新型可降解聚合物血管支架的体内血栓形成评价

Abstract

New biodegradable intravascular stent can reduce risk of foreign bodies retained, thus, it is widely concerned and some of the products have been introduced into the clinic. However, the characteristic of biodegradable may lead to more safety concerns associated with thrombosis. To ensure the safety, the thrombus formation experiment in vivo needs to be carefully designed and evaluated based on GB/T 16886.4 standard, but current standard do not provide explicit testing and evaluating methods. Establishing animal model with experimental pigs, the study compares biodegradable coronary stents and metal stents by simulating clinical implantation in vivo on the thrombus formation in the implanting process, and after the short-term and long-term implantation. The evaluation methods include gross observation, digital subtraction angiography intraoperative analysis, optical coherence tomography analysis, scanning electron microscopy and so on. The results show that combining these methods could comprehensively evaluate the whole process of the thrombus formation from the beginning of implantation to the end of preclinical animal experiments, so that, it may better predict the clinical thrombosis risk, and the selection of the control was very important. The study tries to use the comparison examples of thrombosis on the new medical instrument to provide the clue for thrombosis evaluation in vivo on similar instruments and show the methodology on the preclinical evaluation.

引言

以心脑血管狭窄性病变为代表的各类心血管系统疾病严重威胁着中老年人的健康，越来越体现出高患病率、高致残率和高死亡率的特点，目前仍居全世界各种死因之首^[1]。针对这些疾病，球囊扩张与支架植入是较为有效的治疗方式，相应介入手术已广泛开展^[2]，而对应的支架也已成为常用的医疗器械之一^[3]。但是，传统的非可降解支架有一些不足之处。除了体内异物长期留置的担忧外，自身理化性质的稳定性、有序的内皮化过程以及血栓风险的控制等尚有待提升^[4]。有鉴于此，对各种新型可降解支架的研究迅猛推进，无论是金属还是聚合物可降解支架，其中佼佼者已经进入了临床^[5-6]。

血管支架是典型的长期使用植入器械，用于血管内并直接接触循环血液，因此，在生物学评价中必须考虑血液相容性^[7]。GB/T 16886.4 标准为医疗器械与血液相互作用实验选择提供了原则，此类器械应考虑针对血液学以及血栓形成的相应评价项目^[8-9]。而长期留置病变血管内的支架，一旦形成血栓可能造成严重后果^[10-11]。体内血栓形成实验可在更接近临床的条件下分析与预测血栓的形成过程与程度，从而有助于对这些器械进行更全面的风险分析与控制^[12]。但是，现行标准中，无论是 GB/T 16886.4 还是 ISO 10993-4 标准均未为体内血栓形成实验提供具体的实施方案^[13-14]。

为解决类似器械血栓形成实验具体方案的设计问题，助推新型支架产品的质量控制、评价及合规上市，本研究中对金属和可降解聚合物支架体内血栓形成实验方案的具体操作及评价指标进行了全面的对比研究，不仅涉及输送与局部定位释放、体内留置过程的无创分析、实验动物的一般状况，以及取材时血栓形成的大体观察，还包括对输送系统与支架在尽量模拟的临床条件下表面血栓形成的分析与比较^{[5, 9]}。在此过程中，重点关注新型可降解支架与传统金属支架在实验及评价上的可操作性上的差异，以期为解决现行标准缺乏具体方案的问题提供解决思路。本研究的结果，不仅提供了对血管支架系统进行体内血栓评价的实例，更期望能有助于可降解支架系统的设计与研发^[15]，最终推进优秀产品上市，解决临床的切实需要。

1. 材料与设备

1.1. 材料

全降解聚合物雷帕霉素洗脱支架系统（聚合物支架），由聚合物输送系统及聚合物可降解支架构成（见图 1a）；冠脉雷帕霉素洗脱钴基合金支架系统（金属支架），由聚合物输送系统及金属支架构成（见图 1d）。各样品规格均根据本实验的需要进行选择，同只动物的金属支架及可降解聚合物支架规格相同。

图 1.

The gross observation for the polymer and metal stents on the responding delivery system and the implantation of the stents by DSAa. polymer stent; b. the width measurement of the coronary artery for the polymer stent; c. the implantation for the polymer stent; d. mental stent; e. the width measurement of the coronary artery for the mental stent; f. the implantation for the mental stent

聚合物支架与金属支架大体观察及 DSA 下的支架植入

a. 聚合物支架；b. 聚合物支架植入冠脉宽度测量；c. 聚合物支架植入；d. 金属支架；e. 金属支架冠脉宽度测量；f. 金属支架植入

1.2. 仪器与设备

研究中所用到的仪器与设备如下：呼吸麻醉机（anesthetic gas machine，德国，Dräger 公司，Narkomed）；数字血管造影系统（digital subtraction angiography，DSA，美国，General Electric Company，Innova 2100IQ）；光学相干断层扫描成像系统（optical coherence tomography，OCT，美国，Light lab^TM公司，C7）；扫描电镜（scanning electron microscope，SEM，日本，Hitachi Limited，S-4800）；光学相干断层成像导管（c7 dragonfly imaging catheter，上海，圣犹达，13751-02）。

2. 方法及操作

2.1. 植入手术操作

共使用 9 只健康实验猪，体重范围 36.5～44.0 kg。术前动物肌肉注射氯胺酮（15 mg/kg）诱导麻醉，约 10 min 后将动物移入准备间用面罩使其吸入异氟烷（鲁南贝特）和氧气混合气体，达到麻醉效果后插入气管插管建立呼吸通路，随后吸入异氟烷和氧气混合气体维持麻醉。手术由具有丰富冠脉支架介入手术经验的临床专家进行。麻醉好的实验动物双侧股动脉局部剃毛，常规术前消毒，铺手术铺巾，分别从左右股动脉将聚合物支架系统与金属支架系统进行穿刺植入。将支架输送至心脏冠状动脉内选取前降支、回旋支或右冠状动脉适宜宽度处（DSA 造影测量）卸载释放留置。支架释放后，慢慢退出输送系统。

2.2. 术中血栓观察

术中支架释放后，行 OCT 观察血管内血栓形成情况。取退出血管的相应输送器头段长约 15 cm，生理盐水浸洗以去除表面液态血液，行表面血栓大体观察。以 4% 甲醛固定液，对两种支架系统的输送器头段分别进行固定，冷冻干燥，喷金，行 SEM 观察。

2.3. 植入后血栓形成观察

9 只动物被随机分为 3 组，分别于植入术后 1、3 及 6 个月后以过量麻醉剂安乐死，行血栓观察。安乐死前，各只动物行 DSA 及 OCT 观察以评价在体状况下血管内血栓情况。安乐死后即刻进行心、肝、脾、肺、肾等远端器官的血栓观察。以 4% 甲醛固定液行心脏灌注，结扎各主要大血管。固定 72 h 后取材，将支架连同相应动脉血管（支架头端至少延伸 1 cm）小心地取出，沿长轴小心地剖开后行大体观察。剖开后的支架连同血管段固定，经冷冻干燥后，行 SEM 观察。

3. 结果

3.1. 支架植入手术及术中血栓观察

选取实验动物前降支、回旋支或右冠状动脉适宜宽度处，于 DSA 造影下经股动脉植入聚合物支架及金属支架（见图 1）。本研究中，各支架定位良好，未见有滑脱、血管撕裂、阻塞等异常。

支架输送到位释放后，经股动脉行植入血管的 OCT 观察（见图 2a、b、f、g），可见无论是聚合物支架还是金属支架其植入血管管壁光滑，除支架结构及金属支架相应伪影外，未见其他异常影像，未见任何赘生物及新生血栓迹象。输送器从血管中退出后大体观察，两种支架的输送系统表面均未见明显血栓形成（图 2c、h）。固定干燥后行扫描电镜可见球囊导管表面均有数微米至几十微米大小的血栓分布，均主要由细胞及纤维蛋白成分构成，二者未见明显差异（图 2d、e、i、j）。

图 2.

The in vivo thrombosis formation in the implantation operations of the stents　

支架植入手术时的体内血栓形成观察

a. the OCT observation of the inner cavity of the polymer stent implanted artery; b. the OCT observation for the corresponding artery; c. the withdraw of the delivery system after the release of the polymer stent from the artery; d. the SEM observation (× 100) of the polymer stent delivery system; e. SEM observation (× 1 000) of the polymer stent delivery system; f. the OCT observation of the inner cavity of the metal stent implanted artery; g. the OCT observation for the corresponding artery of metal stent; h. the withdraw of the delivery system after the release of the mental stent from the artery; i. the SEM observation (× 100) of the mental stent delivery system; j. SEM observation (× 1 000) of the polymer stent delivery system

a. OCT 观察植入血管内腔的聚合物支架；b. OCT 观察聚合物支架植入侧无支架位置的血管内腔；c. 聚合物支架输送系统到位释放支架后从血路中退出；d. 聚合物支架输送系统 SEM 低倍（× 100）观察；e. 聚合物支架输送系统 SEM 高倍（× 1 000）观察；f. OCT 观察植入血管内腔的金属支架；g. OCT 观察金属支架植入侧无支架位置的血管内腔；h. 金属支架输送系统在到位释放支架后从血路中退出；i. 金属支架输送系统 SEM 低倍（× 100）观察；j. 金属支架输送系统 SEM 高倍（× 1 000）观察

3.2. 术后血栓形成

行 OCT 观察支架植入部位血栓形成情况可见，术后 1 个月聚合物及金属支架表面均已被内皮覆盖，至 6 个月的植入期，血管内壁均光滑，术后 1、3、6 个月，聚合物及金属支架植入血管内腔表面均无明显血栓形成。至植入 6 个月后，支架表面内皮化已完成，除支架所致伪影外，未见任何新生物及其他异常（见图 3）。植入 6 个月后对试验动物的心、肝、脾、肺、肾剖检可见，各脏器均未见明显远端血栓，脏器颜色正常，无萎缩、坏死、异常增生及其他病变现象。对取出的带支架局部血管内壁行 SEM 观察，低倍镜下可见聚合物及金属支架表面均有散布的数微米至几十微米大小的血栓，两种支架之间小血栓的分布与数量未见明显差异。高倍镜下则可见聚合物及金属支架 1、3 个月时血栓主要由纤维蛋白及细胞成分构成，而至 6 个月植入期，聚合物支架血管内壁基本无明显血栓可见，而金属支架血管内壁也仅见少量以细胞为主的微血栓（见图 4）。

图 3.

OCT observation for the implanted stents

支架植入后局部血管 OCT 观察

图 4.

SEM observation for the inner surface of the vessels with the stents implanted

支架植入局部血管管腔 SEM 观察

4. 讨论

血管内支架器械多植于心、脑等关系到生命维持的重要器官、重要血管内且长期留置，表面血栓形成不仅影响其基本功能，更有导致严重不良反应的可能性^[16-17]。因此，血栓评价是其关键的评价指标之一。尤其是针对新型可降解支架，其结果将有助于分析比较已上市支架的风险收益，从而决定其能否上市^{[5, 11]}。因此，本研究中对可降解聚合物支架和金属支架的体内血栓形成进行了对比，以期对相应的方案设计、实施及结果分析提供实例性的参考。

支架植入过程中的血栓风险是评价中的第一个关键点。实际上，血栓形成过程从建立动脉通道时就可能开始^[16]。在整个手术过程中，输送系统的进入与撤出、支架的定位、系统的材质，以及与操作便利性相关的血管损伤等，均可能与血栓形成相关^[17]。对于几十微米以下的微血栓而言，可能仅是器械直接接触血液后的一种表面反应。但是，如果血栓尺寸达到上百微米以上，结构牢固、量较多并出现脱落时，将有较大的严重不良反应的风险^[18]。因此，本研究同时考虑了输送系统及支架的术中血栓分析。对于输送系统，通过 DSA 的观察、撤出后的表面大体观察以及固定后的 SEM 观察来评价血栓形成情况。而对于支架，DSA 可给出植入后的大体状况参考，OCT 则给出局部位置血栓状况的图像证据。

支架留置于血管内后，其血栓形成则与表面性质、内皮化过程及可能的载药释放关系密切^[4]。一旦表面生物质化，如内皮已完全覆盖，血栓形成风险将大大降低。但是，可降解支架的降解行为，可能改变其理化性质及组织反应过程，从而带来血栓形成风险的变化^{[5, 9]}。因此，体内留置一段时间后血栓形成状况的变化也需进行相应的考察。理论上，最佳的考察周期是包括降解全过程的多个时间点的观察。但限于体内降解过程的复杂性、个体因素、不同部位血流动力学条件差异等，很难在方案设计时即明确完全降解所需时间^{[2, 19]}。本研究中，设定术后 1、3、6 个月作为考察时间点是基于以下考虑：首先，此为生物材料植入后局部反应评价常用的时点（GB/T 16886.6 及 ISO 10993-6）；其次，这也是临床前动物实验通常会考虑的时点。本研究中，OCT 以接近无创的方式对长期留置后支架局部的血栓情况进行了观察，SEM 观察的结果则给出了支架表面生物质化的状况与表面血栓的大小、分布及组成等信息，而动物安乐死之后的重要脏器远端血栓形成迹象观察，进一步帮助判断了支架植入后的长期风险。

现有标准体系中并未对体内血栓形成实验中血栓形成过程、程度、影响的可接受限给出规定。虽然结合实验评价与器械设计研究数据、文献报道及临床研究有助于分析其可能的患者风险收益，但作为上市前评价，采取与已上市产品进行比较分析的方式较为可行。这也是新型拟上市器械在缺乏标准判定指标时常用的方法^[20]。本研究结果显示：与传统金属支架相比，可降解聚合物支架系统在植入至术后 6 个月的周期中，并未表现出更高的血栓形成风险。这说明至少在体内血栓形成方面，此可降解聚合物支架具有非劣于已上市产品的性能。而本研究中针对支架的体内血栓形成实验方案，适宜于对此类器械的评价。

5. 结论

以已上市产品作为参考的，综合考虑输送系统与支架本身以及考察手术即时与一定时间后血栓情况的体内实验，可用于可降解血管内支架的体内血栓形成评价。它可作为 GB/T 16886.4 标准中类似器械血液相容性评价具体实验方案的补充，从而有助于客观评估此类器械的患者风险收益，助推上市应用。

致谢：本研究承蒙四川兴泰普乐医疗科技有限公司提供相应研究样品，汇智赢华医疗科技研发（上海）有限公司提供相应动物实验条件，特此感谢。

Funding Statement

国家自然科学基金（81371685）；国家重点研发计划（2016YFC1103205）