透皮芦荟苦素纳米粒的制备及其对酪氨酸酶活性的抑制作用

Abstract

Zinc oxide quantum dots (ZnO QDs) were synthesized by gel-sol method and employed as the transdermal aloesin (Alo) carriers. ZnO QDs were surface-functionalized with amino using aminopropyltriethoxysilane (APTES). Alo was covalently bonded on the surface of ZnO QDs via N,N'-carbonyldiimidazole to obtain Alo NPs, which were characterized by transmission electron microscope (TEM), dynamic light scattering (DLS), Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and thermal gravimetric analyzer (TGA). TEM images showed that ZnO QDs were analogously sphere and monodisperse with a reasonably narrow size distribution, of which was around 4 nm. The size of Alo NPs increased to around 8 nm due to the surface modification. The intense bands at around 3 400 cm^–1 and 1 200 cm^–1 in the FTIR spectrum of Alo NPs from the vibration of -OH indicated the linkage of Alo on the surface of ZnO QDs. The results of TGA analysis showed that the mass ratio of ZnO QDs and Alo were 39.27% and 35.14%, respectively. The penetration of Alo NPs was much higher than raw Alo according to the passive penetration experiments with Franz-type diffusion cells instrument using full-thickness cavy skin, which manifested the improvement of the penetration for Alo delivered by ZnO QDs. The pH-controlled drug release behavior in vitro was investigated. At pH 7.4, only a small amount of Alo (1.45% ± 0.21%) had been released after 2 h. In contrast, as incubation at pH 5.0 of which pH was similar to endosomal environment, Alo was released very fast (87.63% ± 0.46% in 2 h) from Alo NPs, confirming that Alo NPs could response to the pH and realize the intracellular drug release. The inhibitory effect of Alo NPs on tyrosinase was in a dose dependent manner. When the concentration of Alo NPs was 12.5 μg/mL, the inhibition rate was up to 40.32% ± 1.57%. All the results show that the Alo NPs hold a great potential in transdermal tyrosinase inhibition.

引言

黑色素的过度沉积会导致黄褐斑、黑斑等色素性皮肤病，更严重的会诱发黑色素瘤^[1-2]，严重影响着人类的美观和健康。黑色素的生成需经酪氨酸酶两步催化，将 L-酪氨酸催化生成多巴醌，多巴醌经两个非酶促反应途径生成黑色素，可见酪氨酸酶是黑色素形成的关键限速酶。当酪氨酸酶过量表达时会导致黑色素的大量沉积，引发色素紊乱相关疾病。所以，使用高效低毒的酪氨酸酶抑制剂可有效防止黑色素的过度沉积^[3]。近年来，研究报道黄酮及其衍生物、有机酸类、苷类、萜类和酯类等酪氨酸酶抑制剂，均对酪氨酸酶表现出良好的抑制作用^[4-6]。然而，透皮率低这一缺点严重限制了外用酪氨酸酶抑制剂对黑素细胞中酪氨酸酶的抑制作用^[7]，使其在化妆品和临床应用上的功效并不明显。目前，只有极少研究关注酪氨酸酶抑制剂的透皮输送问题^[8-9]。这些研究都是利用经典的穿膜肽聚精氨酸来提高酪氨酸酶抑制剂的透皮效率，虽然透皮性能有所提高，但是聚精氨酸及其衍生物高昂的制备成本和酪氨酸酶抑制剂的无控制性释放，仍然限制着酪氨酸酶抑制剂透皮运输的广泛应用^[10]。

氧化锌（zinc oxide，ZnO）是被美国食品药品监督管理局认证的可安全应用于食品药品的五种金属氧化物之一^[11]。ZnO 来源广泛，价格低廉，且易于合成与修饰，是制备药物递送系统的理想基体材料。此外，研究表明氧化锌量子点（zinc oxide quantum dots，ZnO QDs）作为药物载体可以显著提高透皮率差的药物的透皮性能^[12]，并且当 ZnO QDs 被胞吞入细胞内涵体后，进入 pH 值小于 5.5 介质中可以快速溶解为锌离子，智能释放负载于其上的药物^[13]。因此，本研究拟选用 Zn QDs 共价连接透皮性能差的高效酪氨酸酶抑制剂——芦荟苦素（aloesin，Alo）^[14]，制备一种新型酪氨酸酶抑制剂递送系统，以期实现高效透皮运输酪氨酸酶抑制剂的同时，又能智能控释酪氨酸酶抑制剂，提高药物利用度，进而提高外用酪氨酸酶抑制剂的功效。

1. 材料和方法

1.1. 试剂与仪器

二水乙酸锌、正庚烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷（aminopropyltriethoxysilane，APTES（98% +））、N,N′-羰基二咪唑［N,N′-carbonyldiimidazole，CDI（98% +）］，购自上海泰坦科技股份有限公司；氢氧化钠、无水乙醇、N,N-二甲基甲酰胺购自天津永大化学试剂有限公司；左旋多巴（99%）、曲拉通 X-100（分子生物学级）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Alo 购自加拿大 Toronto Research Chemicals 公司；黑素细胞、黑素细胞专用培养基购自美国 ScienCell 研究实验室。未特别标注试剂均为分析纯。

S90 型动态光散射仪（dynamic light scattering，DLS）购自英国 Malven 公司；Spectrum GX 型傅里叶变换红外光谱仪（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）、Lambda 900 紫外-可见分光光度计购自美国 Perkin Elmer 公司；Tecnai G20 型透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）购自美国 FEI 公司；Q600 型热重分析仪（thermal gravimetric analyzer，TGA）购自美国 TA 仪器公司；TP-6 透皮测试仪购自天津新天光分析仪器技术有限公司。

1.2. 表面氨基化的 ZnO QDs 的合成

将 0.41 g 二水乙酸锌溶解于 10 mL 无水乙醇中，68℃ 下保温搅拌 1.5 h，冰浴中冷却。另将 0.16 g 氢氧化钠投入 5 mL 无水乙醇中配制氢氧化钠的乙醇溶液，逐滴加入到乙酸锌溶液中，继续搅拌混合溶液直至溶液在 365 nm 紫外灯下显示绿色荧光。加入正庚烷沉淀后离心得到 ZnO QDs。将制备好的 ZnO QDs 加入 APTES 的无水乙醇溶液中（V∶V = 0.08 mL∶15 mL），保持反应温度 50℃，搅拌 7 h。反应后，分别用无水乙醇和去离子水洗涤沉淀物三次，并在真空下干燥，得到表面氨基化的 ZnO QDs（NH₂@ZnO）。

1.3. Alo NPs 的合成

0.13 g Alo 和 0.05 g CDI 溶于 2 mL N,N-二甲基甲酰胺中，室温下搅拌 2 h 后，逐滴加入含有 0.38 g 充分分散的氨基化 ZnO QDs 的 N,N-二甲基甲酰胺悬浊液中。室温下搅拌反应 7 h，将产物分别用乙醇和去离子水洗涤三次，真空干燥，得到 Alo NPs。

1.4. 结构与性能表征

TEM：工作电压 200 kV。DLS：将 Zn QDs 和 Alo NPs 分散于纯水中利用 DLS 测量粒径分布。FTIR：采用溴化钾压片法对 Zn QDs、氨基化的 Zn QDs 和 Alo NPs 样品进行 FTIR 测试，波数范围：4 000～400 cm^–1。TG：温度范围 0～800℃。

1.5. Alo NPs 透皮性能测定

利用透皮测试仪测量 Alo NPs 的透皮性能，选择豚鼠腹部皮肤为透皮模型。在 35℃ 条件下，样品室中放置 10 mg/mL 的 Alo NPs，一定时间点（1、2、4、8、16、24 h）收集透过的 Alo NPs，并计算累积渗透量。设置 Alo 和 ZnO QDs 为实验对照组。

1.6. Alo 的体外释放行为考察

将 5.20 mg Alo NPs 分散于 2 mL 不同 pH（5.0，7.4）的 PBS 并密封在透析袋（MW = 3 000）中。将透析袋分别浸入 3 mL 的不同 pH 值的 PBS 中并在 37℃ 下搅拌 72 h。在预定时间点（0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、8.0 h）用紫外分光光度计测量透析液中 Alo 的浓度，以计算其累积释放率。

1.7. 酪氨酸酶活性的抑制

采用多巴氧化法测定酪氨酸酶活性。将黑素细胞以每孔 8 000 个的密度接种到 96 孔板中。12 h 后，分别加入不同量的 Alo NPs 使得最终 ZnO QDs 的当量浓度为 3.75、6.25 和 12.50 μg/mL。继续培养 72 h，用 PBS 洗涤黑素细胞两次，并加入 50 μL 1% 曲拉通 X-100。将黑素细胞置于 –80℃ 冰箱中 30 min，然后在室温下取出放置 0.5 h 直至细胞破裂。裂解的细胞升温至 37℃，加入 50 μL 0.2% 左旋多巴。37℃ 保温 2 h，利用紫外-可见分光光度计测定 475 nm 处的吸光度，计算对酪氨酸酶活性的抑制率。设置相应浓度的 Alo 和 ZnO QDs 为实验对照组。使用未经外加添加物处理的黑素细胞作为空白对照，用式（1）计算酪氨酸酶活性：

1

其中，Ta 是酪氨酸酶活性，A_t 是处理组的吸光度，A_b 是空白对照组的吸光度。所有实验组做六个复孔。

2. 结果与讨论

2.1. Alo NPs 的合成与表征

图 1a 为 Zn QDs 和 Alo NPs 的 TEM 照片，图中可观察到 ZnO QDs 呈类圆形，具有很好的单分散性。但是当 Zn QDs 经过表面改性，共价接枝上 Alo 后，发生了一定程度的团聚，且粒径有所增大。通过 DLS 测定两种纳米粒子的粒径分布，结果显示，原本粒径分布在 4 nm 左右的 ZnO QDs 粒径增加到 8 nm 左右（见图 1b），与 TEM 照片结果吻合。图 1c 是 ZnO QDs、NH₂@ZnO 和 Alo NPs 的红外光谱。相比 ZnO QDs 的光谱，NH₂@ZnO 的光谱在 3 396 和 1 618 cm^–1左右处出现两个吸收峰，分别属于 N-H 的伸缩和弯曲振动峰，说明氨基已经成功接枝在 ZnO QDs 表面。Alo NPs 光谱中出现 2 926 cm^–1处的尖峰是-CH₃ 的振动峰，1 600～1 400 cm^–1之间出现的数个吸收峰为苯环骨架的特征吸收峰，这些特征峰说明 Alo 已成功地与氨基化的 ZnO QDs 结合。以上分析说明 Alo NPs 已成功合成。

图 1.

Characterization of Alo NPs

Alo NPs 的表征

a. TEM images; b. size distribution; c. FTIR; d. TGA

a. TEM 照片；b. 粒径分布；c. 红外图谱；d. 热重曲线

利用 TGA 分析 Alo NPs 中各种成分所占的质量分数，结果如图 1d 所示，在 220～240℃ 和 620～680℃ 两个温度段，Alo NPs 存在明显的失重区间，分别由 APTES 和 Alo 蒸发所致，经过分析可得 ZnO QDs 和 Alo 的质量分数分别为 39.27% 和 35.14%。

2.2. Alo NPs 的透皮性能

以豚鼠腹部皮肤作为透皮模型测试 Alo NPs 的透皮性能。结果如图 2 所示，Alo NPs 在 24 h 后累积渗透量达到了（30.36 ± 1.09）μg/cm²，虽然略低于 ZnO QDs 的累积渗透量，但是同 Alo 仅有（3.97 ± 0.76）μg/cm²的累积渗透量相比，有明显的增加。以上结果说明，将 Alo 连接在 Zn QDs 表面能够显著地提高 Alo 的透皮性能。

图 2.

Skin penetration of Alo NPs

Alo NPs 的透皮性能

皮肤透过率差一直是限制外用酪氨酸酶抑制剂在化妆品或临床应用效果的重要因素^[15]，而许多酪氨酸酶抑制剂的添加量也是有规定限量的，因此，提高酪氨酸酶抑制剂的透皮率成为解决这一矛盾的有效方法。目前，关于提高酪氨酸酶抑制剂透皮率的方法仅限于利用经典的穿膜肽聚精氨酸来帮助酪氨酸酶抑制剂透过皮肤^[8-9]，虽然透皮性能有所提高，但是聚精氨酸及其衍生物高昂的制备成本仍然限制着酪氨酸酶抑制剂透皮运输的广泛应用。此外，利用聚精氨酸及其衍生物透皮递送目标药物需要将两者进行复杂的化学结合，直接降低了可操作性。近些年随着纳米技术的发展，纳米药物递释系统在透皮运输的应用中呈现出极大的优势，具有制备方法简单、成本低、运输递送率高的特点^[16-18]。研究报道 ZnO QDs 可以显著提高药物的透皮性能^[12]，由于其粒径小，可以穿透角质层和毛囊，也可以从角质细胞间穿过^[19-20]。本研究中的结果也显示出 Zn QDs 良好的透皮性能。Alo 分子量较大、熔点高，又具有一定亲水性，自身难以透过皮肤，但负载在 ZnO QDs 表面后，可随之透过皮肤。由于 ZnO QDs 本身不溶于水，但分散性良好，且具有巨大的比表面积，比表面积与皮肤渗透性能成正相关性^[21]，所以当 Alo 负载在其表面后改变了 ZnO QDs 表面性质，使得 Alo NPs 的透皮性能稍低于 ZnO QDs，但是明显高于 Alo。更重要的是，Alo 负载于 ZnO QDs 上，操作步骤简便。因此，Alo NPs 展现出巨大的透皮递送优势。

2.3. Alo NPs 的体外智能释药行为

Alo NPs 在不同 pH 值缓冲液中的药物释放行为如图 3 所示。Alo-NPs 在 pH 为 5.0 的缓冲液中，2 h 即能累积释放 87.63% ± 0.46% 的 Alo，而在 pH 为 7.4 的缓冲液中，2 h 内 Alo 的累积释放率只有 1.45% ± 0.21%。实验结果说明，Alo NPs 的药物释放行为呈 pH 响应型，可以通过环境 pH 值来控制药物的释放行为。

图 3.

Drug release behavior in different pH buffer solution

Alo NPs 在不同 pH 值缓冲液中的药物释放行为

控制性地释放药物以提高药物利用度，是药物递释系统的另一优势^[22]。本研究利用 ZnO 的酸溶解性，控制释放连接在 ZnO QDs 表面的 Alo，当 Alo NPs 置于酸性缓冲液中，ZnO 迅速溶解成 Zn²⁺，与 Alo 的结合被破坏，Alo 迅速释放到环境介质中。而在中性缓冲液中，ZnO 稳定存在并与 Alo 共价结合，Alo 几乎不会脱离 ZnO QDs，显示出 Alo NPs 的稳定性。人体组织液的环境 pH 值为中性，而细胞内涵体内的环境 pH 值在 5.0 左右。因此，Alo NPs 在组织液中是不会释放 Alo 的，只有被内吞入细胞内涵体内，Alo 才会得以释放。Alo NPs 的 pH 控释特性为药物的定点释放和利用度的提高提供了可能。

2.4. Alo NPs 对酪氨酸酶活性的抑制

表 1 是 Alo NPs 对酪氨酸酶活性抑制的实验结果，酪氨酸酶活性随着 Alo NPs 浓度的增加而降低，呈现出浓度依赖型。当 Alo NPs 中 ZnO QDs 的当量浓度为 12.5 μg/mL 时，酪氨酸酶活性抑制率高达 40.32% ± 1.57%。虽然 Alo NPs 与 Alo 相比对酪氨酸酶活性的抑制没有表现出明显的差异，但考虑到 Alo 较差的皮肤渗透性能，Alo NPs 作为外用酪氨酸酶活性抑制剂更具应用价值。

表 1. The inhibitory effect (%) of Alo NPs on tyrosinase.

Alo NPs 对酪氨酸酶活性抑制率（%）

添加物	添加物浓度/（μg·mL–1）
	3.75	6.25	12.50
Alo	14.43 ± 1.88	21.21 ± 2.76	42.76 ± 1.36
ZnO QDs	0.56 ± 0.09	1.06 ± 0.11	1.77 ± 0.07
Alo NPs	10.23 ± 2.72	19.97 ± 1.77	40.32 ± 1.57

本研究选用的抑制浓度是基于课题组前期实验结果中氧化锌微粒对皮肤细胞的安全浓度^[23]，而通过共价连接后，酪氨酸酶抑制剂 Alo 的活性也未受到明显影响。由此，ZnO QDs 可作为透皮运输酪氨酸酶抑制剂的通用载体，来高效地递送自身难以透过皮肤的酪氨酸酶抑制剂，这也将是课题组接下来需要研究的工作。

3. 结论

本研究利用共价键将酪氨酸酶活性抑制剂芦荟苦素连接在氧化锌量子点表面，构建粒径分布在 8 nm 左右的新型酪氨酸酶抑制剂。该抑制剂具有良好的皮肤透过性能，并具有在细胞内控制释放芦荟苦素的特性，对黑素细胞内酪氨酸酶活性表现出较好的抑制效果。因此，本研究制备的新型酪氨酸酶抑制剂作为外用酪氨酸酶活性抑制剂具有潜在的应用价值。

Funding Statement

国家自然科学基金项目（31800839，81860324）；贵州省教育厅青年科技人才成长项目（黔教合KY字[2017]311）；国家级大学生创新创业训练计划（201710665002）；铜仁学院大学科技园入园孵化项目（trxykjy2017002）；贵州省基础研究计划项目（黔科合基础[2016]1152）；铜仁市科技计划项目（铜市科研[2018]19号）