支撑脂双层膜的制备及其功能化研究

Abstract

Supported lipid bilayers (SLBs) have been widely used in biomedical and bioengineering research in vitrobecause its structure and function are similar to natural cell membrane. A fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique was used to measure the lateral diffusion of the SLBs composed of 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) and 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-［(N-(5-amino-1-carboxyp-entyl) iminodiacetic acid)］ (DGS-NTA) on the glass slide, and the effects of the DOPC-to-DGS-NTA ratio, small unilamellar vesicles (SUV) producing method, sizes of bleaching areas and concentrations of loading proteins on the SLBs fluidity and diffusion coefficient were studied systematically in this paper. The results demonstrated that: (1) SUV made by probe sonication exhibited more uniform and smaller size compared with that made by film extrusion, but the whole process of SLBs formation must not be exposed to air. (2) The fluorescence recovery rate and diffusion coefficient of the SLBs decreased with the increasing bleaching area size. With the mole ratio of DOPC to DGS-NTA decreasing from 98∶2 to 84∶16, the fluidity and fluorescence recovery degree decreased gradually, and the SLBs would lose its fluidity if the ratio reached to 82∶18. (3) The average fluorescence intensity of SLBs increased linearly with the loading protein concentration (10–40 nmol·L^–1), and the protein showed good mobility on the SLBs. The study would provide a good platform of bio-membrane for further research on interactions among cell membrane molecules and subsequent signals response.

引言

生物膜维持着细胞内各部分结构的有序性，在细胞和外界环境的物质交换及信息传递、蛋白质等大分子的生物合成过程中均发挥着重要作用^[1]。细胞膜本身结构复杂难以分离^[2-3]，而人工构筑的脂双层膜因能控制膜组分以及便于观察和分析，已被广泛应用于研究细胞与细胞接触面分子的相互作用^[4]、T 细胞与抗原呈递细胞之间免疫突触的形成以及血细胞在血管壁的爬行和迁移等^[5-6]。人工生物膜模型主要包括 Langmuir-Blodgett（L-B）单层膜^[7-8]、支撑脂双层膜（supported lipid bilayers，SLBs）^{[3, 9-10]}和囊泡^[11]等。其中，SLBs 制备过程简单、重现性好，制得的膜稳定性好且具有与细胞膜相似的流动性，能够为后续功能化研究提供良好的基础，因此备受学术界青睐^[12-14]。

然而，SLBs 制备过程中仍有很多问题有待解决。首先，脂质体需要采用囊泡融合等预处理以形成小囊泡（small unilamellar vesicles，SUV），再由 SUV 在亲水玻璃板上形成膜，因此 SUV 的大小和均匀度对膜的厚度和均一性至关重要。目前常采用薄膜挤压法^[15-16]、声波破碎法^{[10, 17]}和反复冻融法^[18]对脂质体预处理得到 SUV，其中薄膜挤压法能防止接触空气，超声波破碎法能有效避免交叉污染，因此它们成为 21 世纪重要的人工脂双层膜制备方法^[10]。其次，脂质体成分中大多含有不饱和酰基链，制备过程中与空气接触易发生氧化反应，从而造成颗粒聚集、流动性降低等后果^{[2, 19]}。再者是原材料及配比问题，SLBs 膜稳定性和流动性受到范德华力、水合力以及脂质与基底间的静电相互作用等作用力之间的平衡调控，优质 SLBs 的最佳制备条件很大程度上取决于脂质的组成^[14]。因此，探索成膜最佳和阈值成分配比及解决 SLBs 制备过程中易氧化问题，对于进一步构建具有生物学功能的细胞膜模型无疑是非常重要的。

最后，蛋白的加载方式也非常关键。目前常用生物素-亲和素共价结合及镍脂与多组氨酸重组蛋白螯合的方法将蛋白插入 SLBs，形成有功能的生物膜。然而，前一种方法当亲和素浓度高时易发生聚集从而影响蛋白在膜上的流动^[20]；后一种方法尽管两者的螯合可以有效控制蛋白朝向和所需蛋白浓度，但镍脂的占比以及与多组氨酸重组蛋白的配比不仅会影响膜自身的流动性，也会调控和制约膜上蛋白的运动^{[12, 21]}。这里我们选择了两种在炎症反应及免疫响应过程中的重要蛋白分子——P-选择素（P-selectin）和细胞间黏附分子（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1），前者介导白细胞的初始黏附，后者在白细胞稳定黏附及免疫突触的形成中发挥关键作用^[22]，分别将这两种蛋白以合理方式加载到 SLBs 上形成有生物学功能的膜，并探讨膜承载这两种蛋白的能力及蛋白加载浓度对其自身扩散系数的影响。本研究不仅可为生物膜的构建和深入研究提供有益参考，还可为后续进一步研究免疫细胞在血管内皮的粘附、爬行及细胞接触面的免疫反应等建立良好的实验平台。

1. 材料与方法

1.1. 主要材料

1，2-油-锡-磷脂-3-卵磷脂（1，2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DOPC）与亚氨基二乙酸丁二酰（镍盐）{1，2-dioleoyl-sn-glycero-3-［(N-（5-amino-1-carboxypentyl） iminodiacetic acid)］ succinyl （nickel salt），DGS-NTA}（美国，Avanti Polar Lipids）；Texas Red ^®DHPE 染料、小室（chamber）、ALexa Fluor ^®488 微量蛋白质标记试剂盒与磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer solution，PBS）（美国，Life Technologies）；P-selectin 与 ICAM-1（北京义翘神州生物技术有限公司）；玻璃载玻片（美国，Warner Instruments）；浓硫酸、过氧化氢等试剂（广东省广州市东红化工厂）。

1.2. 玻璃载玻片的预处理

将玻璃载玻片浸入 Piranha 洗液（浓硫酸∶双氧水=7∶3；V∶V）中，在 100 ℃ 下浸泡 45～60 min，超纯水冲洗干净后氮气吹干并放入干燥器中备用。

1.3. SUV和SLBs样品的准备

1.3.1. 脂质体预处理

如图 1 所示，原料 DOPC 和 DGS-NTA 按比例混合于圆底烧瓶内并用氮气迅速吹干成膜，真空干燥 2.5 h 后加入 2 mL 去离子水将其重新水合。加入去离子水后，脂质体自行从瓶底脱落并迅速组装形成各种直径的脂质体，之后采用薄膜挤压法或声波破碎法对其进行预处理得到 SUV。

图 1.

The preparation of SUV and SLBs

SUV 和 SLBs 样品的准备

（1）薄膜挤压法：将上述脂质体置于 55℃ 的无光环境中，使用挤压机（美国，Avanti Polar Lipids）对脂质体来回挤压过滤 10 次得到 SUV，其中滤膜孔径为 0.1 μm；

（2）声波破碎法：将上述脂质体置于 4℃ 冰箱过夜，次日使用声波破碎仪（美国，SONICS & MATERIALS）对脂质体破碎 30～40 s，间隔 10 s，共 10～15 min，直到溶液由浑浊变为澄清得到 SUV；之后将所得样品 20 000× g 离心 12～15 h 收集上清。

1.3.2. SLBs 膜的形成

取 15 μL 上述 SUV 与等体积的 PBS（pH=7.4）充分混合后滴加到培养皿中心处，迅速盖上盖玻片，室温孵育 5 min 后，分别在下面两种环境中形成 SLB。

（1）暴露在空气中：将玻璃片从培养皿中取出置于小室中并拧紧小室，用去离子水充分清洗，去除未结合到玻璃片上的脂质体，清洗干净后缓慢将水全部置换成 PBS；

（2）未暴露在空气中：将培养皿置于去离子水液面下（之后所有操作玻璃片均在液面下），在水中将玻璃片从培养皿中取出并充分清洗，清洗干净后在水下将玻璃片置于小室中并拧紧小室，之后将小室从水中取出并缓慢将水全部置换成 PBS。

1.4. 脂双层膜上蛋白分子的加载

在脂双层膜上加载蛋白分子时，提前采用 ALexa Fluor ^®488 微量蛋白质标记试剂盒对 P-selectin 或 ICAM-1 分子进行荧光标记。采用 1.3 节所述方法制备好脂双层膜后将荧光标记好的重组蛋白（P-selectin 或 ICAM-1）稀释到实验所需浓度（10、20、40 nmol·L^–1）并缓慢滴加到小室中，避光孵育 30 min 后用 PBS 充分清洗未结合到脂双层上的蛋白。

1.5. 荧光漂白恢复（fluorescence recovery after photobleaching，FRAP）实验条件与方法

实验温度为 22～25℃，根据荧光染料设置共聚焦显微镜（德国，莱卡 TCS-SP8）激发光，选择直径为 12 μm^[23]类似嗜中性粒细胞大小样的圆形作为漂白区域，检测激光强度为 10%，漂白激光强度为 100%，孔径值为 2.3，扫描速度为 200 Hz，像素为 256 × 256，物镜为 100 倍油镜。漂白前扫描 5 幅（0.655 s/幅）获取脂双层膜初始荧光强度，恢复过程设置 200～500 幅，以保证漂白区域恢复完全最终达到平衡。

1.6. SUV的粒径、Zeta电位检测

为了比较脂质体预处理方法对 SUV 粒径大小及均匀程度的影响，将上述按 1.3.1 节中两种方法制备的 SUV 用超纯水稀释。采用纳米粒度-Zeta 电位测试仪（英国，Malvern 公司）测量其平均粒径和 Zeta 电位，检测条件为氦-氖激光，波长为 632 nm。

1.7. 相关物理量的定义和测量

（1）脂双层膜初始荧光均匀程度：在每组脂双层膜上选取 9 个直径为 12 μm 的圆作为观察区域，由 9 个取样区域平均荧光强度的标准偏差值体现；（2）脂双层膜漂白区域的荧光恢复率 = 漂白后恢复至稳定时荧光值/漂白前荧光值（扣除背景衰减后），扩散系数 D ≈ 0.25r₀²/t_1/2，其中 r₀ 为漂白区域的半径，t_1/2 为达到最大恢复程度一半所需要的时间^{[5, 24-25]}。

1.8. 统计学方法

每个实验条件均进行三组独立平行实验，数据采用平均值 ± 标准差表示。两组间比较采用 t 检验分析，P < 0.05 为差异具有统计学意义。

2. 结果与分析

2.1. 预处理方法对SUV粒径分布及脂双层膜流动性的影响

首先，我们按 1.6 节中的方法对薄膜挤压法与超声破碎法预处理所得 SUV 的粒径分布进行检测。结果如图 2 所示：薄膜挤压法制备的 SUV 粒径分布较广［（91.82～255.30）nm］，粒径为（132.7 ± 7.12）nm，分散指数（polymer dispersity index，PDI）为 0.237；而声波破碎法制备的 SUV 粒径分布较窄［（37.84～91.28）nm］，粒径为（49.4 ± 3.26）nm，PDI 为 0.207；统计学分析表明后者的脂质体颗粒要明显小于前者（P < 0.01），且颗粒的分散性更好。同时，SUV 电位绝对值的大小反映颗粒物的分散稳定性的强弱，声波破碎法测得的值为（–32.87 ± 3.82）mV，也略高于薄膜挤压法（–30.57 ± 1.41）mV。因此，尽管两种方法制备的 SUV 的粒径及均匀度都不错，但声波破碎法还是优于薄膜挤压法，不仅 SUV 的粒径更小，而且颗粒分散更均匀、更稳定。

图 2.

The particle size distribution of SUV pretreated with thin film extrusion and probe sonication (** P < 0.01)

薄膜挤压法与声波破碎法预处理的SUV粒径分布（** P < 0.01）

之后，我们将上述 2 种均匀分散的脂质体按 1.3.2 节中的方法（空气中制备与水腔中制备）制备 SLBs。在共聚焦显微镜下，通过 FRAP 实验检测所制备脂双层膜的流动性，结果如图 3 所示。实验表明，SLBs 形成过程是否暴露于空气对其荧光恢复率起着决定性的影响（P < 0.01），而脂质体的预处理方法则无影响（ P > 0.05）。从 图 3b 的荧光恢复时间历程中可以看出，脂双层在玻璃平板上的形成过程若暴露于空气导致荧光无法恢复，反映出制备的 SLBs 基本无流动性；与之相反，脂双层膜形成过程若未暴露在空气中，最终荧光均至少可恢复至初始荧光强度的 92.43%。尽管薄膜挤压法与声波破碎法制备的 SLBs 的荧光恢复率无显著差异，但后者的荧光恢复速度要高于前者，经计算得两者扩散系数分别为（0.74 ± 0.09）μm²·s^–1与（1.22 ± 0.13）μm²·s^–1。因此，相比于薄膜挤压法，声波破碎法制备的脂双层具有更加优异的流动性。

图 3.

The fluidity of SLBs prepared with thin film extrusion and probe sonication

薄膜挤压法与声波破碎法制备的SLBs流动性

a. the recovery ratio of SLBs changed with different methods; b. the relative fluorescence intensity of SLBs changed with time. ** P < 0.01

a. SLBs 荧光恢复率随不同方法变化；b. SLBs 相对荧光强度随时间变化。** P < 0.01

基于上述结果，在后续的研究中，我们采用声波破碎法预处理脂质体，并在不接触空气的水环境中制备 SLBs。

2.2. DOPC/DGS-NTA不同配比对SLBs流动性的影响

DOPC 是制备 SLBs 最常用的脂质之一，而原料中 DGS-NTA 占比与最终 SLBs 能承载重组蛋白分子的能力直接相关^{[2, 14]}。因此，探明 DOPC/DGS-NTA 不同配比对 SLBs 流动性的影响对后续 SLBs 的功能化尤其关键。这里，我们以 Taxas Red^® DHPE 染料做指示，按 1.5 节所述的方法在不同配比的 DOPC/DGS-NTA 中加 0.5% Taxas Red^® DHPE，将形成的 SLBs 短时间暴露于高强度脉冲式激光而快速光漂白，漂白区域直径为 12 μm。由于存在浓度梯度且 SLBs 具有流动性，周围未漂白的荧光分子会扩散至漂白区域引起荧光恢复，在 10% 检测激光下，观察记录 SLBs 样品的荧光漂白恢复过程。每个实验条件下均进行 3 次独立平行实验。

当 DOPC/DGS-NTA 的摩尔质量比分别为 98∶2 与 80∶20 时，荧光漂白恢复过程与荧光漂白恢复曲线如图 4 所示，前者基础荧光强度高［（204.72 ± 8.97）nm］、荧光恢复速度快、恢复率高（97%）（图 4a、c），而后者基础荧光强度低［（59.46 ± 5.09）nm］且荧光基本无恢复（图 4b、d）。因此，我们断定在 98∶2 与 80∶20 之间存在一个 DOPC/DGS-NTA 配比的阈值：该阈值前制备的 SLBs 具有较好的流动性，而该阈值后制备的 SLBs 流动性差，已失去作为生物膜模型的可能。为探明该阈值作为将来实验设计的判据，我们对 98∶2～80∶20 范围内不同配比的 SLBs 展开了系列实验，观察分析其对 SLBs 荧光恢复率、t_1/2 和扩散系数的影响，结果如图 5 所示。当 DGS-NTA 在原料中摩尔质量占比由 2% 增加到 16% 时，SLBs 流动性呈缓慢下降趋势，表现为最终荧光恢复率由 97.46% 一直降到 82.25%，t_1/2 由 7.42 s 增加到 22.27 s，扩散系数由 1.22 μm ²·s^–1降到 0.41 μm ²·s^–1；当 DGS-NTA 占比进一步增加到 18%，荧光恢复率、扩散系数急剧下降而 t_1/2 为急剧上升，脂双层膜流动性几乎丧失。对 DGS-NTA 占比为 16% 和 18% 的两组数据进行 t 检验，证实它们之间的荧光恢复率（见图 5d）、t_1/2 和扩散系数的差异有统计学意义（P < 0.01）。由此推断，原料 DOPC/DGS-NTA 配比的阈值在 82∶18 左右，此时制备的 SLBs 不再具有流动性。

图 4.

The fluorescence recovery image and curve of SLBs

SLBs 荧光恢复图与恢复曲线

a. the recovery image of SLBs (98∶2); b. the recovery image of SLBs (80∶20); c. the relative fluorescence intensity of SLBs (98∶2) changed with time; d. the relative fluorescence intensity of SLBs (80∶20) changed with time

a. SLBs（98∶2）荧光恢复图；b. SLBs（80∶20）荧光恢复图；c. SLBs（98∶2）相对荧光强度随时间变化；d. SLBs（80∶20）相对荧光强度随时间变化

图 5.

FRAP on SLBs prepared with different lipid compositions

不同原料配比制备的SLBs FRAP

a. the recovery ratio of SLBs changed with lipid compositions; b. the t_1/2 changed with lipid compositions; c. the diffusion coefficient changed with lipid compositions; d. the recovery ratio of SLBs changed with lipid compositions. ** P < 0.01

a. SLBs 荧光恢复率随原料配比变化；b.t_1/2 随原料配比变化；c. 扩散系数随原料配比变化；d. 荧光恢复率随原料配比变化。**：P < 0.01

综上所述，我们发现：当原料中 DGS-NTA 摩尔质量占比 < 18% 时，占比越小，制备的 SLBs 流动性越好；当 DGS-NTA 占比 ≥ 18%，制备的 SLBs 已失去流动性，因此 DOPC/DGS-NTA 摩尔质量比 82∶18 是制备具有生物学功能 SLBs 的临界比例。然而，加载蛋白和细胞后一般会大大减弱膜的运动能力 ^[10]，综合考量反映膜流动能力的荧光恢复率、t_1/2 和扩散系数等 3 个物理指标，在后续 SLBs 功能化研究中 DGS-NTA 摩尔质量占比均定为 2%。

2.3. 漂白区域大小对SLBs荧光恢复的影响

漂白区域的大小通过调节暗荧光分子与亮荧光分子的相对量和交换速度影响荧光漂白后恢复过程，因此探明漂白区域大小与荧光恢复速度及程度的关系，为后续实验选定合适参数无疑是非常重要的。这里，我们针对直径为 3、6、12、24、48 μm 五个不同大小的圆形区域进行 FRAP 实验，结果如图 6 所示。图 6a 为淬灭后荧光强度随时间的恢复过程，尽管 250 s 后各漂白区域的荧光均可恢复至初始荧光 90% 以上，但恢复速度则呈现明显的规律性差异：随漂白区域直径从 3 μm 增加到 48 μm，荧光恢复速度依次减慢，体现在 t_1/2 随漂白区域直径的增加而单调增加（见图 6b），而扩散系数则呈现相反的趋势（见图 6c）且每两组间差异均具有统计学意义（P < 0.05）。其中，直径为 3 μm 时， t_1/2 与扩散系数分别为 2.838 s 与 3.206 μm ²·s^–1；而直径为 48 μm 时，t_1/2 增至 44.103 s，扩散系数则减小到 0.206 μm ²·s^–1。

图 6.

FRAP on SLBs with different size bleaching areas

不同大小漂白区域FRAP

a. the relative fluorescence intensity of SLBs changed with time; b. t_1/2 changed with the diameter of bleaching area; c. the diffusion coefficient changed with the diameter of bleaching area. *: P < 0.05; **: P < 0.01

a. 相对荧光强度随时间变化；b.t_1/2 随漂白区域直径变化；c. 扩散系数随漂白区域直径变化。*：P < 0.05；**： P < 0.01

一般认为 SLBs 的扩散系数不小于 1 μm ²·s^–1、t_1/2 不大于 10 s 是优良性能 SLBs 模型的合理参数^{[5, 26-27]}。我们的实验结果表明：漂白区域 12 μm 是一个临界值，小于该值的都有较大的扩散系数，而大于该值因扩散系数过小而不宜于实验研究，同时考虑到 12 μm 最接近嗜中性粒细胞的直径，故在后续 SLBs 功能化研究中均选用直径为 12 μm 的圆作为漂白区域。

2.4. SLBs承载不同蛋白分子的能力

尽管我们已经构建了均匀、稳定且流动性好的 SLBs，但只有加载或插入蛋白后才是真正能执行分子输运及信号应答等生物过程的有价值的人工膜，才能在研究中作为细胞膜的替代品。这里，我们采用 2 种在炎症反应和肿瘤转移过程中重要的分子——P-selectin 和 ICAM-1，对 DOPC/DGS-NTA 摩尔质量配比为 98∶2 构成的 SLBs 承载蛋白的能力及蛋白在膜上的运动性能进行检测。

由于在 P-selectin 和 ICAM-1 的近胞质区插入了 10 个组氨酸，通过它们与 DGS-NTA 上镍离子的螯合作用从而将蛋白分子锚定在 SLBs，并且保证了配体识别区域向外的正确朝向。以 10、20、40 nmol·L^–1三个浓度，2 种蛋白各自按 1.4 节中所述的方法加载到已制作好的 SLBs，在共聚焦显微镜下观测 SLBs 的荧光强度，实验结果如图 7a 所示。由于 P-selectin 和 ICAM-1 结合荧光的能力不同，所以同样浓度呈现的荧光强度不同，而荧光强度均随浓度的增加呈现线性提高的趋势，意味着蛋白的位点密度与浓度是线性正相关的，该配比形成的 SLBs 完全有能力承载 10～40 nmol·L^–1浓度范围的 P-selectin 和 ICAM-1。

图 7.

Effects on the functions of SLBs loaded with different concentrations of P-selectin or ICAM-1

加载不同浓度P-选择素或ICAM-1对SLBs功能的影响

a. the average fluorescence intensity of SLBs changed with protein concentration; b. the recovery ratio of SLBs changed with protein concentration; c.t_1/2 changed with protein concentration; d. the diffusion coefficient changed with protein concentration

a. 平均荧光强度随蛋白浓度变化；b.荧光恢复率随蛋白浓度变化；c.t_1/2 随蛋白浓度变化；d. 扩散系数随蛋白浓度变化

接着选定直径为 12 μm 的圆形区域进行 FRAP 实验，测试蛋白分子在膜上的运动性能，其荧光恢复率、t_1/2 和扩散系数随蛋白浓度的变化如图 7b、7c 和 7d 所示。2 种蛋白的荧光恢复率非常接近，均随浓度的增加有轻微下降的趋势，但整体都在 78% 以上。另外，同样浓度下 2 种蛋白的 t_1/2 与扩散系数差异无统计学意义（P > 0.05），但 t_1/2 都随蛋白浓度的增加有延长的趋势，P-selectin 从 17.69 s 增至 28.66 s，ICAM-1 从 15.88 s 增至 25.05 s；而扩散系数则随蛋白浓度的增加而减小，P-selectin 从 0.527 μm ²·s^–1减小到 0.312 μm ²·s^–1，ICAM-1 则从 0.575 μm ²·s^–1减小到 0.374 μm ²·s^–1。已有研究表明，膜上受体因受分子量差异以及是否聚簇及与细胞骨架相连等因素影响，其在细胞膜上的扩散系数数量级一般在 10^–9～10^–11 cm²·s^{–1[4, 28-29]}，因此在我们的实验条件下，加载在 SLBs 上 3 种浓度的 P-selectin 和 ICAM-1 的运动性能良好，可以替代细胞膜进行后续的系列研究。

3. 讨论

SLBs 由脂质小泡在亲水表面自发融合形成，因具有与细胞膜类似的结构及良好的稳定性，30 多年来一直是实验室细胞膜表面模型研究的重要一员^{[1, 5-6]}。因为研究目标不同，各实验室在脂质成分的选择、制备方法及加载蛋白浓度等方面都有很大的差异^{[14, 23, 30]}。

本文以 DOPC 与 DGS-NTA 为原料制备 SLBs，通过纳米粒径-Zeta 电位测试仪和 FRAP 实验技术对构成膜的 SUV 粒径和膜性能进行检测。比较分析了不同预处理方法（薄膜挤压法与声波破碎法）、制备环境（暴露于空气和置于水腔隔绝空气）及 DOPC 与 DGS-NTA 成分配比（98∶2～80∶20）制备的 SLBs 性能差异。相比于以往的研究结果，我们的实验数据首次证明采用声波破碎法处理脂质体获得的小囊泡更细更均匀，为在玻璃底板上形成均匀的 SLBs 提供更好的物质基础。另外，SLBs 的形成均需在不接触空气的水环境中，否则会失去流动性，这或许是由于 DOPC 尾部有双键，在制备过程中易发生氧化^{[2, 15, 21]}。同时，从实验数据推断出 DGS-NTA 与 DOPC 制备 SLBs 的配比阈值为 18∶82，只有原料中 DGS-NTA 占比小于 18% 才能制备出表面均匀且流动性好的 SLBs，此推论受到 Nye 等^[12]实验数据的部分支持，他们采用 Egg phosphatidylcholine（EggPC）与 DGS-NTA 制备 SLBs，发现在 DGS-NTA 占比 ≤ 10% 时制备的 SLBs 均具有良好的流动性。

此外，我们检测了激光漂白区域大小及 P-selectin 与 ICAM-1 蛋白加载浓度对 SLBs 自身流动性、承载蛋白的能力及膜蛋白扩散系数等的影响。实验数据表明我们所构筑的生物膜具有良好的物理性能，承载 10～40 nmol·L^–1的蛋白后扩散系数维持在 0.5 μm²·s^–1左右，与 Liu 等^[31]实验数据（扩散系数为 0～0.5 μm²·s^–1）及 Tanaka 等^[23]实验数据（扩散系数为 0.5～1 μm²·s^–1）较为接近，可用于后续生物学研究。因此，本文不仅为细胞膜分子之间的相互作用及后续信号响应的研究搭建了一个良好的生物膜平台，也为研究细胞膜表面受体与配体的相互作用及细胞接触面上黏附分子的扩散提供了新的思路。

Funding Statement

国家自然科学基金（11672109，11432006，11272125）；中央高校专项基金（华南理工大学D2156960）