FRET-ON）现象不同，Liang等[45]采用第二种FRET策略，更加直接地观察到了聚合物形成胶束时受体荧光增强、供体荧光强度减弱（FRET-ON）到胶束裂解成聚合物时受体荧光减弱、供体荧光增强（FRET-OFF）的现象。该研究工作采用聚甲氧基聚乙二醇（mPEG）引发己内酯（ε-CL）单体开环聚合制备了聚甲氧基聚乙二醇-聚己内酯（mPEG-PCL）两嵌段共聚物，进一步将羧基修饰的Cy5（受体）通过酯化反应与PCL的端羟基进行偶联，获得的两亲性聚合物mPEG-PCL-Cy5自组装形成胶束，同时对羧基修饰的Cy3（供体）进行包埋形成了FRET-胶束。荧光光谱分析同样发现：不同Cy3含量所产生的FRET现象不同，Cy3含量为5%～2%时，胶束的FRET比率在3.8～2.0左右，选用Cy3含量为4%的FRET-胶束研究了其稳定性与药物释放可行性。结果表明：12 h内Cy3的释放率为68.1%并可持续释放48 h。Saqr等[46]也采用了与Liang同样的FRET策略探究了Cy3/Cy5.5与甲氧基聚氧乙烯-聚己内酯（PEO-PCL）制备的FRET-胶束作为靶向给药载体的药物释放动力学和稳定性。通过对两种FRET策略的研究不难发现，不论是化学偶联还是物理包埋，荧光探针对的物质的量是决定FRET效率的关键因素。

2.2. 亲酯性二烷基碳菁类聚合物胶束

亲酯性二烷基碳菁类染料是一类环境敏感型亲脂性膜染料，这类探针在进入细胞膜之前荧光非常弱，当它们与膜结合或者与亲脂性生物分子（例如蛋白质）结合时，其荧光强度显著增强，因此主要用于标记细胞膜以及其他脂溶性生物结构。其中DiO（3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate）和DiI（1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate）由于在近红外（near infrared，NIR）区域活性弱、激发波长短、组织穿透性差，多应用于体外细胞水平。DiR（1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindotricarbocyaine iodide）在NIR区域活性强，具有荧光干扰小、组织渗透深度大等优点，在活体研究（如小鼠和斑马鱼模型）中得到了广泛的应用。

Gupta等[47]制备了一种聚硫丙烯（PS74-CEP）与N，N-二甲基丙烯酰胺（DMA）的两嵌段聚合物（PS74-b-DMA310），并复合荧光探针对模拟疏水药物对形成的胶束靶向释药性能进行了研究。实验以常用链转移剂4-氰基-4-（乙基亚砜基硫羰基亚砜基）戊酸（4-cyano-4-(ethylsulfanylthiocarbonylsulfanyl) pentanoic acid，CEP）与硫丙烷（propylene sulfide，PS）为原料，采用硫代酰基转移法制备了聚（PS74-CEP）大分子，并用所得的聚（PS74-CEP）大分子与DMA通过RAFT法获得了PS74-b-DMA310嵌段聚合物，再将DiI和DiO荧光对采用物理包埋的方法与胶束复合形成FRET-聚合物胶束。体外药物释放行为研究表明：以DiO为模型药物测得胶束最大载药率为63%，药物释放率可达90%以上，且聚（PS74-b-DMA310）胶束在较宽的浓度范围内具有良好的细胞相容性。李瑞等[48]在Gupta的基础上也采用了DiO-DiI荧光对，将其物理包埋在聚合物PEG-PCL（M）胶束疏水内核中，形成了具有FRET现象的DiO-DiI-M胶束。同时通过酰胺反应将FITC通过化学键与PEG-PCL偶联，再物理包载荧光DiI制备了FITC-DiI-M聚合物胶束（FITC-DiI荧光对与DiO-DiI形成对照）。其中FITC的荧光指示着胶束本身的变化，DiI荧光指示着包载物的释放，因此两种胶束FRET变化的差异主要是由胶束的解离产生的。通过监测胶束在PBS介质中的荧光光谱发现，4 h内胶束都能保持完整结构。与其他染料可化学偶联不同，亲酯性二烷基碳菁类荧光染料多采用物理包埋的方式与聚合物胶束进行复合，这种方式使获得的FRET-胶束会因染料的泄露等情况造成荧光假象从而只能在短时间内对FRET-胶束的稳定性做出定量评价。

2.3. 与药物配对的荧光聚合物胶束

相对于其他荧光探针组合，通过荧光探针与自身具有荧光特性的药物组成的探针对的研究，不仅能够以FRET现象研究胶束的团聚与解离情况，而且可以对药物释放行为及路径进行直接检测，实现真正意义上的药物释放研究。

Zhou等[49]制备了一种物理包埋DOX的还原型荧光聚合物胶束，研究了由还原剂引发的FRET-聚合物胶束的解离和药物释放动力学。该研究以甲基丙烯酸丁酯（BMA）和还原响应型四苯乙烯-偶氮苯衍生甲基丙烯酸甲酯（TPE-AZO-MA）为单体，在1，4-二氧六环/水混合溶剂中通过RAFT反应合成了两亲性聚合物。随后，用聚合诱导自组装法（polymerization-induced self-assembly，PISA）成功制备了原位负载DOX的还原型聚合物胶束。在偶氮还原酶作用下胶束结构中的偶氮键断裂导致胶束粒径增大或发生解离，DOX的释放使得TPE的聚集诱导荧光性能因FRET-OFF而被有效地激活，并且载药胶束在酶水解环境下24 h内显示出58.5%的DOX释放量，可观察到溶液中明显的DOX荧光的增强现象。

与物理包埋药物不同，Yang等[50]开发了一类化学偶联表阿霉素（epirubicin，EPI）的生物可降解聚合物给药系统，并采用FRET技术对其药物释放进行了无创监测。该研究以常用多肽缩合试剂2-（7-氮杂苯并三氮唑）-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）为偶联剂，N-甲基丙烯酰甘氨酰苯丙酰亮氨酸（MA-GFLG-OH）和EPI为单体，通过RAFT和酰胺反应，制备了聚合物MA-GFLG-EPI[51]，再与Cy5-NH2进行氨解反应制得具有FRET效应的聚合物胶束。荧光光谱分析（激发光：490 nm）发现：EPI与Cy5的FRET比率为0.89，表明大部分胶束结构完整，与细胞孵育4 h后FRET比率为0.84，24 h后比率降至0.77。FRET比率的变化表明：随着时间的变化胶束开始瓦解，EPI分子从胶束中释放出来。Wang等[52]以四苯乙烯（tetraphenylethene，TPE）染料作为FERT供体通过酰胺键化学偶联到双亲性聚合物mPEG-Plys上，并进一步通过含二硫键的小分子中间体偶联姜黄素（Cur）作为药物和FRET受体，得到的两亲性聚合物mPEG-Plys（Cur）-TPE自组装成胶束（见图3a）。该FRET胶束在还原性环境（GSH或MCF-7细胞）下（见图3b），二硫键断裂释放Cur导致AIE荧光的“开启”和FRET信号的“关闭”，从而引发TPE和Cur的荧光增强。同时，MCF-7细胞在标记后一段时间也因为胶束结构瓦解而观察到了两种荧光信号的增强，且荧光强度随时间延长呈现增强趋势。该研究将FRET和TPE整合在一个胶束纳米平台上的新型策略，不仅研究了氧化/还原敏感胶束中姜黄素的释放动力学，而且相较于传统荧光染料，TPE类荧光染料不会因聚集荧光猝灭效应（aggregation-caused quenching，ACQ）在短时间内发生荧光猝灭现象，具有强抗光漂白能力，从而可在一定时间内持续对胶束载药性能进行监测并做出评价。

图 3.

Fluorescence intensity of redox responsive FRET-micelles

氧化还原响应性FRET-胶束荧光强度

a. FRET机制；b.还原性环境下FRET-胶束中TPE和Cur的荧光强度随时间变化[52]

a. FRET principle; b. the fluorescence intensities of TPE and Cur in FRET-micelles in response to reducing environment varied with time. Reprinted with permission from ref. [52] (Wang et al. 2018). Copyright 2018 Wiley-VCH

图 3

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3. FRET-胶束作为药物载体的应用

3.1. FRET-胶束完整性及药物释放行为体外研究

如上所述，稳定性、高效给药能力及良好的生物相容性是胶束作为纳米药物载体进入临床研究的关键。而直接监测胶束在体外的动态药物释放行为及生物相容性，对评估胶束能否进行体内实验和临床研究至关重要。

Miteva等[53]采用Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 546作为荧光探针对模拟药物，物理包埋到四组不同物质的量的比的聚二甲氨基乙酯嵌段共聚物（PD-b-pDPB）/聚乙二醇嵌段共聚物（PEG-b-pDPB）（100D/no PEG、50D/5K PEG、50D/10K PEG、50D/20K PEG）的聚合物中，形成FRET-胶束，并对具有细胞内递送障碍的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）进行递送。将该胶束与Luc-3T3细胞共孵育，通过CLSM在细胞水平上可视化监测siRNA释放过程。研究结果表明：当荧光分子被包裹在胶束中，探针对距离较近，FRET信号高；随着胶束结构的破坏，胶束逐渐解离，荧光分子被释放，FRET信号减弱，siRNA被有效释放。通过计算四组胶束在细胞内的FRET比率研究药物释放动力学发现：理想混合胶束配方为50D/20K PEG时，FRET比率低至20%左右，siRNA胞内有效释放为60%以上。

与通过荧光探针模拟药物不同，Chen等[54]成功研制了负载黄芩素的Pluronic P85/F68胶束（B-MCs），并将其用于克服耐药蛋白2（MRP2）介导的黄芩素外排治疗帕金森病（见图4a）。所获得的B-MCs胶束能提高黄芩素在细胞中的累积量和通透性。该研究将DiO/DiI探针对物理包埋入胶束再与过表达MRP2的犬肾细胞（MDCK-MRP2）共孵育，然后采用CLSM成像技术观察FRET现象（见图4b），结果如下：在前15 min细胞表现出很低的绿色荧光（DiO信号），MCs胶束主要以完整的形式被细胞摄取，DiO和DiI是在细胞内释放的，解决了因MRP2在胃肠道和血脑屏障中过度表达而影响药物高效递送的难题，且B-MCs胶束在24 h内黄芩素的累计释放率可达96%。这为研究Pluronic胶束通过细胞的完整性、药物释放性能以及逆转MRP2的机制奠定了基础。类似的，Chen等[55]将Cy5（受体）通过酰胺反应与双亲性棕榈酰壳聚糖进行偶联，并将其形成的胶束用于负载DOX（供体），制备了一种具有pH响应性的FRET-聚合物胶束纳米粒子（Cy5-NPCS NPs）。该胶束在中性pH环境下具有高稳定性，酸性条件下易瓦解。进一步将该胶束与HT1080细胞孵育后对药物在细胞内的释放及分布情况进行了研究发现：FRET-胶束在30 min～4 h随着DOX的释放逐渐瓦解，完成FRET ON到FRET OFF的转变。该研究工作将Cy5和DOX作为荧光探针对，实现了细胞内胶束结构完整性的实时监测，相对于其他以荧光探针模拟药物释放的研究[56-58]，更加直接地对药物分子的胞内释放行为及分布情况进行了监测。

图 4.

In vitro integrity study of DiO/DiI-MCs micelles

DiO/DiI-MCs胶束体外完整性研究

a. DiO/DiI-MCs胶束克服MPR2机制示意图；b. DiO/DiI-MCs胶束与MDCK-MRP2共孵育CLSM成像图及FRET光谱图[54]

a. schematic illustration of the mechanism on overcoming MRP2 of DiO/DiI-MCs; b. CLSM images and FRET spectra of the MDCK-MRP2 cells incubated with DiO/DiI-MCs micelles. Reprinted with permission from ref. [54] (Chen et al. 2017). Copyright 2017 American Chemical Society

图 4

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通过对FRET-胶束完整性及药物释放行为的体外研究不难发现，FRET-胶束在解决药物细胞内递送难点、增加药物在细胞中的累积量及通透性等研究领域有着重要的应用价值。

3.2. FRET-胶束体内分布及完整性研究

FRET-聚合物胶束的体内完整性及生物分布研究，能为胶束在血液中的稳定性以及在生物学方面应用的可行性判断提供重要依据。但由于技术挑战，大多数研究局限于体外药物释放研究，很少能实现关键的体内表征[59]，而且因体内、外释药行为缺乏统一性，胶束难以在体内显示出预期的精准靶向治疗优势[60-61]。因此，进一步了解聚合物胶束在体内的稳定性及生物分布情况具有重要研究价值[62]。

Chen等[63]将DiO（供体）/DiI（受体）荧光分子按质量比1/1（聚合物质量的0.5%）物理包埋到甲氧基聚乙二醇-乳酸乙醇酸嵌段共聚物（mPEG-PLGA）中制备了FRET-胶束（DiO/DiI-NPs），并对其体内完整性和药物的释放及分布进行了研究。斑马鱼活体成像系统（living imaging system，IVIS）成像实验表明：胶束在体内孵育1 h后FRET比率为0.84，大多数纳米颗粒在体内保持完整结构；孵育1～8 h，FRET比率从0.84下降到0.59，这表明纳米粒子在体内逐渐解离，导致DiO和DiI的分离。值得注意的是，在孵育48 h后，FRET信号仍然存在，FRET比率为0.32，这表明在体内仍然有少量的纳米颗粒保持完整结构。同时，在整个实验过程中，经DiO/DiI-NPs处理的斑马鱼没有表现出明显的毒性效应，证明该DiO/DiI-NPs具有良好的生物相容性。另外，Morton等[64]也使用含聚乙二醇的两亲性嵌段共聚物PEG-b-PPLG与Cy5.5（供体）和Cy7（受体）制备了FRET-聚合物胶束。该研究将FRET-胶束（大约为临界胶束浓度的三倍）通过尾静脉注射入实验小鼠体内，基于FRET现象利用IVIS对该聚合物胶束在小鼠体内的解离情况进行了实时监测，结果表明：胶束刚注入小鼠体内时FRET效率为96%，其结构非常稳定；比Chen的研究更进一步的是该PEG-b-PPLG胶束注射入体内后，72 h内FRET效率仍保持在50%～85%之间，证明此类胶束具有更高的体内稳定性。

此外，Hsiao等[65]不仅研究了胶束的体内稳定性，还对其生物分布进行了监测。该研究团队采用聚（环氧乙烷）类聚合物（PEO-PPO-PEO，pluronic F-68），以FITC（供体）及RhB（受体）为FRET探针对，制备了FRET-胶束（PM）。不同的供体/配体比例证明：受体含量相对较多时FRET现象更明显[66]，选用最高FRET比率0.8（胶束完整度最高）的PM通过CLSM监测其在活体眼角膜中给药时的稳定性和生物分布：小鼠眼睛局部给药1 h后，角膜组织中发现不溶性荧光团或亲水性质粒DNA与PM共定位，表明给药1 h后PM在角膜内仍然保持完整性，胶束能够从角膜上皮向眼睛输送药物，证实了PM作为药物载体的可行性和稳定性。

浙江大学申有青团队[67]采用高稳定性的PEG-PS聚合物胶束为对照组，对已应用于临床研究的PEG-PCL[或聚乳酸（polylactic acid，PLA]胶束的稳定性和体内分布情况进行了研究。该研究将疏水荧光探针Cy5-NHS-easter、Cy5.5-NHS-easter通过酰胺反应偶联在聚合物上形成FRET-胶束（见图5a），这种胶束只有在解离时才会导致FRET现象消失，排除了因物理包埋而引起的荧光假象，可通过FRET效率计算胶束在体内的完整度并实时追踪其分布情况。将PEG-PCL（PS）-Cy5.5胶束与Cy5标记的鼠白蛋白（MSA-Cy5）通过尾静脉注射到小鼠体内，静脉共聚焦FRET图像表明：由于血液剪切力的作用，大部分胶束发生解离，1 h内FRET-PEG-PCL胶束在血液中的FRET比率可达0.73，对照组FRET-PEG-PS胶束FRET比率最高为0.52，因此仅有20%左右的胶束保持完整（见图5b）。采用IVIS分别监测不同时间段FRET-胶束的小鼠体内成像和生物分布情况发现：FRET-PEG-PCL胶束在血液中迅速解离并被转移至全身，两小时后在肝脏中占比约36%。之后将正常肝脏与肝脏肿瘤组织分别切开，FRET-PEG-PCL胶束的肿瘤区切片的FRET效率达0.73，胶束完整度为88%（见图5c），即在血液剪切力的作用下保持完整结构的胶束能够到达肿瘤组织。该研究工作表明：FRET-PEG-PCL（PLA）类软核胶束进入血液循环系统后，由于血液剪切力和血浆蛋白的作用，胶束快速解离为聚合物单链并被清除，部分未解离的胶束则可到达肿瘤部位。因此，这类生物相容性高的FRET-胶束作为药物载体的体内完整性及给药分布研究，是实现体内精准靶向给药，让材料从实验室走向生活的关键研究手段。

图 5.

In vitro distribution and integrity of FRET-PEG-PCL micelles

FRET-PEG-PCL胶束体内分布及完整性研究

a. FRET-PEG-PCL胶束的制备示意图；b.小鼠尾静脉注射FRET-胶束后静脉CLSM图像和FRET光谱图；c. FRET-胶束静脉注射活体显像和生物分布[67]

a. schematic illustration of the preparation of PEG-PCL-FRET micelles; b. CLSM image and FRET spectra of a mouse vein after injection of FRET-micelles via the tail vein; c. the IVIS and biodistribution images of FRET-micelles. Reprinted with permission from ref. [67] (Sun et al. 2018). Copyright 2018 American Chemical Society

图 5

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4. 结论与展望

在胶束中以物理包埋或化学键合等方式引入FRET荧光探针对形成FRET-胶束，不仅可实现对油溶性抗癌药物的包埋，研究药物释放动力学和胶束体内/外稳定性，还能实现实时监测胶束体内分布情况和靶向治疗效果等目的，拓展聚合物胶束在药物释放方面的研究深度，为聚合物胶束作为载体系统的应用研究提供大量理论依据。

然而，大部分研究工作以荧光探针模拟药物进行胶束的药物释放和体内分布研究，极少将药物与荧光染料结合形成FRET荧光探针对，从真正意义上对药物释放动力学、胶束进入体内后的生物分布和靶向治疗效果进行研究。因此，将药物与染料组成FRET荧光探针对，研究胶束的体内药物释放动力学和分布情况，是该领域的一个重要发展方向。其次，由于现阶段大部分荧光染料存在聚集荧光猝灭效应，无法达到长期的荧光信号成像追踪效果，因此由唐本忠院士课题组提出的聚集诱导发光新概念的荧光探针因其独特的抗洗脱、抗光漂白能力强、对活体损伤小、穿透力强等优势已成为制备FRET-聚合物胶束用于研究胶束稳定性及药物释放动力学的发展趋势。最后，因大部分染料在纳米颗粒中，存在组织渗透深度有限、靶向性差和生物相容性差等问题，将FRET技术应用于纳米药物生物活性临床研究的报道比较有限，因此，由生物发光分子作为荧光供体的生物发光共振能量转移（bioluminescent resonance energy transfer，BRET）技术因不需要外部激发光源而消除了荧光染料光漂白，在富含血细胞或血红色素的组织及活体成像中，由于生物体内光吸收、自发荧光的减少，使BRET在信噪比方面具有明显优势，被认为是荧光共振能量转移成像技术的新方向。

重要声明

利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：蒋林芮完成文章的撰写；曾妮、苗青山进行文献收集工作；苏红莹、陕绍云、吴昌强进行文章指导工作。

Funding Statement

国家自然科学基金（51963013）；云南省“万人计划”青年拔尖人才专项（YNWR-QNBJ-2019-085）；医学影像四川省重点实验室（川北医学院）开放课题（SKLMI201902）

National Natural Science Foundation of China; Yunnan Ten Thousand Talents Plan Young & Elite Talents Project; Fund of Sichuan Key Laboratory of Medical Imaging (North Sichuan Medical College)

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Articles from Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi = Journal of Biomedical Engineering are provided here courtesy of West China Hospital of Sichuan University

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