超亲水性医用导管的制备及其动物体内组织相容性研究

Abstract

The biocompatible hydrogel was fabricated under suitable conditions with natural dextran and polyethylene glycol (PEG) as the reaction materials. The oligomer (Dex-AI) was firstly synthesized with dextran and allylisocyanate (AI). This Dex-AI was then reacted with poly (ethyleneglycoldiacrylate) (PEGDA) under the mass ratio of 4∶6 to get hydrogel (DP) with the maximum water absorption of 810%. This hydrogel was grafted onto the surface of medical catheter via diphenyl ketone treatment under ultraviolet (UV) initiator. The surface contact angle became lower from (97 ± 6.1)° to (25 ± 4.2)° after the catheter surface was grafted with hydrogel DP, which suggests that the catheter possesses super hydrophilicity with hydrogel grafting. The in vivo evaluation after they were implanted into ICR rats subcutaneously verified that this catheter had less serious inflammation and possessed better histocompatibility comparing with the untreated medical catheter. Therefore, it could be concluded that hydrogel grafting is a good technology for patients to reduce inflammation due to catheter implantation, esp. for the case of retention in body for a relative long time.

引言

医用导管在临床上应用非常广泛。目前用以制备医用导管类制品的材料主要有硅橡胶、塑料、聚氨酯及其共聚物等。这些高分子材料表面非常疏水，又没有可与组织和细胞亲和的活性成分，患者在使用后往往会引起严重的炎症、疼痛等不良反应，对需要长时间在体内留置导管的患者，其并发症尤为严重。导致这种情况的原因主要是：一方面，现有导管表面亲水性差、摩擦系数大，导管与人体接触时不能形成浸润性表面而产生很大的摩擦；另一方面，导管植入体内后与肌肉、体液、血管等直接接触，会引起人体的排异反应。如果炎症严重的话还会造成导管与组织的粘连，医生不得不在植入后非常短的时间内更换或易位导管，这在增加患者痛苦的同时，也增加了医疗费用。因此，制备具有良好生物相容性的医用导管显得十分迫切。

水凝胶是由亲水性的聚合物链构成具有三维网络结构的多元体系^[1]，分子链上的亲水基团以氢键与水分子相连接，使其具有强大锁水功能的同时本身却不被水所溶解^[2]，大量的水分子可以保留在聚合物三维网络结构中，从而形成水凝胶^[3]。与此同时，人体组织中除了细胞以外，大部分是富含亲水性的蛋白质和多糖类物质，这些物质在正常情况下组成与水凝胶类似的三维网络结构，正因为如此，水凝胶在与人体相关的如药物控释、软组织支架构建等生物医学工程领域中得到了广泛的开发和应用^[4-5]。自 1960 年 Wichterle 和 Lim 等制备出聚甲基丙烯酸-2-羟基乙酯水凝胶以来，有关高分子水凝胶的合成与性能研究十分活跃^[6-10]，比如能够在体内环境被分解的水凝胶、可被体内弱碱性条件下融蚀的水凝胶、能够被酶分解的水凝胶、能以离子交换形式释放蛋白质的水凝胶以及具有“记忆”功能的水凝胶等等^[11-16]。由天然高分子与合成高分子材料共同生成的功能性水凝胶的研究也成为生命科学研究中的热点，比如利用壳聚糖和聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）合成具有良好组织亲和性的功能水凝胶等^[17-19]。也有一些报道将水凝胶化学接枝于生物支架上，以提高支架的亲水性^[20-21]。合成的水凝胶也可通过涂覆的方法用于对医用导管的亲水性改进，但是涂覆方法的牢固性欠佳，容易脱落，造成表面不均匀。故有人运用耦合剂或采用等离子体的方法进行化学键结合，不仅可以增加结合水凝胶层的厚度，也可以提高其附着牢固性^[22-23]。除了上述物理和化学方法以外，表面氧化法也是一种常用的表面改性的方法。研究者通过具有强氧化性的试剂处理，使材料表面发生化学反应而生成亲水基团，以此提高材料的表面亲水性^[24-25]。这种方法的缺点是系统中引入了强氧化剂，有可能因其残留而对医用材料的使用安全性造成危害。Iwata 等^[26]曾将丙烯酸、丙烯酰胺边聚合边接枝在聚偏二氟乙烯材料上以改善其亲水性。这类接枝反应大都运用合成类的高分子，如聚乙烯基吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）和聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA），通过物理涂覆或者化学键结合的方法改进导管的亲水性或润滑性^[27-28]。

本研究以天然高分子材料葡聚糖（Dextran，Dex）为主要原料，在氮气保护下，与烯丙基异氰酸酯（allyl isocyanate，AI）反应，首先合成预聚物（Dex-AI）；进一步将预聚物与聚乙二醇二丙烯酸酯（polyethylene glycol diacrylate，PEGDA）在紫外光（365 nm）照射下共聚反应，制备了高分子水凝胶 DP。将此水凝胶采用化学方法接枝于临床上广泛使用的医用导管表面，检测导管的表面亲水性。然后在 ICR 小鼠体内植入水凝胶接枝后的导管，并与未改性的导管进行比较，评估导管的组织亲和性，以期探讨本文所提出的改性技术是否具有良好的应用前景。

1. 材料和方法

1.1. 主要试剂和仪器

葡聚糖（Dex，MW 40 000）购自国药集团化学试剂有限公司；PEGDA（PEG 平均分子量 500）、异丙醇、二甲亚砜（DMSO）、环己烷、二苯甲酮、二月桂酸二丁基锡（DBTDL）等均购自阿拉丁试剂上海有限公司；AI 购自阿法埃莎天津化学有限公司；紫外光引发剂艳佳固（Irgacure 2959）购自东京化工业株式会社。上述试剂都为分析纯。实验中所用的医用 PE 导管由宁波大学医学院附属医院提供（灵洋医疗器械，浙江省临海市）。

水接触角测量仪（OCA 20 型，美国科诺工业有限公司）；台式冷冻离心机（Centrifuge 5804R，Eppendorf AG，德国）；电热恒温干燥箱（DHG-9023A 型，上海精宏实验设备有限公司）；数显恒温水浴锅（HH-2 型，常州国华电器有限公司）；集热式恒温加热磁力搅拌机（DF-101S 型，河南省予华仪器有限公司）；真空干燥箱（DZF-6050 型，上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；紫外仪（WD-9403B 型，北京市六一仪器厂）；表面张力接触角仪（DIGIDROP，GBX，法国）；全自动血细胞分析仪（BM830，北京宝灵曼阳光科技有限公司）；显微镜（CX40，Olympus，日本）。

1.2. 水凝胶 DP 的制备

Dex-AI 预聚物的合成：称取干燥的葡聚糖（Dex）0.75 g，加入四口烧瓶，加 20 mL 无水 DMSO 使其溶解，在 N₂ 保护下，逐滴加入 AI 410 μL，30℃ 下反应 5 h。冷却至室温，在此溶液中加入过量冷的异丙醇，产生白色乳状沉淀，用冷冻离心机 10 000 r/min 离心 5～6 min，将所得沉淀重复离心一次，在真空干燥箱中室温干燥 1 d，即得 Dex-AI 预聚物。

水凝胶的合成：称取上述干燥 Dex-AI 预聚物 0.58 g，加 PEGDA 795 μL，并加去离子水 15 mL（内含紫外光引发剂艳佳固 Irgacure 2959，0.5%），将上述混合溶液移入培养皿中，在紫外光（365 nm）下照射 1～3 h，得到水凝胶 DP。其合成路线见图 1。

图 1.

The chart of the hydrogel (DP) synthesis

DP 水凝胶的合成路线图

1.3. 超亲水医用导管的制备

称取 0.3 g 二苯甲酮，室温下溶于 15 mL 环己烷中。将医用导管浸没于其中，紫外光（365 nm）照射 40 min，取出导管，去离子水冲洗，真空干燥，备用，这样处理的导管记为 A0。

将此导管置入由 Dex-AI、PEGDA、去离子水（内含紫外光引发剂艳佳固 2959 0.5%）组成的溶液体系中，365 nm 的紫外光下处理 1～3 h，取出导管，用去离子水冲洗三次，于真空干燥箱中室温干燥 24 h，即得到超亲水医用导管，记为 B0。为了检测只经二苯甲酮和紫外光处理后导管表面的变化情况，以区别于接枝水凝胶后导管的性能，在后面的检测中均设立三组导管样本，即未处理导管 a0、二苯甲酮处理导管 A0 以及二苯甲酮处理和 DP 接枝导管 B0。

1.4. 吸水率

将上述制备的干燥后的超亲水导管 B0，称重记为 M0，将其置入去离子水中，分别在 1、4、9、24 h 后，取出沥去多余水，分别称重记为 Mx，按下式计算吸水率：

1

1.5. 表面接触角

将处理后的导管从中间剖开，以双面胶使其平置于载玻片上，对其表面进行两项接触角测试：静态表面接触角和动态表面接触角。静态接触角在表面张力接触角仪系统中于室温下进行测试，每个样品随机检测 3 个位置，用水量 1.0 μL，3 点平均所得即为接触角值。动态接触角在 Data physics OCA20 系统中于室温下进行测试，每个样品随机检测 3 个位置，去离子水用水量 1.0 μL，记录每秒钟水滴在样品上的接触角值。最终值以均值 ± 标准差所示。接触角的大小可以反映导管表面对水的亲和情况，接触角愈小，亲水性愈好。

1.6. 动物体内组织相容性检测

小鼠（ICR，5～8 周龄，雄性，体重 18～30 g）15 只，根据控制变量法的原理，保证实验的可行性和实验结果的科学性，将小鼠分为三组：空白组导管 a0，对照组导管 A0，实验组导管 B0，每组各 5 只。将小鼠麻醉（腹腔注射 3% 戊巴比妥钠的氯化钠溶液，0.10～0.20 mL）后，将其后背皮去毛，将 3 组医用导管样品（长度 1 cm）分别植入各组小鼠的后背皮下，1 只小鼠背部一侧植入一个样品，碘酒消毒后缝合皮肤，正常喂养。一定时间后将小鼠处死，切取导管样品及周围皮肤组织，对所取样本进行固定包埋，行冷冻切片、苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色、显微镜拍照，以观察导管周围组织的情况，并与正常组织相比较。

同时，对植入导管样品后小鼠的血液中白细胞（white blood cell，WBC）的变化情况进行检测，以了解样品植入体内后的急性炎症反应情况。然后，分别在不同时间从小鼠尾静脉处抽取血液，立即在全自动血细胞分析仪上进行血液常规检测，得到白细胞总数。小鼠植入导管前测得的数值作为第 1 天的基础值（Day1），不同时间点所测的白细胞数值与此基础值相比较，以时间为变量作曲线，目的是观察水凝胶接枝和未接枝的导管样品在小鼠体内造成的炎症情况，以检测导管在小鼠体内的组织相容性。

实验动物由宁波大学医学院实验动物中心提供，实验也在此进行。所有动物实验操作符合宁波大学伦理委员会和国家实验动物规章的相关规定。

1.7. 统计学分析

在研究过程中，所有数据资料采用 SPSS 统计学软件行 t 检验，P < 0.05 为差异具有统计学意义。

2. 结果与讨论

2.1. DP 水凝胶的亲水性能

为确保成功改性医用导管，我们首先对用于改性的水凝胶的制备及亲水性能进行了探索。图 2 汇总了不同单体比例及不同吸水时间时所得水凝胶的吸水能力。

图 2.

The water absorption of DP hydrogels made from various monomer ratios as a function of time

不同配比的聚合物 DP 在不同吸水时间下的吸水率

力学性能与溶胀性有一个很好的平衡关系，适合的交联密度对最终获得的水凝胶拥有良好的力学和溶胀性能具有十分关键的作用^[29-30]。在 DP 水凝胶的合成过程中，随着交联密度的增加，凝胶的力学强度随之增加，而凝胶溶胀性能随之下降，分子链的活动性下降，凝胶的弹性也下降。图 2 是在 Dex-AI∶PEGDA 不同配比而其他条件都相同时，所制得 DP 水凝胶在纯水中随时间变化的吸水率，三种配比所获得的 DP 在水中 1 h 时已有较高的吸水率，说明吸水速率很快，在 9 h 时基本达到最大值，而后直到 24 h 时吸水率变化不大，三种配比的水凝胶具有相似的变化趋势。在三种配比的亲水性能测试中，Dex-AI∶PEGDA 比值为 4∶6（质量比）的 DP 在所有实验时间点内吸水率都是最大的，与其他两种配比（5∶5 和 6∶4）相比差异具有统计学意义（P < 0.05），在水中 9 h 时吸水率达到 810%，具有相对更好的吸水速率和吸水率。因此，在下面的实验中选择以 4∶6 单体配比合成的水凝胶作为医用导管表面接枝的最佳水凝胶材料。

2.2. 导管表面接触角

对医用导管进行表面水接触角测试，以检测其对水的亲和性，结果如图 3 所示。在静态接触角测试中，未经处理的医用导管（a0）其水接触角在（97 ± 6.1）°，表面非常疏水，对于动物体的水环境是不亲和的。导管经二苯甲酮处理（A0）后，理论上在表面产生了自由基，经静态水接触角测试也证实表面的亲水性有所提高，从（97 ± 6.1）° 降到了（87 ± 3.1）°，但其亲水性能仍未能达到长时间留置体内的要求。经 DP 水凝胶接枝后，导管（B0）的亲水性得到显著提高，水接触角为（25 ± 4.2）°，与前两组比较差异具有统计学意义。于是对 B0 导管作了动态接触角测试，结果发现在 15 s 的时间内，接触角即从最初的 33° 达到最小值（11°），而后达到平衡。证明水凝胶的引入显著提高了导管的水亲和性，如果用于动物体内也有望使导管与动物体的组织相容性得到显著提高。

图 3.

The contact angle of catheter surface of three kinds of medical catheter

三组医用导管的表面接触角

a. the static contact angle; b the dynamic contact angle of B0 catheter

a. 静态表面接触角；b. B0 导管随时间变化的动态表面接触角

2.3. 改性前后的导管在动物体内的组织相容性

为了检测改性前后导管在动物体内的组织相容性情况，以 ICR 小鼠为实验动物，将导管样本植入小鼠背部皮下，经一定时间后，首先对小鼠的白细胞变化情况进行了检测，结果如图 4 所示。

图 4.

The WBC ratio of rats after catheter implantation

植入导管后小鼠的白细胞随时间的变化情况

白细胞水平与动物体内急性炎症反应的严重性成正相关。实验中发现三种导管样本均引起小鼠的急性炎症反应，而且几乎都在植入 10 天左右达到白细胞最高水平，而后随着时间逐渐下降，在 30 天左右回复或接近回复到动物体基础值。三种导管样本之间比较，未经处理的导管其小鼠的白细胞水平最高（图 4，a0），二苯甲酮处理的次之（图 4，A0），经水凝胶接枝的导管组（图 4，B0）小鼠的白细胞水平始终低于 a0 组和 A0 组，说明植入 B0 的动物体内急性炎性反应程度最轻。

导管植入后分别在第 5、15 和 30 天，对导管及周围组织的情况进行了检测，包括大体观察和 HE 染色。图 5 是三个导管样本 a0、A0 和 B0 在小鼠皮下的大体观察图。从图中可见 a0 组在这 3 个时间点导管周围存在严重的炎症、充血等不良反应，导管周围明显增生了许多小血管丛，尤其在第 5 天（a0-5d）时被一圈深红色炎症介质包绕，布满密密麻麻的毛细血管网；导管 A0 在第 5、15 天时情况与 a0 相近，但在第 30 天时充血情况相对于 a0-30d 稍轻。相较之下，B0 组的导管周围炎症浸润及血管增生现象较少，植入第 5 天时可见充血现象，但到第 30 天时（B0-30d）导管周边组织已恢复正常，无明显充血和炎症现象。

图 5.

The overview of the medical catheter after implanted subcutaneously into rats

导管植入小鼠皮下后样本的大体观察图

为了更清晰地了解导管周边的组织情况，对上述组织样本进行冷冻切片及 HE 染色，结果如图 6 所示。图中 a0 样本在三个时间点都存在局部炎症介质的浸润，即使到了第 30 天（a0-30d）还是有满视野的炎性细胞。A0 的炎性情况比 a0 稍轻，相对来说，30 天的时候减少更明显。而在 B0 组样本，第 5 天的时候可见较多炎性细胞，但在第 15 天和第 30 天（B0-15d、B0-30d）时导管周边组织层次清晰，无明显炎症细胞。这些结果充分说明了现有临床用导管在植入动物体内时易被机体当作异物，引起周边组织的炎症反应，而经水凝胶改性后提高了导管的亲水性，炎症反应也明显减轻。我们制备水凝胶所用的主要原料是天然多糖物质和具有良好性能的 PEG，安全无副作用。通过接触角检测和动物体内实验，能更直观地显示改性后材料的亲水性和组织相容性的变化情况。更深入的研究仍在进行中，改性方法也在继续完善和改进，使其更加简易和标准化，以适应将来规模生产。

图 6.

HE staining for the samples same as those in Fig. 5

HE 染色图（组织样本与图 5 一致）

3. 结论

利用天然高分子与 PEG 反应成功制备了具有较高吸水率的水凝胶，并探索了不同条件对所制得水凝胶吸水率的影响，在葡聚糖和 PEG 比例为 4∶6 时得到水凝胶具有最大吸水率，达 810%。将此水凝胶接枝于临床上的医用导管，能显著提高其亲水性，表现为其表面水接触角由原来的 97° 下降至 25°。亲水性的提高使其对小鼠的组织相容性明显提高，表现为导管植入后的白细胞水平明显比未处理的导管组低，同时在较短时间内恢复到其基础水平。大体观察和组织学观察（HE 染色）均反映了，经水凝胶接枝后的导管的组织相容性明显优于未经水凝胶处理的现用导管。另外，在本文中所用导管由附属医院提供，是众多临床使用的医用导管中的一种。由于本文所提出的水凝胶接枝技术并不受基体材料所限，此技术也同样适用于其他材质和其他种类的医用导管。因此，我们相信并希望能将此技术经进一步完善后推广于临床上所有导管的改性，这对于需较长时间置留于体内的医用导管将是十分必要的，能减轻患者痛苦，减少二次治疗，降低治疗负担。

由于本文所制水凝胶其原料安全无毒，制作过程简便可行且不受接枝对象形状所限，相信此改性技术将会具有很好的应用前景。

Funding Statement

国家自然科学基金（81471797）；宁波市科技创新团队项目（2015B11050）