小分子醇类对磷脂水合和脂质体形成的影响研究

Abstract

Liposomes with precisely controlled composition are usually used as membrane model systems to investigate the fundamental interactions of membrane components under well-defined conditions. Hydration method is the most common method for liposome formation which is found to be influenced by composition of the medium. In this paper, the effects of small alcohol (ethanol) on the hydration of lipid molecules and the formation of liposomes were investigated, as well as its coexistence with sodium chloride. It was found that ethanol showed the opposite effect to that of sodium chloride on the hydration of lipid molecules and the formation of liposomes. The presence of ethanol promoted the formation of liposomes within a certain range of ethanol content, but that of sodium chloride suppressed the liposome formation. By investigating the fluorescence intensity and continuity of the swelled membranes as a function of contents of ethanol and sodium chloride, it was found that sodium chloride and ethanol showed the additive effect on the hydration of lipid molecules when they coexisted in the medium. The results may provide some reference for the efficient preparation of liposomes.

引言

生物膜在生命体中（除病毒外）广泛存在，是生命体中至关重要的一种功能结构，与生命活动中能量转换、物质运送、信息识别与传递等重要功能息息相关^[1-2]。生物膜的基本形态都是双分子层片层结构，组成成分主要包括脂质、蛋白质及少量与之相结合的糖类，其中大部分脂质成分为磷脂。然而，生物膜的高度复杂性和动态性使直接针对自然生物膜的相关研究变得极为困难。因此，基于磷脂自组装形成的人工生物膜结构，包括二维平面磷脂膜和三维脂质体，常被用作模型来研究生物分子在膜上的行为以及它们对膜性质的影响等^[3]。由于基于二维平面膜的研究不可避免地会受到来自基底的影响^[3]，巨型脂质体成为前景最好、应用最广的一种选择^[1]。例如，Garten等^[2]将β-酪蛋白封装到巨型单层脂质体（giant unilamellar vesicle，GUV）上，构建了一个稳定、高阻抗的GUV系统。基于该系统，可以利用膜片钳技术在生理张力下对特定离子通道和转运体进行电生理研究。这些研究对认识各种生命活动具有重要意义^[4]。

脂质体制备是脂质体应用的重要前提。在脂质体相关研究中，往往采用水合法（又称膨胀法）制备无油脂质体（见图1）。它主要包括以下三个步骤：① 将磷脂溶解于有机溶剂；② 待有机溶剂挥发后，在固体基底上形成一层干燥磷脂膜；③ 将干燥磷脂暴露于水环境中，磷脂分子自组装形成规则膜结构。最常用的电形成法便是水合法的一种，它是在温和水合法基础上通过施加外部电场来加快脂质体形成的一种方法^[5]。大量研究表明当利用水合法制备脂质体时，脂质体的形成效果容易受水环境影响。例如，当水溶液中有离子出现时，脂质体制备（特别是巨型脂质体制备）受到抑制^[6-7]。高浓度蔗糖溶液也被发现会抑制脂质体形成^[8]。

图 1.

The schematic diagram of liposome preparation when using hydration method (or swelling method)

水合法（膨胀法）制备脂质体示意图

磷脂水合是脂质体形成的必经过程，包括水溶液中磷脂分子重排、磷脂膜膨胀与融合。为了有效制备盐溶液中的巨型脂质体，我们^[9]曾考察了氯化钠对磷脂水合的过程和结果的影响。结果表明，随着水溶液中离子出现和离子浓度升高，水合磷脂膜变得越来越稳定。针对这一实验结果，我们分析氯化钠之所以抑制巨型脂质体形成，可能是因为增强了磷脂分子所受的疏水作用。强大的疏水排斥下，磷脂膜被牢牢固定于基底。基于此，我们^[10]对芯片进行氧等离子处理，使基底变得亲水。这一操作促使磷脂膜更易膨胀和脱落，进而促进巨型脂质体形成。

除了离子外，醇分子也常出现在生物膜环境中，并与磷脂分子产生特定相互作用，从而影响生物膜的形成、结构和功能。结构简单的小型醇分子，如甲醇和乙醇常被用作研究模型^[11]。例如，Ma等^[12]研究了甲醇与烷基面间的相互作用，发现甲醇会降低两个烷基面间的疏水黏附。他们猜测甲醇可能破坏了膜附近的水结构，还可能破坏烃分子间的疏水缔合。Hwang等^[13]分析了甲醇对多肽（BBA5）结构的影响，发现甲醇可以增强肽链之间的相互作用，促进二级结构形成。Manca等^[14]发现醇分子与磷脂分子结合，会引起双层膜结构的显著变化。低浓度时，醇分子参与磷脂自组装，磷脂分子形成交叉膜结构；高浓度时，醇分子的出现诱导磷脂分子形成非双层结构。在醇分子与磷脂分子间的具体相互作用上，Feller等^[15]认为醇烃基朝向磷脂分子的非极性端，醇羟基与磷酸基团形成氢键^[16]。除此之外，研究还表明醇分子让磷脂烃链变得无序，降低磷脂膜的相变温度及双分子层厚度^[17-18]。醇分子对相变温度的影响与醇烃链的长度相关^[14]。

相对于甲醇，乙醇作为一种常见的食品成分和有机溶剂，出现在生物膜环境中的机会更多。因此，本文利用微芯片脂质膜研究方法^[9]，探讨了乙醇对磷脂水合和脂质体形成的影响。除此之外，无论是体外研究还是体内研究，这些分子或离子往往不单独存在，而是与其他溶质共存于液体环境中^[19]。因此，本文还探讨了乙醇与氯化钠共存时对磷脂水合和脂质体形成的影响。由于醇类和磷脂等小分子物质在不同聚集状态和复杂微环境下的相互作用很难用传统示踪及定量分析方法进行检测分析，因此本文采用显微荧光技术，通过磷脂水合过程中膜结构的动态变化，间接反映环境分子与磷脂的相互作用及其对磷脂水合和脂质体形成的影响。除此之外，本文半定量地计算了乙醇对膜相对荧光强度和相对连续度的影响，希望从中获取更多信息。

1. 实验部分

1.1. 仪器及试剂

FA 2004B电子天平（上海佑科），ISC10激光打标机（武汉华工激光工程），PDC-GC-M等离子清洗仪（成都维克光谱），BX53生物荧光显微镜（日本奥林巴斯），DZF-6050真空干燥箱（上海佑科）。

从大豆中粗提取的磷脂酰胆碱（L-α-phosphatidylchoine，PC，14%∼23%）以及荧光探针（DiI，1,1'-dihexadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbo-cyanie perchlorate，ex/em：549/564 nm，Molecular Probes）均购自Sigma-Aldrich（美国）；玻璃基片购自珠海凯威（中国）；聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）购自Dow Corning（美国）；聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）购自怡康（中国）；氯化钠、乙醚、无水乙醇购自东方化玻（中国）。

1.2. 芯片及装置

实验中采用的微腔室芯片结构由上、下两层玻璃与中间的PDMS垫片构成（见图2a）。芯片上有六个半径为10 mm、高度为1 mm的圆柱形腔室。将顶部玻片封装于腔室上方后，腔室两侧自然留出狭长的进样和出样通道（宽度为2 mm），两侧通道可始终与大气保持连通。进出样通道与反应室之间以半径为2 mm、转角角度为65^o的弧形通道过渡。相比于直角设计，这种结构可以避免进样时产生气泡，降低流体运动对膜的扰动。

图 2.

The experimental setup

实验设置

a. 包含6个微腔室的实验芯片；b. 实验流程示意图

a. the chip used in this study which consists of 6 chambers; b. the experimental processes

芯片设计与加工详见参考文献[9]。芯片加工时，先利用激光打标机在PMMA基片上烧蚀芯片模具。将PDMS与固化剂按10∶1的质量比混合并充分搅拌，然后置于真空箱中减压完全去除气泡。随后，将混合好的PDMS浇注到芯片模具上，静置1 h，再于70 ^oC下固化2 h。在固化的同时，将1片10 cm × 10 cm的玻璃基片和6片2 cm × 2.5 cm的玻璃盖片分别用无水乙醇与三蒸水清洗干净，置于烘箱中完全烘干。待PDMS固化后，将PDMS胶块从模具上剥离并与玻璃基片一同置于等离子清洗仪中，利用氧等离子清洗30 s。取出PDMS胶块和玻璃基片通过热板层压法键合，形成含有6个反应腔室的芯片。

1.3. 实验过程

磷脂水合的实验过程如图2b所示，主要包括成膜、封闭、加样和水合四个步骤。具体地，先将40 mg的PC溶解于10 mL乙醚中，再加入30 μL溶有荧光染料的二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液。磷脂与荧光染料的质量比为99.5∶0.5。将40 μL配制好的磷脂溶液滴加到腔室底部，为了避免乙醚挥发时气流的影响，芯片置于一个较小盒子内，使成膜过程在几乎密闭的小空间内进行。乙醚挥发后，在基底形成一层干燥的磷脂膜。干燥磷脂膜呈“咖啡环”形态，四周为较厚的环状膜，中间为相对均匀的平面膜。将成膜后的芯片置于真空干燥箱中室温过夜，完全去除剩余有机溶剂。水合实验前，将六块玻璃盖片分别固定在六个腔室顶部，形成完整的实验芯片。然后，将芯片置于荧光显微镜的载物台上，从一侧进样口缓慢加入1 mL乙醇水溶液或乙醇盐溶液，观察磷脂水合情况和脂质体形成情况。

1.4. 结果处理

充分水合4 h后，快速记录水合结果的荧光显微图像，并利用MATLAB软件（MathWorks，美国）针对膜相对荧光强度和膜相对连续度两个参数进行定量分析。具体地，选取同一芯片上相同条件下的6组图片进行处理，计算膜的相对荧光强度和相对连续度。利用相同方法，多次重复实验获得多组数据，进行绘图分析。由于干燥磷脂膜具有明显的“咖啡环”效应，每组图片均包含多张来自腔室中心区域和边缘区域的图片。荧光强度和连续度均利用图片的灰度值计算得到，灰度值阈值的选择如图3所示，以覆盖所有红色区域为准。其中，荧光强度为f = ∑g/s_p，式中，g为大于阈值的灰度值，s_p为灰度值大于阈值的像素点之和。荧光强度（f）为一组图片的平均值。对同一芯片的6组图片处理完后得到6个平均灰度值。然后，分别除以纯水的荧光强度进行归一化处理，得到相对荧光强度。连续度c = s_p/s，其中s为图片的总像素点之和。同样地，连续度也是一组图片的平均值。对同一芯片的6组图片处理完后得到的6个平均灰度值，分别除以纯水的对应值得到相对连续度。

图 3.

Setting of the threshold value

阈值设定

a. 乙醇水溶液中磷脂水合结果的荧光图片，图中标尺为100 μm；b. 根据图a中白线上的灰度值分布选取合适阈值

a. the experimental fluorescence image, the scale bar is 100 μm; b. setting of the threshold value according to the gray values along the white line in the figure a

2. 结果

如图4所示，随着氯化钠浓度增加，磷脂膜变得越来越稳定且牢牢黏附于基底，脂质体形成受到严重影响。除此之外，磷脂膜的荧光强度增加，这说明膜中磷脂分子可能包裹得更加紧密。相比而言，单就对磷脂水合的影响，乙醇显示出相反结果。我们发现随着乙醇含量增加，水合磷脂膜变得越来越粗糙（见图4）。为了后续能够较好地对比乙醇和氯化钠的影响，本文水合结果图中的溶质含量均以氯化钠/水（氯化钠组）或乙醇/水（乙醇组和乙醇/氯化钠混合组）的物质的量之比表示，括号内分别为氯化钠浓度或乙醇体积分数，图中标尺均为100 μm。

图 4.

The results of hydration of lipid molecules in aqueous solutions with different contents of sodium chloride and ethanol

磷脂在不同含量的氯化钠溶液和乙醇水溶液中的水合结果

当乙醇体积分数小于20%（乙醇/水物质的量之比小于7.7%）时，乙醇的出现会促进磷脂膜膨胀和脂质体形成（见图4）。图5显示了直径大于50 μm的巨型脂质体产量随乙醇含量的变化。由于磷脂分子间的疏水缔合被明显破坏，乙醇体积分数大于20%后，脂质体产量下降。当乙醇体积分数达到40%时，磷脂膜几乎完全分散，形成不规则的簇状结构。与氯化钠溶液中牢牢黏附于基底的致密膜结构相反^[10]，这些不规则簇状膜结构与基底间的作用不强，在移动芯片时发生明显晃动。磷脂分子之所以能够自组装成规则单层膜或双层膜，得益于磷脂分子独特的双亲性。高含量的乙醇溶液中，磷脂分子不再形成规则膜结构说明磷脂分子的双亲性可能遭到破坏。

图 5.

The dependence of yield of giant lipid vesicles (GLVs) on the ethanol volume ratio after 4 hours

巨型脂质体产量随乙醇体积分数的变化

此外，由于生理条件下通常存在大量离子和非电解质，我们还考察了生理离子强度（约为150 mmol/L的氯化钠溶液）下，不同乙醇含量对磷脂水合和脂质体形成的影响。图6显示了将150 mmol/L的氯化钠溶液（氯化钠/水的物质的量之比为0.27%）与乙醇按不同比例混合时的磷脂水合结果。与纯水类似，随着乙醇含量增加，磷脂膜的连续性降低。当乙醇体积分数为40%（乙醇/水的物质的量之比为12.34%）时，膜完全分散，磷脂分子以团状结构出现。相较于乙醇水溶液中的簇状结构（见图4），乙醇/氯化钠混合水溶液中的团状结构中磷脂分子包裹得更加致密。这说明乙醇/氯化钠混合水溶液中，氯化钠保持着对磷脂膜的特异性影响。同样地，当乙醇体积分数小于20%时，乙醇促进磷脂膜膨胀和脂质体形成；当乙醇体积分数大于20%时，脂质体的产量迅速降低（见图5和图6）。

图 6.

The results of hydration of lipid molecules in mixed solutions with different contents of ethanol (the concentration of NaCl is 150 mmol/L)

磷脂在不同含量的乙醇/氯化钠混合溶液中的水合结果（氯化钠浓度为150 mmol/L）

氯化钠在水溶液中解离成Na⁺和Cl⁻，其中Na⁺是典型的kosmotropic离子，会压缩其水化壳内的水分子氢键结构。类似于对水施加一个压力，Na⁺水化壳内的水分子密度大于纯水^[20-23]。同样地，分子动力学相关研究表明Na⁺离子能够与磷脂分子的磷酸基团和羰基结合，桥连多个磷脂分子并增加局部的磷脂分子密度^[24-26]。磷脂尾链间的空隙随之减小，尾链间的范德华力增强，疏水缔合作用增强。这可能是膜荧光强度随氯化钠浓度增加而增强的原因。因此，为了定量分析乙醇含量对磷脂膜属性的影响，本文探讨了膜相对荧光强度和膜相对连续度随乙醇含量的变化，二者分别从分子层面和宏观层面表征磷脂分子间的疏水缔合。

如图7a所示，膜荧光强度随乙醇含量增加而持续降低。虽然氯化钠和乙醇对磷脂水合起相反作用，但是氯化钠的参与并没有改变乙醇对膜荧光强度的影响趋势。如图7b所示，当乙醇体积分数小于20%时，膜的连续度变化不大。在这一范围内，乙醇可能不影响膜的规则单分子层或双分子层结构。当乙醇体积分数大于20%时，膜的连续度迅速降低。此时，规则膜结构减少，大量磷脂分子形成簇状结构。同样地，氯化钠的参与并没有改变乙醇对膜连续度的影响趋势。除此之外，对比图4和图6，我们发现虽然乙醇会降低膜连续性，但是相比于乙醇溶液（见图4），乙醇/氯化钠混合溶液中磷脂分子包裹得更加致密（见图6）。因此，综上所述，当乙醇和氯化钠两种物质同时出现在磷脂的水合环境中时，两者对磷脂水合的影响可能起叠加作用。

图 7.

The dependence of membrane fluorescence intensity and membrane continuity on the ethanol volume

膜相对荧光强度和膜相对连续度随乙醇含量的变化

a. 膜相对荧光强度；b. 膜相对连续度

a. membrane fluorescence intensity; b. membrane continuity

3. 讨论

碱金属离子与磷脂分子间的相互作用已被广泛报道，基于现有研究我们猜想乙醇、Na⁺和Cl⁻在磷脂分子附近的分布大致如图8所示^[24-25,27]。Na⁺可以进入到磷脂头部构成的网络结构中，与磷酸基团和羰基中的氧原子结合^[24-25,27]。Na⁺作为kosmotropic离子，其电荷密度比水分子大，可以更加紧密地桥连多个磷脂分子^[26]，降低磷脂分子的扩散系数^[27]；同时也降低磷脂尾链间的距离，增大尾链间的范德华力。这可能是氯化钠诱导磷脂分子形成更加致密膜结构的原因。

图 8.

Schematic diagram of the interaction of ethanol, Na⁺ and Cl^－ with phosphatidylcholine

Na⁺、Cl^－和乙醇分子与磷脂分子间相互作用示意图

对于Cl⁻，磷脂分子上带负电荷的磷酸基团和部分负电荷的羰基阻止了Cl⁻靠近磷脂分子疏水端^[24-25]。Perttu等^[28]的研究结果也显示脂质体的渗透性更多取决于阳离子与羰基和磷酸基团间的相互作用。我们的研究也曾发现阴离子对磷脂的宏观水合无明显影响（尚未发表）。但是，Sachs等^[29-30]的研究显示大粒径阴离子与胆碱基团结合使磷脂头部发生反向，磷脂头部指向磷脂分子的非极性端。这或许是因为阴离子和胆碱基团均具有较大极化率，两者在结合时发生相互极化所致。但是，相比于其他卤素阴离子，Cl⁻的这种效果并不明显^[30]。因此，总的来说，Na⁺和Cl⁻均分布于磷脂分子的极性端，不影响磷脂分子的双亲性。

相比于无机离子Na⁺和Cl⁻，有机分子乙醇同时含有疏水乙基和亲水羟基。实验中，我们发现随着乙醇含量增加，磷脂分子间的疏水缔合被不断瓦解，磷脂水合态从规则膜结构逐渐演变为不规则的簇状或团状结构（见图4和图6）。基于此，我们猜测乙醇可能改变了磷脂分子的双亲性。如图8所示，乙基在疏水力驱动下朝向磷脂分子的非极性端，并通过疏水作用和范德华力与磷脂分子的尾链结合，降低磷脂分子的疏水性，增加其亲水性。除疏水作用外，色散力也常被认为是小分子靠近大分子表面的主要驱动力^[31-34]。但是Santos等^[35]认为色散力的作用范围极短，几乎只对与胶体表面接触的溶质起作用。Chong等^[36]的研究显示，蛋白质水合程度很低时，醇分子（乙醇和三氟乙醇）只与蛋白质的电荷位点结合；随着蛋白质水合程度增加，醇分子逐渐与蛋白质的极性位点结合；当蛋白质的水合程度与水溶液中的水合程度相当时，醇分子覆盖整个蛋白质。这也说明疏水力是驱动醇分子靠近非极性表面的主要作用力。虽然疏水力的来源不清，但实验和计算机模拟均证实了疏水力的存在^[37]。

除疏水乙基，乙醇分子的亲水羟基（―OH）也可能影响磷脂水合结果。Hwang等^[13]发现相较于水分子，甲醇分子更容易与蛋白质主链形成氢键。他们认为这是疏水甲基的作用，但是，这与Chong等的实验结果相反。Chong等^[36]的实验结果显示即使在低水合程度时，醇分子也能与蛋白质的电荷位点结合。这说明醇羟基与磷脂分子电荷位点间的结合应当是其本身的作用，而非醇烃基的作用。Leekumjorn等^[38]的研究结果显示糖分子能够优先与磷脂酰胆碱分子的胆碱基团结合；Cacela等^[39]的研究结果显示糖分子也能优先与磷脂酰乙醇胺分子的胺基结合。他们认为这是由于季胺氮的强电负性导致胆碱甲基被酸化所致。因此，类似于糖分子，乙醇羟基也可能与胆碱基团优先结合。只是，同阴离子一样，乙醇羟基与胆碱的结合可能不影响磷脂分子的宏观水合情况。由于乙醇的极化率较大，所以醇羟基的作用可能强于Cl⁻。

因此，综上分析，溶质与磷脂分子负电荷位点间的亲和性可能服从序列：Na⁺>水>―OH，与磷脂分子正电荷位点间的亲和性服从：―OH>Cl⁻>水。但是，由于靠近磷脂非极性端的极性基团为带负电的磷酸基团和羰基，所以前者是影响膜宏观形态的主要因素。氯化钠主要依靠Na⁺桥连多个磷脂分子，诱导致密膜结构形成。乙醇主要依靠乙基与磷脂分子非极性端结合，破坏磷脂分子双亲性，进而破坏磷脂分子间的疏水缔合。因此，由于主要作用位点的区别，在混合溶液中两种物质起叠加作用。

4. 结论

本文探讨了乙醇对磷脂水合和脂质体形成的影响，发现乙醇的影响与Na⁺刚好相反。Na⁺的出现可促使磷脂分子形成致密膜结构，抑制脂质体形成；乙醇的出现却不断减弱磷脂分子间的疏水缔合，在一定浓度范围内促进脂质体形成。通过考察膜相对荧光强度和膜相对连续度随乙醇含量的变化，发现混合溶液中氯化钠和乙醇对磷脂水合起叠加作用。我们分析氯化钠主要依靠Na⁺紧密桥连多个磷脂分子，降低磷脂分子间距，增加磷脂分子间的疏水缔合；乙醇分子主要依靠乙基与磷脂分子的非极性端结合，改变磷脂分子的双亲性，破坏磷脂分子间的疏水缔合。Na⁺和乙醇分子在磷脂分子上的结合位点不同，可能是混合溶液中两者对磷脂水合起叠加作用的原因。本研究结果对生物膜形成、脂质体制备等相关研究及应用具有一定参考价值。除此之外，不同氯化钠浓度时乙醇含量对磷脂水合和脂质体形成的影响以及乙醇羟基的影响还需进一步探讨。

重要声明

利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：蒋丽华负责实验操作、论文写作；王琼负责实验设计、论文修改、基金资助；胡宁负责数据收集、基金资助；杨军负责数据分析、基金资助。

Funding Statement

国家自然科学基金（21827812，81871450）；中央高校基本科研业务费（2020CDJ-LHZZ-031）资助项目

The National Natural Science Foundation of China